Name: basophil activation test for allergy diagnosis
Uploaded: 2021-05-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis at JoVE.com

Agradecemos a Claudia Corazza por seu inestimável suporte em inglês. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto de Saúde ''Carlos III'' (ISCIII) do MINECO (subvenção co-financiada pelo FEDER: "Una manera de hacer Europa"; Subvenções n.º PI20/01715; PI18/00095; PI17/01410; PI17/01318; PI17/01237 e RETIC ARADYAL RD16/0006/0001; Ministério Regional da Saúde da Andaluzia (Grant Nos. PI-0127-2020, PIO-0176-2018; PE-0172-2018; PE-0039-2018; PC-0098-2017; PI-0075-2017; PI-0241-2016). A ID é Investigadora Clínica (B-0001-2017) e a AA detém um Contrato de Pós-Doutoramento Sénior (RH-0099-2020), ambos apoiados pelo Ministério Regional da Saúde da Andaluzia (cofinanciado pelo FSE: "Andalucía se mueve con Europa").

O desempenho do protocolo foi conduzido de acordo com os princípios da Declaração de Helsínquia e aprovado pelo Comité de Ética para la Investigación Provincial de Málaga, Espanha. Todos os sujeitos foram informados oralmente sobre o estudo de pesquisa e assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido correspondente.
NOTA: O presente protocolo detalha o procedimento BAT que os autores usam diariamente. No entanto, este não é um método padronizado e existem diferença...

A MTD é um teste complementar de diagnóstico in vitro para a avaliação de reações alérgicas mediadas por IgE que tem se mostrado útil no diagnóstico de reações induzidas por diferentes gatilhos, como medicamentos, alimentos ou inalantes, bem como em algumas formas de urticária crônica. Em geral, o desempenho das MTD deve ser considerado se i) o alérgeno/fármaco produzir resultados falso-positivos no TS; ii) o alérgeno/fármaco não está disponível para ser utilizado para quantificação de ST o...

