Name: basophil activation test for allergy diagnosis
Uploaded: 2021-05-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis at JoVE.com

Vi takker Claudia Corazza for hennes uvurderlige engelskspråklige støtte. Dette arbeidet ble støttet av Institute of Health '' Carlos III '' (ISCIII) av MINECO (stipend cofunded av ERDF: "Una manera de hacer Europa"; Tilskudd nr. PI20/01715; PI18/00095; PI17/01410; PI17/01318; PI17/01237 og RETIC ARADYAL RD16/0006/0001; Det andalusiske regionale helsedepartementet (Grant Nos. PI-0127-2020, PIO-0176-2018; PE-0172-2018; PE-0039-2018; PC-0098-2017; PI-0075-2017; PI-0241-2016). ID er en klinisk etterforsker (B-0001-2017) og AA har en senior postdoktorkontrakt (RH-0099-2020), begge støttet av det andalusiske regionale helsedepartementet (finansiert av ESF: "Andalucía se mueve con Europa").

Protokollytelsen ble utført i henhold til Helsinkideklarasjonens prinsipper og godkjent av den lokale etiske komiteen (Comité de Ética para la Investigación Provincial de Málaga, Spania). Alle forsøkspersonene ble informert muntlig om forskningsstudien, og de signerte det tilsvarende informerte samtykkeskjemaet.
MERK: Den nåværende protokollen beskriver BAT-prosedyren som forfatterne bruker daglig. Dette er imidlertid ikke en standardisert metode, og det finnes forskjeller med...

BAT er en komplementær in vitro diagnostisk test for evaluering av IgE-medierte allergiske reaksjoner som har vist seg å være nyttig i diagnosen reaksjoner indusert av forskjellige utløsere som narkotika, mat eller sniffestoffer, samt i noen former for kronisk urtikaria. Generelt bør BAT-ytelse vurderes hvis i) allergenet / stoffet gir falske positive resultater i ST; ii) allergenet/stoffet ikke er tilgjengelig for bruk til kvantifisering av ST eller sIgE; iii) uoverensstemmelse mellom anamnese og ST- eller...

