Name: basophil activation test for allergy diagnosis
Uploaded: 2021-05-31T14:00:00
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Ringraziamo Claudia Corazza per il suo prezioso supporto in lingua inglese. Questo lavoro è stato sostenuto dall'Istituto di Sanità ''Carlos III'' (ISCIII) del MINECO (sovvenzione cofinanziata dal FESR: "Una manera de hacer Europa"; Sovvenzioni n. PI20/01715; PI18/00095; PI17/01410; PI17/01318; PI17/01237 e RETIC ARADYAL RD16/0006/0001; Ministero regionale andaluso della sanità (concessione n. PI-0127-2020, PIO-0176-2018; PE-0172-2018; PE-0039-2018; PC-0098-2017; PI-0075-2017; PI-0241-2016). ID è uno sperimentatore clinico (B-0001-2017) e AA detiene un contratto post-dottorato senior (RH-0099-2020), entrambi supportati dal Ministero della Salute regionale andaluso (cofinanziato da ESF: "Andalucía se mueve con Europa").

L'esecuzione del protocollo è stata condotta secondo i principi della Dichiarazione di Helsinki e approvata dal Comitato Etico locale (Comité de Ética para la Investigación Provincial de Málaga, Spagna). Tutti i soggetti sono stati informati oralmente dello studio di ricerca e hanno firmato il corrispondente modulo di consenso informato.
NOTA: Il presente protocollo descrive in dettaglio la procedura BAT che gli autori utilizzano quotidianamente. Tuttavia, questo non è un metodo...

La BAT è un test diagnostico complementare in vitro per la valutazione delle reazioni allergiche IgE-mediate che si è dimostrato utile nella diagnosi di reazioni indotte da diversi fattori scatenanti come farmaci, alimenti o inalanti, nonché in alcune forme di orticaria cronica. In generale, le prestazioni delle BAT devono essere considerate se i) l'allergene/farmaco produce risultati falsi positivi nella ST; ii) l'allergene/farmaco non è disponibile per essere utilizzato per la quantificazione ST o sIgE; ii...