O diagnóstico de alergia mediada por IgE é baseado na história clínica, testes cutâneos (STs), quantificação de IgE sérica específica (sIgE) e, se necessário e indicado, testes de desafio controlado (CCTs)1,2,3,4,5,6. No entanto, a história clínica pode não ser confiável, uma vez que pode haver falta de informações precisas, e STs e CCTs não são procedimentos isentos de risco que podem ser contraindicados em indivíduos com reações graves com risco de vida 1,2,3,4,5,6 . Essas questões, juntamente com o fato de que a determinação de sIgE por imunoensaios fluoroenzimáticos validados e comerciais só está disponível para poucos alérgenos e drogas, destacaram o importante papel de outros ensaios funcionais in vitro, como o teste de ativação basófila (BAT).
Os basófilos são células-chave efetoras envolvidas em reações alérgicas mediadas por IgE que são ativadas após a reticulação de sIgE adjacente ligada a receptores de alta afinidade (FcεRI) na superfície celular após exposição a alérgenos/medicamentos. A ativação basófila desencadeia a degranulação celular e a liberação de mediadores inflamatórios pré-formados e novos sintetizados contidos nos grânulos de secreção intracitoplasmática 7,8,9. A MTD é um método in vitro que tenta mimetizar a ativação basófila na presença de um estímulo (alérgeno ou droga) e determina alterações na expressão de marcadores de ativação basófila por citometria de fluxo 7,10. Existem diferentes estratégias para identificar basófilos (IgE+, CCR3+, CRTH2+, CD203c+) e medir a ativação celular (principalmente regulação positiva de CD63 e CD203c) usando combinações de anticorpos marcados com fluorocromo 7,10. O CD63, o melhor marcador de ativação clinicamente validado 11,12,13,14, é uma proteína de membrana ancorada nos grânulos secretores contendo histamina que, após ativação celular e fusão dos grânulos com a membrana, é expressa na superfície basófila 15,16,17,18,19,20,21 . CD203c é um marcador de superfície que é expresso constitutivamente em basófilos e regulado positivamente após a estimulação de FcεRI, que também mostrou resultados confiáveis em MTD 15,22,23,24,25. Além disso, parece co-expressar com CD6326.
Nas últimas décadas, o MTD tem se mostrado útil no diagnóstico de reações alérgicas mediadas por IgE induzidas por diferentes gatilhos, como medicamentos, alimentos ou inalantes, bem como em algumas formas de urticária crônica, conforme descrito a seguir. No entanto, a posição desta técnica nos algoritmos de diagnóstico é altamente variável e não bem determinada.
Hipersensibilidade a medicamentos A MTD tem se mostrado útil como exame complementar para medicamentos e pacientes selecionados, particularmente para aqueles que apresentam reações graves, devido ao fato de que o valor diagnóstico do TS não está bem estabelecido para a maioria dos medicamentos, pois são validados e padronizados para um número limitado de medicamentos27,28,29,30. Além disso, a quantificação de sIgE está disponível apenas para um número limitado de fármacos, com menor sensibilidade que o ST 27,28,29,30,31,32. Portanto, o diagnóstico de hipersensibilidade medicamentosa geralmente depende do teste de provocação medicamentosa, que pode ser contraindicado em indivíduos que apresentam reações graves com risco de vida33.
Resultados promissores têm sido relatados para o uso de MTD em pacientes selecionados que relataram reações de hipersensibilidade imediata a diferentes fármacos como betalactâmicos (BLs)20,34,35,36,37,38,39, agentes bloqueadores neuromusculares (NMBAs)19,22,40,41,42, 43,44,45, fluoroquinolonas (FQs)46,47,48,49, pirazolonas 50,51,52, meios de radiocontraste (RCM)53,54,55,56 e compostos de platina 57,58,59 . Foi relatado que a MTD tem uma sensibilidade e especificidade entre 51,7-66,9% e 89,2-97,8%, respectivamente; e os valores preditivos positivo e negativo variam entre 93,4% e 66,3%, respectivamente27,31. Além disso, o MTD tem sido proposto como um biomarcador preditivo para reações de avanço durante a dessensibilização com compostos de platina, uma vez que a expressão de CD203c é aumentada em comparação com CD63 em pacientes com alto risco de reações adversas durante a dessensibilização medicamentosa57.
É de notar que o MTD só é útil na hipersensibilidade a medicamentos quando a reação envolve degranulação basófila; portanto, não é útil em reações resultantes da inibição enzimática da ciclooxigenase 142.
Alergia alimentar A MTD emergiu como uma potencial ferramenta diagnóstica para alergia alimentar, pois a determinação de sIgE sérica para todo o extrato alergênico ou alérgenos únicos é muitas vezes ambígua, exigindo desafio alimentar oral para confirmar o diagnóstico, o que, da mesma forma que a hipersensibilidade a medicamentos, é um procedimento caro e não isento de risco60. Vários estudos têm mostrado resultados relevantes com leite de vaca 61,62, ovo 61,63, trigo 64,65,66,67,68, amendoim 63,69,70,71,72, avelã 73,74,75,76 ,77, marisco78, pêssego 79,80,81, maçã21, aipo e cenoura 82,83.
O principal valor agregado da MTD no diagnóstico de alergia alimentar em comparação com STs e sIgE no soro é que ela apresenta maior especificidade e sensibilidade semelhante. Assim, a MTD é uma ferramenta útil para diferenciar pacientes clinicamente alérgicos de indivíduos sensibilizados, mas tolerantes, que apresentam alta especificidade (75-100%) e sensibilidade (77-98%)63,69,84. Os valores de sensibilidade e especificidade dependem do alérgeno e de outros fatores como fenótipos (por exemplo, síndrome de alergia oral versus anafilaxia), idade e padrões de sensibilização relacionados à geografia63,85.
A MTD usando componentes alergênicos únicos pode potencialmente melhorar a precisão diagnóstica para alguns alérgenos alimentares61,80. Existem estudos utilizando proteínas de armazenamento de sementes (por exemplo, Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3 e Ara h 6 do amendoim)86; proteínas de transferência lipídica (por exemplo, Pru p 3 do pêssego e Ara h 9 do amendoim)80,86; e Bet v 1 homólogos (por exemplo, Ara h 8 de amendoim)87. Outras utilidades potenciais estão relacionadas à identificação do alérgeno culpado em casos de síndrome de alergia alimentar ao pólen 21,87,88, alergia à carne vermelha 89 ou anafilaxia induzida por exercício dependente de alimentos66.