IgE-mediert allergidiagnose er basert på sykehistorie, hudtester (STs), kvantifisering av serumspesifikt IgE (sIgE), og, hvis det er nødvendig og indisert, kontrollerte smittetester (CCT)1,2,3,4,5,6. Imidlertid kan klinisk historie være upålitelig siden det kan være mangel på nøyaktig informasjon, og STs og CCT er ikke risikofrie prosedyrer som kan være kontraindisert hos personer som opplever alvorlige livstruende reaksjoner 1,2,3,4,5,6 . Disse problemene, sammen med det faktum at bestemmelsen av sIgE ved validerte og kommersielle fluorenzymimmunoassays bare er tilgjengelig for få allergener og stoffer, har fremhevet den viktige rollen til andre in vitro funksjonelle analyser som basofil aktiveringstest (BAT).
Basofiler er nøkkeleffektorceller involvert i IgE-medierte allergiske reaksjoner som aktiveres ved kryssbinding av tilstøtende sIgE bundet på høyaffinitetsreseptorer (FcεRI) på celleoverflaten etter allergen / legemiddeleksponering. Basofil aktivering utløser celle degranulering og frigjøring av pre-formede og nye syntetiserte inflammatoriske mediatorer inneholdt i intracytoplasmatisk sekresjon granulat 7,8,9. BAT er en in vitro-metode som forsøker å etterligne basofilaktiveringen i nærvær av en stimulus (allergen eller stoff) og bestemmer endringer i uttrykket av basofile aktiveringsmarkører ved flowcytometri 7,10. Det finnes ulike strategier for å identifisere basofiler (IgE+, CCR3+, CRTH2+, CD203c+) og for å måle celleaktivering (hovedsakelig oppregulering av CD63 og CD203c) ved bruk av kombinasjoner av fluorokrommerkede antistoffer 7,10. CD63, den beste klinisk validerte aktiveringsmarkøren 11,12,13,14, er et membranprotein forankret ved sekretoriske granulater som inneholder histamin som etter celleaktivering og fusjon av granulatene med membranen uttrykkes på basofil overflate 15,16,17,18,19,20,21 . CD203c er en overflatemarkør som konstitutivt uttrykkes på basofiler og oppreguleres etter FcεRI-stimulering, som også har vist pålitelige resultater i BAT 15,22,23,24,25. Dessuten ser det ut til å uttrykke seg sammen med CD6326.
I de siste tiårene har BAT vist seg å være nyttig i diagnosen IgE-medierte allergiske reaksjoner indusert av forskjellige utløsere som narkotika, mat eller sniffestoffer, samt i noen former for kronisk urtikaria, som beskrevet nedenfor. Plasseringen av denne teknikken i de diagnostiske algoritmene er imidlertid svært variabel og ikke godt bestemt.
Overfølsomhet overfor narkotika BAT har vist seg å være nyttig som en komplementær test for utvalgte legemidler og pasienter, spesielt for de som opplever alvorlige reaksjoner på grunn av at diagnostisk verdi av ST ikke er godt etablert for de fleste legemidler, da de er validert og standardisert for et begrenset antall legemidler27,28,29,30. I tillegg er kvantifisering av sIgE bare tilgjengelig for et begrenset antall legemidler, med lavere sensitivitet enn ST 27,28,29,30,31,32. Derfor er diagnosen narkotikaoverfølsomhet vanligvis avhengig av narkotikaprovokasjonstest, som kan være kontraindisert hos personer som opplever alvorlige livstruende reaksjoner33.
Lovende resultater er rapportert for bruk av BAT hos utvalgte pasienter som rapporterer umiddelbare overfølsomhetsreaksjoner på forskjellige legemidler som betalaktamer (BLs)20,34,35,36,37,38,39, nevromuskulære blokkeringsmidler (NMBA)19,22,40,41,42, 43,44,45, fluorokinoloner (FQ)46,47,48,49, pyrazoloner 50,51,52, radiokontrastmedier (RCM)53,54,55,56 og platinaforbindelser57,58,59 . BAT har blitt rapportert å ha en sensitivitet og spesifisitet mellom henholdsvis 51,7-66,9% og 89,2-97,8%. og positive og negative prediktive verdier er beskrevet å variere mellom 93,4 % og 66,3 %, henholdsvis 27,31. Videre har BAT blitt foreslått som en prediktiv biomarkør for gjennombruddsreaksjoner under desensibilisering med platinaforbindelser, da CD203c-ekspresjon er økt sammenlignet med CD63 hos pasienter med høy risiko for bivirkninger under desensibiliseringav legemidlet 57.
Det er verdt å merke seg at BAT bare er nyttig i legemiddeloverfølsomhet når reaksjonen innebærer basofil degranulering; Derfor er det ikke nyttig i reaksjoner som følge av enzymatisk inhibering av cyklooksygenase 142.
Matallergi BAT har dukket opp som et potensielt diagnostisk verktøy for matallergi fordi bestemmelse av serum sIgE til hele allergenekstraktet eller enkeltallergener ofte er tvetydig, og krever oral matutfordring for å bekrefte diagnosen, som på samme måte som overfølsomhet for stoffet er en kostbar og ikke risikofri prosedyre60. Flere studier har vist relevante resultater med kumelk 61,62, egg 61,63, hvete 64,65,66,67,68, peanøtt 63,69,70,71,72, hasselnøtt 73,74,75,76 ,77, skalldyr78, fersken 79,80,81, eple21, selleri og gulrot 82,83.
Den viktigste merverdien av BAT i diagnosen matallergi sammenlignet med STs og sIgE i serum er at den viser en høyere spesifisitet og lignende følsomhet. Dermed er BAT et nyttig verktøy for å skille klinisk allergiske pasienter fra sensibiliserte, men tolerante personer som har både høy spesifisitet (75-100%) og følsomhet (77-98%) 63,69,84. Sensitivitets- og spesifisitetsverdier avhenger av allergenet og andre faktorer som fenotyper (f.eks. oralt allergisyndrom versus anafylaksi), alder og geografirelaterte sensibiliseringsmønstre63,85.
BAT ved hjelp av enkelt allergenkomponenter kan potensielt forbedre diagnostisk nøyaktighet for noen matallergener61,80. Det er studier med frølagringsproteiner (f.eks. Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3 og Ara h 6 fra peanøtt)86; lipidoverføringsproteiner (f.eks. Pru p 3 fra fersken og Ara h 9 fra peanøtt)80,86; og Bet v 1 homologer (f.eks. Ara h 8 fra peanøtt)87. Andre potensielle verktøy er relatert til identifisering av det skyldige allergenet i tilfeller av pollen-matallergisyndrom 21,87,88, allergi mot rødt kjøtt 89 eller matavhengig treningsindusert anafylaksi66.
Interessant nok kan BAT gi informasjon om alvorlighetsgraden og terskelen for allergiske reaksjoner siden pasienter med mer alvorlige reaksjoner viser en større andel aktiverte basofiler, som observert i studier av peanøtt- og kumelkallergiske pasienter 84,90,91; og pasienter som reagerer på spormengder av allergenet viser en større basofil følsomhet 84,90,92. Disse dataene tyder på at BAT kan være nyttig for å identifisere høyrisikoallergiske pasienter som trenger tettere oppfølging og mer intensivert utdanning93. Videre har det blitt rapportert at BAT kan forutsi matutfordringsresponser 70,91,92,94 og terskler for reaktivitet90,95 for å avgjøre når mat kan være trygt (re) introdusert 84. Imidlertid er disse funnene kontroversielle i noen studier63,96 og mer forskning er nødvendig.
På den annen side har BAT blitt brukt til å overvåke oppløsning av matallergi, enten naturlig eller under immunmodulerende behandlinger, over tid, som til nå bare har blitt vurdert av oral matutfordring, med tilhørende risiko og kostnader 84,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106 ,107,108. Videre har det også blitt brukt til å overvåke effekten av omalizumab i matallergi da basofil aktivering avtar under behandling med omalizumab, men det øker etter avsluttet behandling109.
Allergi mot sniffestoffer BAT er sjelden gunstig ved inhalasjonsallergi, da diagnose rutinemessig kan etableres ved sIgE-kvantifisering og ST. Men i tilfeller av lokal allergisk rhinitt (uoppdagelige nivåer av sIgE og negative STs med positive nasal provokasjonstester), har BAT tillatt diagnose i 50% av tilfellene110. Det er videre rapportert en sammenheng mellom basofil sensitivitet og respons på nese/bronkial provokasjonstester, samt mellom astma alvorlighetsgrad og effekt av behandling med omalizumab111,112.
BAT har også blitt brukt til å overvåke allergenimmunterapi for husstøvmidd og pollen, da basofilfølsomheten minker under immunterapi, sannsynligvis på grunn av interferens av blokkerende IgG-antistoffer 113,114,115,116,117.
Hymenopteragift allergi Diagnostisering av hymenoptera giftallergi er rutinemessig basert på ST og serum sIgE. BAT har vist høy sensitivitet (85-100%) og spesifisitet (83-100%), og det har blitt rapportert å være nyttig i tilfeller som gir tvetydige resultater eller hos pasienter med en suggestiv klinisk historie med giftallergi, men uoppdagelig sIgE og negativ ST118,119. BAT ser imidlertid ikke ut til å være prediktiv for alvorlighetsgrad for disse reaksjonene120,121.
Opptil 60% av pasientene utviser sIgE til både veps og biegift, og identifisering av dominant allergen er avgjørende for adekvat immunterapibehandling. I disse tilfellene har BAT blitt rapportert å være nyttig i identifiseringen av det dominerende allergenet 119,122,123,124. Selv om sIgE til de viktigste allergenene av bie- og vepsegifter kan redusere nytten av BAT hos pasienter med dobbel positivitet til begge giftene, gir det nyttig informasjon hovedsakelig hos personer med negative resultater i sIgE-bestemmelser123.
Noen studier tyder på at BAT kan være nyttig som en prediktiv biomarkør for bivirkninger i oppbyggingsfasen av giftimmunterapi, da dette behandlingsalternativet har blitt rapportert å redusere basofil følsomhet. Reaktiviteten reduseres imidlertid ikke, og dette BAT-verktøyet er i dag kontroversielt 13,120,125,126,127,128,129,130.
Urtikaria og angioødem En undergruppe av kroniske urtikariapasienter har en autoinmune patofysiologi, på grunn av IgE-autoantistoffer mot autoallergener og IgG-autoantistoffer som retter seg mot FcεRI- eller IgE-FcεRI-komplekser tilstede på mastcelleoverflaten131,132. I klinisk praksis har diagnosen av denne typen kronisk urtikaria vært avhengig av positiv autolog serum ST, som har risiko for utilsiktet infeksjon. BAT har blitt foreslått som en in vitro-test for diagnostisering og overvåking av pasienter med mistanke om kronisk urtikaria. Både CD63- og CD203c-ekspresjon på overflaten av basofiler er rapportert å være økt etter stimulering med sera fra pasienter med kronisk urtikaria, som viser påvisning av aktive autoantistoffer 133,134,135,136,137. Nylig har det blitt rapportert at pasienter med positiv BAT ofte opplever den mest aktive sykdomstilstanden, vurdert ved urticaria aktivitetsscore, og krever høyere doser antihistaminer sammen med tredjelinjebehandlinger (ciklosporin A eller omalizumab), sammenlignet med de med negativ BAT138.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, without Cap, Nonsterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD193 (CCR3) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>310708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCalibur Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD63 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>353006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Solution 10x concentrated</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Formyl-Met-Leu-Phe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD203c (E-NPP3) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>324606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse Anti-Human IgE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-3</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>203-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheath Fluid</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>342003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUBE 9 mL LH Lithium Heparin</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>455084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