La diagnosi allergica IgE-mediata si basa sull'anamnesi, sui test cutanei (ST), sulla quantificazione delle IgE sierospecifiche (sIgE) e, se richiesto e indicato, sui challenge test controllati (CCT)1,2,3,4,5,6. Tuttavia, l'anamnesi clinica può essere inaffidabile poiché potrebbe esserci una mancanza di informazioni accurate e ST e CCT non sono procedure prive di rischio che possono essere controindicate nei soggetti che manifestano gravi reazioni potenzialmente letali 1,2,3,4,5,6 . Questi problemi, insieme al fatto che la determinazione delle sIgE mediante saggi immunoenzimatici fluoroenzimatici validati e commerciali è disponibile solo per pochi allergeni e farmaci, hanno evidenziato l'importante ruolo di altri saggi funzionali in vitro come il test di attivazione dei basofili (BAT).
I basofili sono cellule effettrici chiave coinvolte nelle reazioni allergiche IgE-mediate che si attivano in seguito al cross-linking di sE adiacenti legate su recettori ad alta affinità (FcεRI) sulla superficie cellulare dopo esposizione ad allergeni / farmaci. L'attivazione dei basofili innesca la degranulazione cellulare e il rilascio di mediatori infiammatori preformati e nuovi sintetizzati contenuti nei granuli di secrezione intracitoplasmatica 7,8,9. La BAT è un metodo in vitro che cerca di imitare l'attivazione dei basofili in presenza di uno stimolo (allergene o farmaco) e determina cambiamenti nell'espressione dei marcatori di attivazione dei basofili mediante citometria a flusso 7,10. Esistono diverse strategie per identificare i basofili (IgE+, CCR3+, CRTH2+, CD203c+) e per misurare l'attivazione cellulare (principalmente la sovraregolazione di CD63 e CD203c) utilizzando combinazioni di anticorpi marcati con fluorocromo 7,10. CD63, il miglior marcatore di attivazione clinicamente validato 11,12,13,14, è una proteina di membrana ancorata ai granuli secretori contenente istamina che, dopo attivazione cellulare e fusione dei granuli con la membrana, è espressa sulla superficie basofila 15,16,17,18,19,20,21 . CD203c è un marcatore di superficie che è costitutivamente espresso sui basofili e sovraregolato dopo stimolazione FcεRI, che ha anche mostrato risultati affidabili in BAT 15,22,23,24,25. Inoltre, sembra co-esprimere con CD6326.
Negli ultimi decenni, la BAT ha dimostrato di essere utile nella diagnosi di reazioni allergiche IgE-mediate indotte da diversi fattori scatenanti come farmaci, cibo o inalanti, nonché in alcune forme di orticaria cronica, come descritto di seguito. Tuttavia, la posizione di questa tecnica negli algoritmi diagnostici è altamente variabile e non ben determinata.
Ipersensibilità ai farmaci La BAT ha dimostrato di essere utile come test complementare per farmaci e pazienti selezionati, in particolare per coloro che manifestano reazioni gravi a causa del fatto che il valore diagnostico della ST non è ben stabilito per la maggior parte dei farmaci, in quanto sono validati e standardizzati per un numero limitato di farmaci27,28,29,30. Inoltre, la quantificazione delle sIgE è disponibile solo per un numero limitato di farmaci, con sensibilità inferiore a ST 27,28,29,30,31,32. Pertanto, la diagnosi di ipersensibilità ai farmaci di solito si basa sul test di provocazione farmacologica, che può essere controindicato nei soggetti che manifestano gravi reazioni pericolose per la vita33.
Sono stati riportati risultati promettenti per l'uso di BAT in pazienti selezionati che hanno riportato reazioni di ipersensibilità immediata a diversi farmaci come betalattamici (BL)20,34,35,36,37,38,39, agenti bloccanti neuromuscolari (NMBA)19,22,40,41,42, 43,44,45, fluorochinoloni (FQs)46,47,48,49, pirazoloni 50,51,52, mezzi di contrasto radiocontrastanti (RCM)53,54,55,56 e composti di platino57,58,59 . È stato riportato che le BAT hanno una sensibilità e una specificità comprese rispettivamente tra il 51,7-66,9% e l'89,2-97,8%; e i valori predittivi positivi e negativi sono descritti tra il 93,4% e il 66,3%, rispettivamente27,31. Inoltre, la BAT è stata proposta come biomarcatore predittivo per le reazioni breakthrough durante la desensibilizzazione con composti di platino, poiché l'espressione di CD203c è aumentata rispetto a CD63 in pazienti con alto rischio di reazioni avverse durante la desensibilizzazione del farmaco57.
È da notare che la BAT è utile solo nell'ipersensibilità ai farmaci quando la reazione comporta la degranulazione dei basofili; pertanto, non è utile nelle reazioni derivanti dall'inibizione enzimatica della cicloossigenasi 142.
Allergia alimentare La BAT è emersa come un potenziale strumento diagnostico per l'allergia alimentare perché la determinazione delle sIgE sieriche all'intero estratto allergenico o ai singoli allergeni è spesso ambigua, richiedendo la sfida alimentare orale per confermare la diagnosi, che, analogamente all'ipersensibilità ai farmaci, è una procedura costosa e non priva di rischi60. Diversi studi hanno mostrato risultati rilevanti con latte vaccino 61,62, uovo 61,63, frumento 64,65,66,67,68, arachidi 63,69,70,71,72, nocciola 73,74,75,76 ,77, crostacei78, pesca 79,80,81, mela21, sedano e carota82,83.
Il principale valore aggiunto delle BAT nella diagnosi di allergia alimentare rispetto alle ST e alle sIgE nel siero è che mostra una maggiore specificità e una sensibilità simile. Pertanto, la BAT è uno strumento utile per differenziare i pazienti clinicamente allergici da soggetti sensibilizzati, ma tolleranti, che hanno sia un'elevata specificità (75-100%) che sensibilità (77-98%)63,69,84. I valori di sensibilità e specificità dipendono dall'allergene e da altri fattori come fenotipi (ad esempio, sindrome allergica orale contro anafilassi), età e modelli di sensibilizzazione legati alla geografia63,85.
Le BAT che utilizzano singoli componenti allergenici possono potenzialmente migliorare l'accuratezza diagnostica per alcuni allergeni alimentari61,80. Esistono studi che utilizzano proteine di stoccaggio dei semi (ad esempio, Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3 e Ara h 6 da arachidi)86; proteine di trasferimento lipidico (ad esempio, Pru p 3 dalla pesca e Ara h 9 dall'arachide)80,86; e Bet v 1 omologhi (ad esempio, Ara h 8 da arachidi)87. Altre potenziali utilità sono legate all'identificazione dell'allergene colpevole nei casi di sindrome da allergia ai pollini 21,87,88, allergia alla carne rossa 89 o anafilassi indotta dall'esercizio fisico dipendentedal cibo 66.
È interessante notare che la BAT può fornire informazioni sulla gravità e la soglia delle reazioni allergiche poiché i pazienti con reazioni più gravi mostrano una percentuale maggiore di basofili attivati, come osservato negli studi su pazienti allergici al latte di arachidi e latte vaccino 84,90,91; e i pazienti che reagiscono a tracce dell'allergene mostrano una maggiore sensibilità basofila 84,90,92. Questi dati suggeriscono che le BAT possono essere utili per identificare i pazienti allergici ad alto rischio che richiedono un follow-up più attento e un'istruzione più intensa93. Inoltre, è stato riportato che le BAT possono prevedere le risposte di sfida alimentare 70,91,92,94 e le soglie di reattività90,95 per aiutare a determinare quando il cibo può essere (re)introdotto in modo sicuro 84. Tuttavia, questi risultati sono controversi in alcuni studi63,96 e sono necessarie ulteriori ricerche.
D'altra parte, il BAT è stato utilizzato per monitorare la risoluzione dell'allergia alimentare, sia naturalmente che sotto trattamenti immunomodulatori, nel tempo, che fino ad ora è stata valutata solo per via orale, con i rischi e i costi associati 84,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106 ,107.108. Inoltre, è stato anche usato per monitorare l'effetto di omalizumab nell'allergia alimentare poiché l'attivazione dei basofili diminuisce durante il trattamento con omalizumab, ma aumenta dopo la cessazione del trattamento109.
Allergia inalante La BAT è raramente benefica nell'allergia inalante poiché la diagnosi può essere stabilita di routine mediante quantificazione delle IgE e ST. Tuttavia, nei casi di rinite allergica locale (livelli non rilevabili di sIgE e ST negative con test di provocazione nasale positivi), la BAT ha permesso la diagnosi nel 50% dei casi110. È stata inoltre riportata una correlazione tra sensibilità ai basofili e risposta ai test di provocazione nasale/bronchiale, nonché tra gravità dell'asma ed efficacia del trattamento con omalizumab111.112.
Il BAT è stato utilizzato anche per monitorare l'immunoterapia con allergeni per acari della polvere domestica e pollini, poiché la sensibilità dei basofili diminuisce durante l'immunoterapia, probabilmente a causa dell'interferenza degli anticorpi IgG bloccanti 113.114.115.116.117.
Allergia al veleno degli imenotteri La diagnosi di allergia al veleno degli imenotteri si basa di routine sulla ST e sulle sIgE sieriche. La BAT ha mostrato un'elevata sensibilità (85-100%) e specificità (83-100%) ed è stata riportata come utile nei casi che producono risultati equivoci o in pazienti con una storia clinica suggestiva di allergia al veleno ma sIgE non rilevabile e ST118.119 negativa. Tuttavia, la BAT non sembra essere predittiva della gravità di queste reazioni120.121.
Fino al 60% dei pazienti presenta sIgE sia alla vespa che al veleno d'api e l'identificazione dell'allergene dominante è fondamentale per un adeguato trattamento immunoterapico. In questi casi, il BAT è stato segnalato per essere utile nell'identificazione dell'allergene dominante 119,122,123,124. Sebbene le sIgE ai principali allergeni dei veleni di api e vespe possano ridurre l'utilità della BAT nei pazienti con doppia positività ad entrambi i veleni, fornisce informazioni utili principalmente in soggetti con risultati negativi nelle determinazioni delle sIgE123.
Alcuni studi suggeriscono che il BAT può essere utile come biomarcatore predittivo per gli effetti collaterali durante la fase di accumulo dell'immunoterapia del veleno poiché questa opzione di trattamento è stata segnalata per ridurre la sensibilità dei basofili. Tuttavia, la reattività non diminuisce e questa utilità BAT è oggi controversa 13,120,125,126,127,128,129,130.
Orticaria e angioedema Un sottogruppo di pazienti con orticaria cronica ha una fisiopatologia autoimmune, dovuta agli autoanticorpi IgE contro gli autoallergeni e agli autoanticorpi IgG che colpiscono i complessi FcεRI o IgE-FcεRI presenti sulla superficie dei mastociti131.132. Nella pratica clinica, la diagnosi di questo tipo di orticaria cronica si è basata su ST sierico autologo positivo, che ha il rischio di infezione accidentale. La BAT è stata proposta come test in vitro per la diagnosi e il monitoraggio dei pazienti con sospetta orticaria cronica. È stato riportato che sia l'espressione di CD63 che quella di CD203c sulla superficie dei basofili sono aumentate in seguito alla stimolazione con sieri di pazienti con orticaria cronica, mostrando la rilevazione di autoanticorpi attivi 133.134.135.136.137. Recentemente, è stato riportato che i pazienti con BAT positivo spesso sperimentano lo stato di malattia più attivo, valutato dal punteggio di attività dell'orticaria, e richiedono dosi più elevate di antistaminici insieme a trattamenti di terza linea (ciclosporina A o omalizumab), rispetto a quelli con BAT138 negativo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, without Cap, Nonsterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD193 (CCR3) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>310708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCalibur Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD63 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>353006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Solution 10x concentrated</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Formyl-Met-Leu-Phe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD203c (E-NPP3) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>324606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse Anti-Human IgE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-3</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>203-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheath Fluid</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>342003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUBE 9 mL LH Lithium Heparin</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>455084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