Curiosamente, a MTD pode fornecer informações sobre a gravidade e o limiar das reações alérgicas, uma vez que pacientes com reações mais graves apresentam maior proporção de basófilos ativados, como observado em estudos com pacientes alérgicos ao amendoim e ao leite de vaca 84,90,91; e os pacientes que reagem a vestígios do alérgeno apresentam maior sensibilidade basófila 84,90,92. Esses dados sugerem que a MTD pode ser útil para identificar pacientes alérgicos de alto risco que necessitam de acompanhamento mais próximo e educação mais intensificada93. Além disso, tem sido relatado que a MTD pode prever respostas de desafio alimentar 70,91,92,94 e limiares de reatividade90,95 para ajudar a determinar quando os alimentos podem ser (re)introduzidos com segurança 84. No entanto, esses achados são controversos em alguns estudos63,96 e mais pesquisas são necessárias.
Por outro lado, a MTD tem sido utilizada para monitorar a resolução da alergia alimentar, seja naturalmente ou sob tratamentos imunomoduladores, ao longo do tempo, que até o momento só tem sido avaliada por desafio alimentar oral, com os riscos e custos associados 84,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106 ,107,108. Além disso, também tem sido usado para monitorar o efeito do omalizumabe na alergia alimentar, pois a ativação basofílica diminui durante o tratamento com omalizumabe, mas aumenta após a cessação do tratamento109.
Alergia a inalantes A MTD raramente é benéfica na alergia inalatória, pois o diagnóstico pode ser rotineiramente estabelecido pela quantificação de sIgE e ST. Entretanto, nos casos de rinite alérgica local (níveis indetectáveis de sIgE e STs negativos com testes de provocação nasal positivos), a MTD permitiu o diagnóstico em 50% dos casos110. Foi ainda relatada uma correlação entre a sensibilidade basofílica e a resposta aos testes de provocação nasal/brônquica, bem como entre a gravidade da asma e a eficácia do tratamento com omalizumabe111,112.
A MTD também tem sido usada para monitorar a imunoterapia alergênica para ácaros e pólenes da poeira doméstica, uma vez que a sensibilidade basófila diminui durante a imunoterapia, provavelmente devido à interferência dos anticorpos IgG bloqueadores 113,114,115,116,117.
Alergia ao veneno de himenópteros O diagnóstico de alergia ao veneno de himenópteros é rotineiramente baseado em ST e sIgE sérica. A MTD mostrou alta sensibilidade (85-100%) e especificidade (83-100%) e tem sido relatada como útil em casos que produzem resultados equívocos ou em pacientes com história clínica sugestiva de alergia ao veneno, mas sIgE indetectável e ST118,119 negativos. No entanto, a MTD parece não ser preditiva de gravidade para essas reações120,121.
Até 60% dos pacientes apresentam sIgE tanto para o veneno de vespa quanto de abelha, e a identificação de alérgeno dominante é crucial para o tratamento adequado da imunoterapia. Nesses casos, a MTD tem sido relatada como útil na identificação do alérgeno dominante 119,122,123,124. Embora a sIgE para os principais alérgenos dos venenos de abelha e vespa possa reduzir a utilidade da MTD em pacientes com dupla positividade para ambos os venenos, ela fornece informações úteis principalmente em indivíduos com resultados negativos nas determinações de sIgE123.
Alguns estudos sugerem que o MTD pode ser útil como um biomarcador preditivo para efeitos colaterais durante a fase de acúmulo de imunoterapia com veneno, uma vez que essa opção de tratamento tem sido relatada para diminuir a sensibilidade basófila. No entanto, a reatividade não diminui e essa utilidade MTD é hoje controversa 13.120.125.126.127.128.129.130.
Urticária e angioedema Um subconjunto de pacientes com urticária crônica apresenta fisiopatologia autoinsumível, devido a autoanticorpos IgE para autoalérgenos e autoanticorpos IgG que têm como alvo complexos FcεRI ou IgE-FcεRI presentes na superfície dos mastócitos131,132. Na prática clínica, o diagnóstico desse tipo de urticária crônica tem se baseado no ST sérico autólogo positivo, que apresenta risco de infecção acidental. A MTD tem sido proposta como um teste in vitro para diagnosticar e monitorar pacientes com suspeita de urticária crônica. Foi relatado que a expressão de CD63 e CD203c na superfície dos basófilos está aumentada após a estimulação com soros de pacientes com urticária crônica, mostrando a detecção de autoanticorpos ativos 133,134,135,136,137. Recentemente, tem sido relatado que pacientes com MTD positiva frequentemente experimentam o estado de doença mais ativo, avaliado pelo escore de atividade da urticária, e requerem doses mais altas de anti-histamínicos juntamente com tratamentos de terceira linha (ciclosporina A ou omalizumabe), em comparação com aqueles com MTD138 negativos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, without Cap, Nonsterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD193 (CCR3) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>310708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCalibur Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD63 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>353006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Solution 10x concentrated</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Formyl-Met-Leu-Phe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD203c (E-NPP3) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>324606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse Anti-Human IgE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-3</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>203-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheath Fluid</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>342003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUBE 9 mL LH Lithium Heparin</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>455084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