basophil activation test for allergy diagnosis

Basofilaktiveringstesten (BAT) er en komplementær in vitro diagnostisk test som kan brukes i tillegg til klinisk historie, hudtest (ST) og spesifikk IgE (sIgE) bestemmelse i evalueringen av IgE-medierte allergiske reaksjoner på mat, insektgift, narkotika, samt noen former for kronisk urtikaria. Denne teknikkens rolle i de diagnostiske algoritmene er imidlertid svært variabel og ikke godt bestemt.
BAT er basert på bestemmelse av basofil respons på allergen / kryssbinding av IgE-aktivering gjennom måling av aktiveringsmarkører (som CD63, CD203c) ved flowcytometri. Denne testen kan være et nyttig og komplementært verktøy for å unngå kontrollerte utfordringstester for å bekrefte allergidiagnose, spesielt hos personer som opplever alvorlige livstruende reaksjoner. Generelt bør ytelsen til BAT vurderes hvis i) allergenet / stoffet gir falske positive resultater i ST; ii) det ikke finnes noen allergen-/legemiddelkilde som skal brukes til ST- eller sIgE-bestemmelse; iii) det er uoverensstemmelse mellom pasienthistorie og ST- eller sIgE-bestemmelse; iv) symptomer tyder på at ST kan resultere i systemisk respons; v) før du vurderer en CCT for å bekrefte det skyldige allergenet / stoffet. De viktigste begrensningene i testen er relatert til ikke-optimal følsomhet, spesielt i narkotikaallergi, behovet for å utføre testen ikke lenger enn 24 timer etter prøveutvinning, og mangelen på standardisering mellom laboratorier når det gjelder prosedyrer, konsentrasjoner og cellemarkører.