basophil activation test for allergy diagnosis

Il test di attivazione dei basofili (BAT) è un test diagnostico complementare in vitro che può essere utilizzato in aggiunta alla storia clinica, al test cutaneo (ST) e alla determinazione specifica delle IgE (sIgE) nella valutazione delle reazioni allergiche IgE-mediate al cibo, al veleno degli insetti, ai farmaci e ad alcune forme di orticaria cronica. Tuttavia, il ruolo di questa tecnica negli algoritmi diagnostici è altamente variabile e non ben determinato.
La BAT si basa sulla determinazione della risposta dei basofili all'attivazione incrociata delle IgE allergene/farmaco attraverso la misurazione di marcatori di attivazione (come CD63, CD203c) mediante citometria a flusso. Questo test può essere uno strumento utile e complementare per evitare test di provocazione controllati per confermare la diagnosi di allergia, specialmente nei soggetti che manifestano gravi reazioni potenzialmente letali. In generale, le prestazioni delle BAT devono essere prese in considerazione se i) l'allergene/farmaco produce risultati falsi positivi nella ST; ii) non esiste una fonte di allergeni/farmaci da utilizzare per la determinazione di ST o sIgE; iii) vi è discordanza tra la storia del paziente e la determinazione ST o sIgE; iv) i sintomi suggeriscono che la ST può provocare una risposta sistemica; v) prima di prendere in considerazione un CCT per confermare l'allergene/farmaco colpevole. I principali limiti del test sono legati alla sensibilità non ottimale, soprattutto nell'allergia ai farmaci, alla necessità di eseguire il test non più di 24 ore dopo l'estrazione del campione e alla mancanza di standardizzazione tra i laboratori in termini di procedure, concentrazioni e marcatori cellulari.