BAT utført med allergener eller legemidler gjør det mulig å undersøke IgE-avhengige overfølsomhetsreaksjoner. Basofil reaktivitet bør måles i minst to optimale konsentrasjoner for å oppnå de beste resultatene34 , og aktiveringen visualiseres ved oppregulering av CD63 på celleoverflaten. I tilfelle av allergener, for å bekrefte basofilreaktiviteten, bør basofilfølsomheten analyseres ved å måle reaktiviteten ved flere avtagende allergenkonsentrasjoner114. Dette...

Watch this Scientific Journal Video about Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis at JoVE.com

Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis

Basofilaktiveringstesten er en komplementær in vitro diagnostisk test for evaluering av IgE-medierte allergiske reaksjoner basert på påvisning av basofil aktivering i nærvær av en spesifikk stimulus gjennom måling av aktiveringsmarkører ved flowcytometri.

Basofil aktiveringstest for allergidiagnose

The basophil activation test (BAT) is a complementary in vitro diagnostic test that can be used in addition to clinical history, skin test (ST), and ...

Basofilaktiveringstesten er en komplementær in vitro diagnostisk test for evaluering av IgE-medierte allergiske reaksjoner som har vist seg å være nyttige for reaksjoner indusert av narkotika, mat eller sniffestoffer, samt i noen former for kronisk urtikaria. Denne testen er basert på å bestemme basofil respons på et allergen eller stoff kryssbindende IgE-aktivering gjennom måling av aktiveringsmarkører ved flowcytometri. Basofilaktiveringstesten kan være et nyttig og gratis verktøy for å unngå kontrollerte utfordringstester for å bekrefte allergidiagnose, spesielt hos personer som opplever alvorlige livstruende reaksjoner.Videre har denne testen fordelen av å kunne analysere responsen mot ethvert stoff eller allergen sammenlignet med andre in vitro-metoder som bare er tilgjengelige for noen få stoffer og allergener. De viktigste begrensningene i testen er relatert til ikke-optimal følsomhet, spesielt i narkotikaallergi. Behovet for å utføre testen ikke lenger enn 24 timer etter prøveutvinning og mangelen på standardisering mellom laboratorier og diagnostiske algoritmer.Begynn med å samle perifert blod i ni milliliter hepariniserte rør, og legg prøvene i en rotor for å opprettholde dem ved romtemperatur til de er nødvendige for den eksperimentelle protokollen. Merk to fem milliliter cytometerrør hver for negativ kontroll og positiv kontroll. Merk også ett rør hver for de forskjellige allergen- eller stoffkonsentrasjonene som testes.Legg deretter rørene i et stativ slik at rørene passer perfekt uten å skli. For den første positive kontrollen, lag en fire mikromolær løsning av N-Formylmethionyl-leucyl-fenylalanin eller fMLP i 0,05% PBS-T For å bekrefte kvaliteten på basofiler. For den andre positive kontrollen, lag en 0, 05 milligram per milliliter anti-IgE-løsning ved bruk av PBS-T.Forbered fargeblandingen ved å tilsette en mikroliter hver av CCR3-APC-, CD203c-PE- og CD63-FITC-antistoffer per 20 mikroliter av stimuleringsbufferen. Tilsett deretter 23 mikroliter av denne fargeblandingen til hvert rør. Tilsett 100 mikroliter PBS-T til de negative kontrollrørene.Tilsett 100 mikroliter fMLP til et av de positive kontrollrørene og tilsett 100 mikroliter anti-IgE E til den andre til resten av rørene. Tilsett 100 mikroliter av de forskjellige allergen- eller stoffkonsentrasjonene og inkuber ved 37 grader Celsius i 10 minutter. Etter inkubasjon, tilsett 100 mikroliter blod til hvert rør forsiktig for å unngå hemolyse.Deretter forsiktig vortex rørene og inkuber dem i 25 minutter ved 37 grader Celsius i termostatbadet med middels agitasjon. Hold rørene ved fire grader Celsius i minst fem minutter for å stoppe degranuleringen. Til hvert rør legger du til to milliliter lysbuffer for å lyse erytrocytene.Vortex hvert rør og inkuber deretter rørene i fem minutter ved romtemperatur. Sentrifuger rørene ved 300 g ved fire grader Celsius i fem minutter. Deretter velter stativet i vasken for å dekantere supernatanten mens cellene forblir i bunnen av rørene.Tilsett tre milliliter PBS-T til hvert rør for å vaske cellene og virvle rørene. Utfør en andre runde sentrifugering ved å bruke det samme settet med parametere, og dekanter supernatanten ved å velte stativet i vasken. Hold deretter prøvene på fire grader Celsius beskyttet mot lys til flowcytometri.Koble flowcytometeret til dataprogramvaren og vent til cytometeret er klart. Last inn mal- og instrumentinnstillingene som beskrevet i tekstmanuskriptet. Start prosessen med prøveinnhenting.For å velge aktiverte basofiler, porter du først lymfocyttene fra Side Scatter-Forward Scatter-plottet. Deretter porter basofilene fra lymfocyttpopulasjonen som CCR3 + CD203c + celler og får minst 500 basofiler per rør. Sett CD63-terskelen til ca. 2,5 % ved hjelp av de negative kontrollrørene og analyser prøvene.IgE-avhengige overfølsomhetsreaksjoner ble undersøkt ved å utføre en basofil aktiveringstest, eller BAT, ved bruk av allergener og medikamenter. Basofil følsomhet ble analysert ved å måle reaktiviteten ved flere avtagende allergenkonsentrasjoner som bidrar til å bestemme den allergiske konsentrasjonen som induserer responsen på 50% basofiler eller EC50. Først ble lymfocytter inngjerdet fra siden scatter-forward scatter plot.Deretter ble basofiler inngjerdet fra lymfocyttpopulasjonen som CCR3 + CD203c + celler. Deretter ble et CCR3-CD63-plott brukt til å analysere basofil aktivering ved hjelp av CD63 som aktiveringsmarkør for to stoffer og forskjellige konsentrasjoner av et allergen. Testen utføres med friskt fullblod og må utføres ikke lenger enn 24 timer etter blodprøveutvinning.Stimulansen som brukes i testen bør ikke inneholde noen hjelpestoffer, og stoffets kjemiske egenskaper må vurderes. Andre ytterligere in vitro-metoder for diagnostisering av IgE-medierte allergiske reaksjoner, eller bestemmelse av sIgE, eller histaminfrigivelsestesten.

basophil-activation-test-for-allergy-diagnosis

Research

JoVE Journal

Medicine

FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis

Pre-implantation genetic diagnosis (PGD) is an established alternative to pre-natal diagnosis, and involves selecting pre-implantation embryos from a cohort generated by assisted reproduction technology (ART). This selection may be required because of familial monogenic disease (e.g. cystic fibrosis), or because one partner carries a chromosome rearrangement (e.g. a two-way reciprocal translocation). PGD is available for couples who have had previous affected children, and/or in the case of chromosome rearrangements, recurrent miscarriages, or infertility. Oocytes aspirated following ovarian stimulation are fertilized by in vitro immersion in semen (IVF) or by intracytoplasmic injection of an individual spermatozoon (ICSI). Pre-implantation cleavage-stage embryos are biopsied, usually by the removal of a single cell on day 3 post-fertilization, and the biopsied cell is tested to establish the genetic status of the embryo. Fluorescence in situ hybridization (FISH) on the fixed nuclei of biopsied cells with target-specific DNA probes is the technique of choice to detect chromosome imbalance associated with chromosome rearrangements, and to select female embryos in families with X-linked disease for which there is no mutation-specific test. FISH has also been used to screen embryos for spontaneous chromosome aneuploidy (also known as PGS or PGD-AS) in order to try and improve the efficiency of assisted reproduction; however, the predictive value of this test using the spreading and FISH technique described here is likely to be unacceptably low in most people's hands and it is not recommended for routine clinical use. We describe the selection of suitable probes for single-cell FISH, spreading techniques for blastomere nuclei, and in situ hybridization and signal scoring, applied to PGD in a clinical setting.

This article describes the selection of suitable probes for single-cell FISH, spreading techniques for blastomere nuclei, and in situ hybridization and signal scoring, applied to pre-implantation genetic diagnosis (PGD) in a clinical setting.

Pre-implantation genetic diagnosis (PGD) is an established alternative to pre-natal diagnosis, and involves selecting pre-implantation embryos from a ...

The Trier Social Stress Test Protocol for Inducing Psychological Stress

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting. Protocols that allow researchers to study the biological pathways of the stress response in health and disease are fundamental to the progress of research in stress and anxiety.1 Although numerous protocols exist for inducing stress response in the laboratory, many neglect to provide a naturalistic context or to incorporate aspects of social and psychological stress. Of psychological stress protocols, meta-analysis suggests that the Trier Social Stress Test (TSST) is the most useful and appropriate standardized protocol for studies of stress hormone reactivity.2 In the original description of the TSST, researchers sought to design and evaluate a procedure capable of inducing a reliable stress response in the majority of healthy volunteers.3 These researchers found elevations in heart rate, blood pressure and several endocrine stress markers in response to the TSST (a psychological stressor) compared to a saline injection (a physical stressor).3 Although the TSST has been modified to meet the needs of various research groups, it generally consists of a waiting period upon arrival, anticipatory speech preparation, speech performance, and verbal arithmetic performance periods, followed by one or more recovery periods. The TSST requires participants to prepare and deliver a speech, and verbally respond to a challenging arithmetic problem in the presence of a socially evaluative audience.3 Social evaluation and uncontrollability have been identified as key components of stress induction by the TSST.4 In use for over a decade, the goal of the TSST is to systematically induce a stress response in order to measure differences in reactivity, anxiety and activation of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) or sympathetic-adrenal-medullary (SAM) axis during the task.1 Researchers generally assess changes in self-reported anxiety, physiological measures (e.g. heart rate), and/or neuroendocrine indices (e.g. the stress hormone cortisol) in response to the TSST. Many investigators have adopted salivary sampling for stress markers such as cortisol and alpha-amylase (a marker of autonomic nervous system activation) as an alternative to blood sampling to reduce the confounding stress of blood-collection techniques. In addition to changes experienced by an individual completing the TSST, researchers can compare changes between different treatment groups (e.g. clinical versus healthy control samples) or the effectiveness of stress-reducing interventions.1

This article describes a protocol for inducing psychological stress in participants, which enables researchers to measure psychological, physiological and neuroendocrine responses to stress within single participants or between groups.