La BAT eseguita con allergeni o farmaci consente di studiare le reazioni di ipersensibilità IgE-dipendenti. La reattività dei basofili deve essere misurata in almeno due concentrazioni ottimali per ottenere i migliori risultati34 e l'attivazione viene visualizzata dalla sovraregolazione di CD63 sulla superficie cellulare. Nel caso di allergeni, inoltre, per confermare la reattività dei basofili, la sensibilità dei basofili dovrebbe essere analizzata misurando la reattività a concentrazioni mu...

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Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis

Il test di attivazione dei basofili è un test diagnostico complementare in vitro per la valutazione delle reazioni allergiche IgE-mediate basato sulla rilevazione dell'attivazione dei basofili in presenza di uno stimolo specifico attraverso la misura dei marcatori di attivazione mediante citometria a flusso.

Test di attivazione dei basofili per la diagnosi di allergia

The basophil activation test (BAT) is a complementary in vitro diagnostic test that can be used in addition to clinical history, skin test (ST), and ...

Il test di attivazione dei basofili è un test diagnostico in vitro gratuito per la valutazione delle reazioni allergiche IgE-mediate che si sono dimostrate utili per le reazioni indotte da farmaci, cibo o inalanti, nonché in alcune forme di orticaria cronica. Questo test si basa sulla determinazione della risposta dei basofili all'attivazione di IgE cross-linking di un allergene o di un farmaco attraverso la misurazione dei marcatori di attivazione mediante citometria a flusso. Il test di attivazione dei basofili può essere uno strumento utile e complementare per evitare test di provocazione controllati per confermare la diagnosi di allergia, specialmente nei soggetti che manifestano gravi reazioni potenzialmente letali.Inoltre, questo test ha il vantaggio di essere in grado di analizzare la risposta contro qualsiasi farmaco o allergene rispetto ad altri metodi in vitro che sono disponibili solo per pochi farmaci e allergeni. I principali limiti del test sono legati alla sensibilità non ottimale, specialmente nell'allergia ai farmaci. La necessità di eseguire il test non più di 24 ore dopo l'estrazione del campione e la mancanza di standardizzazione tra laboratori e algoritmi diagnostici.Inizia raccogliendo il sangue periferico in tubi eparinizzati, e posiziona i campioni in un rotore per mantenerli a temperatura ambiente fino a quando non sono necessari per il protocollo sperimentale. Etichettare due tubi citometrici da cinque millilitri ciascuno per il controllo negativo e il controllo positivo. Etichettare anche un tubo ciascuno per le diverse concentrazioni di allergeni o farmaci in fase di test.Quindi posizionare i tubi in un rack in modo che i tubi si adattino perfettamente senza scivolare. Per il primo controllo positivo, preparare una soluzione a quattro micromolari di N-formilmetionil-leucil-fenilalanina o fMLP in 0,05% PBS-T Per confermare la qualità dei basofili. Per il secondo controllo positivo, preparare una soluzione anti-IgE da 0,05 milligrammi per millilitro utilizzando PBS-T.Preparare la miscela di colorazione aggiungendo un microlitro ciascuno di anticorpi CCR3-APC, CD203c-PE e CD63-FITC per 20 microlitri di tampone di stimolazione. Quindi aggiungere 23 microlitri di questa miscela colorante a ciascun tubo. Aggiungere 100 microlitri di PBS-T ai tubi di controllo negativi.Aggiungere 100 microlitri di fMLP a uno dei tubi di controllo positivi e aggiungere 100 microlitri di anti-IgE E all'altro al resto dei tubi. Aggiungere 100 microlitri delle diverse concentrazioni di allergeni o farmaci e incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere delicatamente 100 microlitri di sangue a ciascun tubo per evitare l'emolisi.Quindi vortice delicatamente i tubi e incubarli per 25 minuti a 37 gradi Celsius nel bagno termostatico con media agitazione. Tenere i tubi a quattro gradi Celsius per almeno cinque minuti per fermare la degranulazione. Ad ogni provetta, aggiungere due millilitri di tampone lisante per lisare gli eritrociti.Vortice ogni tubo e poi incubare i tubi per cinque minuti a temperatura ambiente. Centrifugare i tubi a 300 g a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Quindi capovolgere il rack nel lavandino per decantare il surnatante mentre le celle rimangono sul fondo dei tubi.Aggiungere tre millilitri di PBS-T a ciascun tubo per lavare le celle e vortice i tubi. Eseguire un secondo ciclo di centrifugazione utilizzando lo stesso set di parametri e decantare il surnatante rovesciando il rack nel lavandino. Quindi mantenere i campioni a quattro gradi Celsius protetti dalla luce fino alla citometria a flusso.Collegare il citometro a flusso al software del computer e attendere che il citometro sia pronto. Caricare il modello e le impostazioni dello strumento come descritto nel testo manuscritto. Avviare il processo di acquisizione del campione.Per selezionare i basofili attivati, in primo luogo, eliminare i linfociti dal grafico Side Scatter-Forward Scatter. Quindi eliminare i basofili dalla popolazione di linfociti come CCR3 + CD203c + cellule e acquisire almeno 500 basofili per tubo. Impostare la soglia CD63 a circa il 2,5% utilizzando i tubi di controllo negativi e analizzare i campioni.Le reazioni di ipersensibilità IgE-dipendenti sono state studiate eseguendo un test di attivazione dei basofili, o BAT, utilizzando allergeni e farmaci. La sensibilità dei basofili è stata analizzata misurando la reattività a più concentrazioni di allergeni decrescenti che aiutano a determinare la concentrazione allergica che induce la risposta del 50% di basofili o EC50. In primo luogo, i linfociti sono stati controllati dal grafico di dispersione laterale in avanti.Quindi i basofili sono stati prelevati dalla popolazione linfocitaria come CCR3 + CD203c + cellule. Quindi è stato utilizzato un grafico CCR3-CD63 per analizzare l'attivazione dei basofili utilizzando CD63 come marcatore di attivazione per due farmaci e diverse concentrazioni di un allergene. Il test viene eseguito con sangue intero fresco e deve essere eseguito non più di 24 ore dopo l'estrazione del sangue.Lo stimolo utilizzato nel test non deve includere eccipienti e devono essere considerate le caratteristiche chimiche dei farmaci. Altri metodi aggiuntivi in vitro per la diagnosi delle reazioni allergiche IgE-mediate, o la determinazione delle IgE, o il test di rilascio dell'istamina.

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Research

JoVE Journal

Medicine

FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis

Pre-implantation genetic diagnosis (PGD) is an established alternative to pre-natal diagnosis, and involves selecting pre-implantation embryos from a cohort generated by assisted reproduction technology (ART). This selection may be required because of familial monogenic disease (e.g. cystic fibrosis), or because one partner carries a chromosome rearrangement (e.g. a two-way reciprocal translocation). PGD is available for couples who have had previous affected children, and/or in the case of chromosome rearrangements, recurrent miscarriages, or infertility. Oocytes aspirated following ovarian stimulation are fertilized by in vitro immersion in semen (IVF) or by intracytoplasmic injection of an individual spermatozoon (ICSI). Pre-implantation cleavage-stage embryos are biopsied, usually by the removal of a single cell on day 3 post-fertilization, and the biopsied cell is tested to establish the genetic status of the embryo. Fluorescence in situ hybridization (FISH) on the fixed nuclei of biopsied cells with target-specific DNA probes is the technique of choice to detect chromosome imbalance associated with chromosome rearrangements, and to select female embryos in families with X-linked disease for which there is no mutation-specific test. FISH has also been used to screen embryos for spontaneous chromosome aneuploidy (also known as PGS or PGD-AS) in order to try and improve the efficiency of assisted reproduction; however, the predictive value of this test using the spreading and FISH technique described here is likely to be unacceptably low in most people's hands and it is not recommended for routine clinical use. We describe the selection of suitable probes for single-cell FISH, spreading techniques for blastomere nuclei, and in situ hybridization and signal scoring, applied to PGD in a clinical setting.

This article describes the selection of suitable probes for single-cell FISH, spreading techniques for blastomere nuclei, and in situ hybridization and signal scoring, applied to pre-implantation genetic diagnosis (PGD) in a clinical setting.

FISH per preimpianto Diagnosi Genetica

Pre-implantation genetic diagnosis (PGD) is an established alternative to pre-natal diagnosis, and involves selecting pre-implantation embryos from a ...

Ricerca

Medicina

The Trier Social Stress Test Protocol for Inducing Psychological Stress

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting. Protocols that allow researchers to study the biological pathways of the stress response in health and disease are fundamental to the progress of research in stress and anxiety.1 Although numerous protocols exist for inducing stress response in the laboratory, many neglect to provide a naturalistic context or to incorporate aspects of social and psychological stress. Of psychological stress protocols, meta-analysis suggests that the Trier Social Stress Test (TSST) is the most useful and appropriate standardized protocol for studies of stress hormone reactivity.2 In the original description of the TSST, researchers sought to design and evaluate a procedure capable of inducing a reliable stress response in the majority of healthy volunteers.3 These researchers found elevations in heart rate, blood pressure and several endocrine stress markers in response to the TSST (a psychological stressor) compared to a saline injection (a physical stressor).3 Although the TSST has been modified to meet the needs of various research groups, it generally consists of a waiting period upon arrival, anticipatory speech preparation, speech performance, and verbal arithmetic performance periods, followed by one or more recovery periods. The TSST requires participants to prepare and deliver a speech, and verbally respond to a challenging arithmetic problem in the presence of a socially evaluative audience.3 Social evaluation and uncontrollability have been identified as key components of stress induction by the TSST.4 In use for over a decade, the goal of the TSST is to systematically induce a stress response in order to measure differences in reactivity, anxiety and activation of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) or sympathetic-adrenal-medullary (SAM) axis during the task.1 Researchers generally assess changes in self-reported anxiety, physiological measures (e.g. heart rate), and/or neuroendocrine indices (e.g. the stress hormone cortisol) in response to the TSST. Many investigators have adopted salivary sampling for stress markers such as cortisol and alpha-amylase (a marker of autonomic nervous system activation) as an alternative to blood sampling to reduce the confounding stress of blood-collection techniques. In addition to changes experienced by an individual completing the TSST, researchers can compare changes between different treatment groups (e.g. clinical versus healthy control samples) or the effectiveness of stress-reducing interventions.1