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting.  Protocols that allow researchers to study the biological ...

Transabdominal Ultrasound for Pregnancy Diagnosis in Reeves' Muntjac Deer

Reeves' muntjac deer (Muntiacus reevesi) are a small cervid species native to southeast Asia, and are currently being investigated as a potential model of prion disease transmission and pathogenesis. Vertical transmission is an area of interest among researchers studying infectious diseases, including prion disease, and these investigations require efficient methods for evaluating the effects of maternal infection on reproductive performance. Ultrasonographic examination is a well-established tool for diagnosing pregnancy and assessing fetal health in many animal species1-7, including several species of farmed cervids8-19, however this technique has not been described in Reeves' muntjac deer. Here we describe the application of transabdominal ultrasound to detect pregnancy in muntjac does and to evaluate fetal growth and development throughout the gestational period. Using this procedure, pregnant animals were identified as early as 35 days following doe-buck pairing and this was an effective means to safely monitor the pregnancy at regular intervals. Future goals of this work will include establishing normal fetal measurement references for estimation of gestational age, determining sensitivity and specificity of the technique for diagnosing pregnancy at various stages of gestation, and identifying variations in fetal growth and development under different experimental conditions.

Transabdominal Ultrasound for Pregnancy Diagnosis in Reeves&#039; Muntjac Deer

Transabdominal ultrasound is described as an effective, noninvasive means for assessing reproductive status in Reeves' muntjac deer. These methods can be used to achieve early pregnancy diagnosis and to evaluate fetal viability. Future applications of this technique include estimation of gestational age and effects of maternal disease on fetal development.

Transabdominal ultralyd for graviditetsdiagnose i Reeves' Muntjac Hjort

Reeves' muntjac deer (Muntiacus reevesi) are a small cervid species native to southeast Asia, and are currently being investigated as a potential model of ...

Diagnosis of Musculus Gastrocnemius Tightness - Key Factors for the Clinical Examination

Common foot and ankle pathologies have been linked to isolated Musculus gastrocnemius tightness (MGT). Various examination techniques have been described to assess MGT. Still, a standardized examination procedure is missing. Literature argues for weightbearing examination but the degree of knee flexion needed to eliminate the restraining effect of the M. gastrocnemius on ankle dorsiflexion (ADF) is unknown. This manuscript investigates the effect of knee flexion on ankle dorsiflexion and provides a detailed description of a standardized examination protocol. Examination on 20 healthy individuals revealed, that 20&#176; of knee flexion is sufficient to fully eliminate the influence of the M. gastrocnemius on ADF. This builds the prerequisite for a standardized examination for MGT. Non-weightbearing and weightbearing examination of ADF has to be conducted with the knee fully extended and at least 20&#176; flexed. Two investigators should conduct non-weightbearing testing with the subject in supine position. In order to obtain reliable results, the axis of the fibula should be marked. One examiner can conduct weightbearing examination with the subject in lunge stance. Isolated MGT is present if ADF is impaired with the knee fully extended and knee flexion results in a significant ADF increase. The herein presented standardized examination is the prerequisite for future studies aiming at establishing norm values.

Diagnosis of Musculus Gastrocnemius Tightness - Key Factors for the Clinical Examination

Isolated Musculus gastrocnemius tightness is a common cause for foot and ankle pathologies. Currently no standardized examination procedure exists. This manuscript demonstrates that 20 degree of knee flexion eliminates the restraining effect of the M. gastrocnemius on ankle dorsiflexion and presents a video description of a standardized examination protocol.

diagnostisering av<em&gt; Musculus Gastrocnemius</em&gt; Tetthet - Viktige faktorer for Clinical Examination

Common foot and ankle pathologies have been linked to isolated Musculus gastrocnemius tightness (MGT). Various examination techniques have been described ...