This article describes a protocol for inducing psychological stress in participants, which enables researchers to measure psychological, physiological and neuroendocrine responses to stress within single participants or between groups.

The Social Trier Protocollo di prova dello stress per indurre stress psicologico

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting.  Protocols that allow researchers to study the biological ...

Transabdominal Ultrasound for Pregnancy Diagnosis in Reeves' Muntjac Deer

Reeves' muntjac deer (Muntiacus reevesi) are a small cervid species native to southeast Asia, and are currently being investigated as a potential model of prion disease transmission and pathogenesis. Vertical transmission is an area of interest among researchers studying infectious diseases, including prion disease, and these investigations require efficient methods for evaluating the effects of maternal infection on reproductive performance. Ultrasonographic examination is a well-established tool for diagnosing pregnancy and assessing fetal health in many animal species1-7, including several species of farmed cervids8-19, however this technique has not been described in Reeves' muntjac deer. Here we describe the application of transabdominal ultrasound to detect pregnancy in muntjac does and to evaluate fetal growth and development throughout the gestational period. Using this procedure, pregnant animals were identified as early as 35 days following doe-buck pairing and this was an effective means to safely monitor the pregnancy at regular intervals. Future goals of this work will include establishing normal fetal measurement references for estimation of gestational age, determining sensitivity and specificity of the technique for diagnosing pregnancy at various stages of gestation, and identifying variations in fetal growth and development under different experimental conditions.

Transabdominal Ultrasound for Pregnancy Diagnosis in Reeves&#039; Muntjac Deer

Transabdominal ultrasound is described as an effective, noninvasive means for assessing reproductive status in Reeves' muntjac deer. These methods can be used to achieve early pregnancy diagnosis and to evaluate fetal viability. Future applications of this technique include estimation of gestational age and effects of maternal disease on fetal development.

Ecografia transabdominale per la diagnosi di gravidanza nel cervo Muntjac di Reeves

Reeves' muntjac deer (Muntiacus reevesi) are a small cervid species native to southeast Asia, and are currently being investigated as a potential model of ...

Diagnosis of Musculus Gastrocnemius Tightness - Key Factors for the Clinical Examination

Common foot and ankle pathologies have been linked to isolated Musculus gastrocnemius tightness (MGT). Various examination techniques have been described to assess MGT. Still, a standardized examination procedure is missing. Literature argues for weightbearing examination but the degree of knee flexion needed to eliminate the restraining effect of the M. gastrocnemius on ankle dorsiflexion (ADF) is unknown. This manuscript investigates the effect of knee flexion on ankle dorsiflexion and provides a detailed description of a standardized examination protocol. Examination on 20 healthy individuals revealed, that 20&#176; of knee flexion is sufficient to fully eliminate the influence of the M. gastrocnemius on ADF. This builds the prerequisite for a standardized examination for MGT. Non-weightbearing and weightbearing examination of ADF has to be conducted with the knee fully extended and at least 20&#176; flexed. Two investigators should conduct non-weightbearing testing with the subject in supine position. In order to obtain reliable results, the axis of the fibula should be marked. One examiner can conduct weightbearing examination with the subject in lunge stance. Isolated MGT is present if ADF is impaired with the knee fully extended and knee flexion results in a significant ADF increase. The herein presented standardized examination is the prerequisite for future studies aiming at establishing norm values.

Diagnosis of Musculus Gastrocnemius Tightness - Key Factors for the Clinical Examination

Isolated Musculus gastrocnemius tightness is a common cause for foot and ankle pathologies. Currently no standardized examination procedure exists. This manuscript demonstrates that 20 degree of knee flexion eliminates the restraining effect of the M. gastrocnemius on ankle dorsiflexion and presents a video description of a standardized examination protocol.

La diagnosi di<em&gt; Muscolo gastrocnemio</em&gt; Tenuta - fattori chiave per l&#39;esame clinico

Common foot and ankle pathologies have been linked to isolated Musculus gastrocnemius tightness (MGT). Various examination techniques have been described ...

Hydra, a Computer-Based Platform for Aiding Clinicians in Cardiovascular Analysis and Diagnosis

Cardiovascular diseases (CVDs) are the leading cause of death throughout the world. The total risk of developing CVD is determined by the combined effect of different cardiovascular risk factors (e.g., diabetes, raised blood pressure, unhealthy diet, tobacco use, stress, etc.) that commonly coexist and act multiplicatively. Most CVDs can be prevented by an early identification of the highest risk factors and an appropriate treatment. The stratification of cardiovascular risk factors involves a wide range of parameters and tests that specialists use in their clinical practice. In addition to cardiovascular (CV) risk stratification, ambulatory blood pressure monitoring (ABPM) also provides relevant information for diagnostic and treatment purposes. This work presents a list of protocols based on the Hydra platform, a web-based system for clinical decision support which incorporates a set of functionalities and services that are required for complete cardiovascular analysis, risk assessment, early diagnosis, treatment and monitoring of patients over time. The program includes tools for inputting and managing comprehensive patient data, organized into different checkups to track the evolution over time. It also has a risk stratification tool to compute a CV risk factor based upon several risk stratification tables of reference. Additionally, the program includes a tool that incorporates ABPM analysis and allows the extraction of valuable information by monitoring blood pressure over a specific period of time. Finally, the reporting service summarizes the most relevant information in a set of reports that aid clinicians in their clinical decision-making process.

This article presents a protocol based on Hydra &#8212; a web-based system for clinical decision support that integrates a full and detailed set of functionalities and services required by physicians for complete cardiovascular analysis, risk assessment, early diagnosis, treatment, and monitoring over time.

Hydra, una piattaforma basata su Computer per aiutare i clinici nella diagnosi e analisi cardiovascolare

Cardiovascular diseases (CVDs) are the leading cause of death throughout the world. The total risk of developing CVD is determined by the combined effect ...

International Expert Consensus and Recommendations for Neonatal Pneumothorax Ultrasound Diagnosis and Ultrasound-guided Thoracentesis Procedure

Pneumothorax (PTX) represents accumulation of the air in the pleural space. A large or tension pneumothorax can collapse the lung and cause hemodynamic compromise, a life-threatening disorder. Traditionally, neonatal pneumothorax diagnosis has been based on clinical images, auscultation, transillumination, and chest X-ray findings. This approach may potentially lead to a delay in both diagnosis and treatment. The use of lung US in diagnosis of PTX together with US-guided thoracentesis results in earlier and more precise management. The recommendations presented in this publication are aimed at improving the application of lung US in guiding neonatal PTX diagnosis and management.

Pneumothorax is a common emergency and critical disease in newborn infants that needs rapid, clear diagnosis and timely treatment. Diagnosis and treatment based on chest X-rays are associated with delayed management and radiation damage. Lung ultrasound (US) provides useful guidance for rapid, accurate diagnosis and the precise thoracentesis of pneumothorax.

Consenso internazionale degli esperti e raccomandazioni per la diagnosi ad ultrasuoni pneumotorace neoatale e la procedura di toracemite guidata dall'ultrasuoni

Pneumothorax (PTX) represents accumulation of the air in the pleural space. A large or tension pneumothorax can collapse the lung and cause hemodynamic ...

Diagnosis and Surgical Treatment of Human Brucellar Spondylodiscitis

Brucellar spondylodiscitis (BS) is the most prevalent and significant osteoarticular presentation of human Brucellosis, which is commonly manifested in pastoral communities. It is difficult to differentially diagnose and usually leads to irreversible neurologic deficits and spinal deformities. The initial diagnosis of BS is based on clinical findings and radiographic assessments, and the confirmed diagnosis should be established by the isolation of Brucella species from the blood and/or the standard tube agglutination test. Differential diagnosis of multifocal BS from either degenerative disc diseases or tuberculosis is especially highlighted. The surgical approach, either endoscopic or open, is demonstrated in detail, accompanied by radiographic evidence of structural compression or severe instability. Further, the crucial surgical steps, including single-stage transforaminal decompression, debridement, interbody fusion, and internal fixation, are explained. Moreover, perioperative care and postoperative rehabilitation are also addressed. Taken together, this clinical algorithm presents a practical guide that has yielded substantially satisfactory outcomes in the past decades, which can also be introduced for large-scale application to manage human BS, especially in endemic regions.

We describe a clinical algorithm, based on decades of front-line experience of diagnosis and surgical treatment of human Brucellar spondylodiscitis in the largest medical center of the China's Xinjiang Pastoral Area.

Diagnosi e trattamento chirurgico della spondilodiscite brucellare umana

Brucellar spondylodiscitis (BS) is the most prevalent and significant osteoarticular presentation of human Brucellosis, which is commonly manifested in ...

Testing Acetylcholine Followed by Adenosine for Invasive Diagnosis of Coronary Vasomotor Disorders

More than 50% of patients with signs and symptoms of myocardial ischemia undergoing coronary angiography have unobstructed coronary arteries. Coronary vasomotor disorders (impaired vasodilatation and/or enhanced vasoconstriction/spasm) represent important functional causes for such a clinical presentation. Although impaired vasodilatation may be assessed with non-invasive techniques such as positron emission tomography or cardiac magnetic resonance imaging, there is currently no reliable non-invasive technique for the diagnosis of coronary spasm available. Thus, invasive diagnostic procedures (IDP) have been developed for the diagnosis of coronary vasomotor disorders including spasm testing as well as assessment of coronary vasodilatation. The identification of the underlying type of disorder (so called endotype) allows the initiation of targeted pharmacological treatments. Despite the fact that such an approach is recommended by the current European Society of Cardiology guidelines for the management of chronic coronary syndromes based on the CorMicA study, comparability of results as well as multicenter trials are currently hampered by major differences in institutional protocols for coronary functional testing. This article describes a comprehensive IDP protocol including intracoronary acetylcholine provocation testing for diagnosis of epicardial/microvascular spasm, followed by Doppler wire-based assessment of coronary flow reserve (CFR) and hyperemic microvascular resistance (HMR) in search of coronary vasodilatory impairment.