Hydra, a Computer-Based Platform for Aiding Clinicians in Cardiovascular Analysis and Diagnosis

Cardiovascular diseases (CVDs) are the leading cause of death throughout the world. The total risk of developing CVD is determined by the combined effect of different cardiovascular risk factors (e.g., diabetes, raised blood pressure, unhealthy diet, tobacco use, stress, etc.) that commonly coexist and act multiplicatively. Most CVDs can be prevented by an early identification of the highest risk factors and an appropriate treatment. The stratification of cardiovascular risk factors involves a wide range of parameters and tests that specialists use in their clinical practice. In addition to cardiovascular (CV) risk stratification, ambulatory blood pressure monitoring (ABPM) also provides relevant information for diagnostic and treatment purposes. This work presents a list of protocols based on the Hydra platform, a web-based system for clinical decision support which incorporates a set of functionalities and services that are required for complete cardiovascular analysis, risk assessment, early diagnosis, treatment and monitoring of patients over time. The program includes tools for inputting and managing comprehensive patient data, organized into different checkups to track the evolution over time. It also has a risk stratification tool to compute a CV risk factor based upon several risk stratification tables of reference. Additionally, the program includes a tool that incorporates ABPM analysis and allows the extraction of valuable information by monitoring blood pressure over a specific period of time. Finally, the reporting service summarizes the most relevant information in a set of reports that aid clinicians in their clinical decision-making process.

This article presents a protocol based on Hydra &#8212; a web-based system for clinical decision support that integrates a full and detailed set of functionalities and services required by physicians for complete cardiovascular analysis, risk assessment, early diagnosis, treatment, and monitoring over time.

Hydra, en datamaskin plattform for hjelpe klinikere hjerte analyse og diagnose

Cardiovascular diseases (CVDs) are the leading cause of death throughout the world. The total risk of developing CVD is determined by the combined effect ...

International Expert Consensus and Recommendations for Neonatal Pneumothorax Ultrasound Diagnosis and Ultrasound-guided Thoracentesis Procedure

Pneumothorax (PTX) represents accumulation of the air in the pleural space. A large or tension pneumothorax can collapse the lung and cause hemodynamic compromise, a life-threatening disorder. Traditionally, neonatal pneumothorax diagnosis has been based on clinical images, auscultation, transillumination, and chest X-ray findings. This approach may potentially lead to a delay in both diagnosis and treatment. The use of lung US in diagnosis of PTX together with US-guided thoracentesis results in earlier and more precise management. The recommendations presented in this publication are aimed at improving the application of lung US in guiding neonatal PTX diagnosis and management.

Pneumothorax is a common emergency and critical disease in newborn infants that needs rapid, clear diagnosis and timely treatment. Diagnosis and treatment based on chest X-rays are associated with delayed management and radiation damage. Lung ultrasound (US) provides useful guidance for rapid, accurate diagnosis and the precise thoracentesis of pneumothorax.

Internasjonal ekspertkonsensus og anbefalinger for neonatal pneumothorax ultralyddiagnose og ultralydstyrt Thoracentesis-prosedyre

Pneumothorax (PTX) represents accumulation of the air in the pleural space. A large or tension pneumothorax can collapse the lung and cause hemodynamic ...

Diagnosis and Surgical Treatment of Human Brucellar Spondylodiscitis

Brucellar spondylodiscitis (BS) is the most prevalent and significant osteoarticular presentation of human Brucellosis, which is commonly manifested in pastoral communities. It is difficult to differentially diagnose and usually leads to irreversible neurologic deficits and spinal deformities. The initial diagnosis of BS is based on clinical findings and radiographic assessments, and the confirmed diagnosis should be established by the isolation of Brucella species from the blood and/or the standard tube agglutination test. Differential diagnosis of multifocal BS from either degenerative disc diseases or tuberculosis is especially highlighted. The surgical approach, either endoscopic or open, is demonstrated in detail, accompanied by radiographic evidence of structural compression or severe instability. Further, the crucial surgical steps, including single-stage transforaminal decompression, debridement, interbody fusion, and internal fixation, are explained. Moreover, perioperative care and postoperative rehabilitation are also addressed. Taken together, this clinical algorithm presents a practical guide that has yielded substantially satisfactory outcomes in the past decades, which can also be introduced for large-scale application to manage human BS, especially in endemic regions.

We describe a clinical algorithm, based on decades of front-line experience of diagnosis and surgical treatment of human Brucellar spondylodiscitis in the largest medical center of the China's Xinjiang Pastoral Area.

Diagnose og kirurgisk behandling av human Brucellar Spondylodiscitis

Brucellar spondylodiscitis (BS) is the most prevalent and significant osteoarticular presentation of human Brucellosis, which is commonly manifested in ...

Testing Acetylcholine Followed by Adenosine for Invasive Diagnosis of Coronary Vasomotor Disorders

More than 50% of patients with signs and symptoms of myocardial ischemia undergoing coronary angiography have unobstructed coronary arteries. Coronary vasomotor disorders (impaired vasodilatation and/or enhanced vasoconstriction/spasm) represent important functional causes for such a clinical presentation. Although impaired vasodilatation may be assessed with non-invasive techniques such as positron emission tomography or cardiac magnetic resonance imaging, there is currently no reliable non-invasive technique for the diagnosis of coronary spasm available. Thus, invasive diagnostic procedures (IDP) have been developed for the diagnosis of coronary vasomotor disorders including spasm testing as well as assessment of coronary vasodilatation. The identification of the underlying type of disorder (so called endotype) allows the initiation of targeted pharmacological treatments. Despite the fact that such an approach is recommended by the current European Society of Cardiology guidelines for the management of chronic coronary syndromes based on the CorMicA study, comparability of results as well as multicenter trials are currently hampered by major differences in institutional protocols for coronary functional testing. This article describes a comprehensive IDP protocol including intracoronary acetylcholine provocation testing for diagnosis of epicardial/microvascular spasm, followed by Doppler wire-based assessment of coronary flow reserve (CFR) and hyperemic microvascular resistance (HMR) in search of coronary vasodilatory impairment.