Coronary vasomotion disorders represent frequent functional causes of angina in patients with unobstructed coronaries. The underlying mechanism of angina (endotype) in these patients can be determined by a comprehensive invasive diagnostic procedure based on acetylcholine provocation testing followed by Doppler-derived assessment of the coronary flow reserve and microvascular resistance.

Test di acetilcolina seguita da adenosina per la diagnosi invasiva dei disturbi vasomotori coronarici

More than 50% of patients with signs and symptoms of myocardial ischemia undergoing coronary angiography have unobstructed coronary arteries. Coronary ...

Measurement of Myocardial Lactate Production for Diagnosis of Coronary Microvascular Spasm

In about a quarter of patients with angina and non-obstructive coronary arteries, no epicardial spasm is noted on coronary arteriography during an angina attack. Since the pressure-rate product is almost identical at rest and the onset of attack in those patients, the decrease in coronary blood flow rather than increased myocardial oxygen consumption is likely to explain myocardial ischemia, indicating a substantial involvement with coronary microvascular spasm (MVS). Myocardial lactate production, which could be defined as a negative myocardial lactate extraction ratio (ratio of the coronary arterial-venous difference in lactate concentration to arterial concentration), is considered indicative of objective evidence to support the emerging myocardial ischemia. Thus, monitoring of the myocardial lactate production and the emergence of chest pain and ischemic electrocardiographic changes during acetylcholine (ACh) provocation testing is of significant value for detecting the entity of MVS. Practically, 1 min after incremental doses of ACh (20, 50, and 100 &#956;g) are administered into the left coronary artery (LCA), paired samples of 1 mL of blood are collected from the LCA ostium and coronary sinus for measurement of lactate concentration by a calibrated automatic lactate analyzer. Then, the development of MVS could be confirmed by negative myocardial lactate extraction ratio despite the absence of angiographically demonstrable epicardial coronary spasm or before its occurrence throughout ACh provocation testing. In conclusion, assessment of myocardial lactate production is essential and valuable for the diagnosis of MVS.

Myocardial lactate production (coronary arterial-venous difference in serum lactate level) during coronary spasm provocation testing is considered as a highly sensitive marker that reflects acetylcholine-induced myocardial ischemia due to microvascular spasm. This article presents the procedures to assess myocardial lactate production for the diagnosis of coronary microvascular spasm.

Misurazione della produzione di lattato miocardico per la diagnosi di spasmo microvascolare coronarico

In about a quarter of patients with angina and non-obstructive coronary arteries, no epicardial spasm is noted on coronary arteriography during an angina ...

High-speed Video Microscopy Analysis for First-line Diagnosis of Primary Ciliary Dyskinesia

Primary ciliary dyskinesia (PCD) is a congenital disorder predominantly inherited in an autosomal recessive trait. The disorder causes disturbance in the motion of cilia, leading to severe impairment of mucociliary clearance (MCC). If undiagnosed or diagnosed too late, the condition leads to the development of bronchiectasis and serious damage to the lungs in later life. Most of the methods for diagnosing PCD are time-consuming and demand extensive economic resources to establish them. High-speed video microscopy analysis (HSVMA) is the only diagnostic tool to visualize and analyze living respiratory cells with beating cilia in vitro. It is fast, cost-effective, and, in experienced hands, very reliable as a diagnostic tool for PCD. In addition, classical diagnostic measures such as transmission electron microscopy (TEM) are not applicable for some mutations as morphological changes are absent. 
This paper describes the process of collecting respiratory epithelial cells, the further preparation of the specimen, and the process of HSVMA. We also describe how brushed cells can be successfully kept unharmed and beating by keeping them in a nourishing medium for storage and transport to the investigation site in cases where a clinic does not possess the equipment to perform HSVMA. Also shown are videos with pathologic beating patterns from patients with a mutation in the dynein arm heavy chain 11 gene (DNAH11), which cannot be diagnosed with TEM; the result of an inconclusive HSVMA due to infection of the upper airways, as well as an unsuccessful brushing with superimposition of red blood cells. With this article, we would like to encourage every unit dealing with pulmonology patients and rare lung diseases to perform HSVMA as part of their daily routine diagnostics for PCD or send the specimens over to a center specializing in performing HSVMA.

High-speed video microscopy analysis is a relatively easy-to-perform, fast, cost-effective, and, in experienced hands, a considerably reliable tool for first-line diagnostics of primary ciliary dyskinesia, which should be available in every center involved in diagnostics and the treatment of severe lung diseases.

Analisi video al microscopio ad alta velocità per la diagnosi di prima linea della discinesia ciliare primaria

Primary ciliary dyskinesia (PCD) is a congenital disorder predominantly inherited in an autosomal recessive trait. The disorder causes disturbance in the ...