Coronary vasomotion disorders represent frequent functional causes of angina in patients with unobstructed coronaries. The underlying mechanism of angina (endotype) in these patients can be determined by a comprehensive invasive diagnostic procedure based on acetylcholine provocation testing followed by Doppler-derived assessment of the coronary flow reserve and microvascular resistance.

Testing av acetylkolin etterfulgt av adenosin for invasiv diagnose av koronar vasomotoriske lidelser

More than 50% of patients with signs and symptoms of myocardial ischemia undergoing coronary angiography have unobstructed coronary arteries. Coronary ...

Measurement of Myocardial Lactate Production for Diagnosis of Coronary Microvascular Spasm

In about a quarter of patients with angina and non-obstructive coronary arteries, no epicardial spasm is noted on coronary arteriography during an angina attack. Since the pressure-rate product is almost identical at rest and the onset of attack in those patients, the decrease in coronary blood flow rather than increased myocardial oxygen consumption is likely to explain myocardial ischemia, indicating a substantial involvement with coronary microvascular spasm (MVS). Myocardial lactate production, which could be defined as a negative myocardial lactate extraction ratio (ratio of the coronary arterial-venous difference in lactate concentration to arterial concentration), is considered indicative of objective evidence to support the emerging myocardial ischemia. Thus, monitoring of the myocardial lactate production and the emergence of chest pain and ischemic electrocardiographic changes during acetylcholine (ACh) provocation testing is of significant value for detecting the entity of MVS. Practically, 1 min after incremental doses of ACh (20, 50, and 100 &#956;g) are administered into the left coronary artery (LCA), paired samples of 1 mL of blood are collected from the LCA ostium and coronary sinus for measurement of lactate concentration by a calibrated automatic lactate analyzer. Then, the development of MVS could be confirmed by negative myocardial lactate extraction ratio despite the absence of angiographically demonstrable epicardial coronary spasm or before its occurrence throughout ACh provocation testing. In conclusion, assessment of myocardial lactate production is essential and valuable for the diagnosis of MVS.

Myocardial lactate production (coronary arterial-venous difference in serum lactate level) during coronary spasm provocation testing is considered as a highly sensitive marker that reflects acetylcholine-induced myocardial ischemia due to microvascular spasm. This article presents the procedures to assess myocardial lactate production for the diagnosis of coronary microvascular spasm.

Måling av myokardlaktatproduksjon for diagnostisering av koronar mikrovaskulær spasme

In about a quarter of patients with angina and non-obstructive coronary arteries, no epicardial spasm is noted on coronary arteriography during an angina ...

High-speed Video Microscopy Analysis for First-line Diagnosis of Primary Ciliary Dyskinesia

Primary ciliary dyskinesia (PCD) is a congenital disorder predominantly inherited in an autosomal recessive trait. The disorder causes disturbance in the motion of cilia, leading to severe impairment of mucociliary clearance (MCC). If undiagnosed or diagnosed too late, the condition leads to the development of bronchiectasis and serious damage to the lungs in later life. Most of the methods for diagnosing PCD are time-consuming and demand extensive economic resources to establish them. High-speed video microscopy analysis (HSVMA) is the only diagnostic tool to visualize and analyze living respiratory cells with beating cilia in vitro. It is fast, cost-effective, and, in experienced hands, very reliable as a diagnostic tool for PCD. In addition, classical diagnostic measures such as transmission electron microscopy (TEM) are not applicable for some mutations as morphological changes are absent. 
This paper describes the process of collecting respiratory epithelial cells, the further preparation of the specimen, and the process of HSVMA. We also describe how brushed cells can be successfully kept unharmed and beating by keeping them in a nourishing medium for storage and transport to the investigation site in cases where a clinic does not possess the equipment to perform HSVMA. Also shown are videos with pathologic beating patterns from patients with a mutation in the dynein arm heavy chain 11 gene (DNAH11), which cannot be diagnosed with TEM; the result of an inconclusive HSVMA due to infection of the upper airways, as well as an unsuccessful brushing with superimposition of red blood cells. With this article, we would like to encourage every unit dealing with pulmonology patients and rare lung diseases to perform HSVMA as part of their daily routine diagnostics for PCD or send the specimens over to a center specializing in performing HSVMA.

High-speed video microscopy analysis is a relatively easy-to-perform, fast, cost-effective, and, in experienced hands, a considerably reliable tool for first-line diagnostics of primary ciliary dyskinesia, which should be available in every center involved in diagnostics and the treatment of severe lung diseases.

Høyhastighets videomikroskopianalyse for førstelinjediagnose av primær ciliary dyskinesi

Primary ciliary dyskinesia (PCD) is a congenital disorder predominantly inherited in an autosomal recessive trait. The disorder causes disturbance in the ...