basophil activation test for allergy diagnosis

O teste de ativação basofílica (BAT) é um teste complementar de diagnóstico in vitro que pode ser usado além da história clínica, teste cutâneo (ST) e determinação específica de IgE (sIgE) na avaliação de reações alérgicas mediadas por IgE a alimentos, veneno de inseto, drogas, bem como algumas formas de urticária crônica. No entanto, o papel dessa técnica nos algoritmos de diagnóstico é altamente variável e não bem determinado.
A MTD baseia-se na determinação da resposta basófila à ativação de IgE de ligação transfronteiriça alérgeno/fármaco através da medição de marcadores de ativação (como CD63, CD203c) por citometria de fluxo. Este teste pode ser uma ferramenta útil e complementar para evitar testes de desafio controlados para confirmar o diagnóstico de alergia, especialmente em indivíduos que experimentam reações graves com risco de vida. Em geral, o desempenho da MTD deve ser considerado se i) o alérgeno/fármaco produzir resultados falso-positivos no TS; ii) não há fonte de alérgeno/fármaco a ser utilizada para determinação de ST ou sIgE; iii) há discordância entre a história do paciente e a determinação de ST ou sIgE; iv) os sintomas sugerem que o TS pode resultar em resposta sistêmica; v) antes de considerar uma TCC para confirmar o alérgeno/droga culpado. As principais limitações do teste estão relacionadas à sensibilidade não ótima, principalmente na alergia a medicamentos, à necessidade de realizar o teste não mais de 24 h após a extração da amostra e à falta de padronização entre os laboratórios em termos de procedimentos, concentrações e marcadores celulares.

A MTD realizada com alérgenos ou drogas permite a investigação de reações de hipersensibilidade dependentes de IgE. A reatividade basófila deve ser medida em pelo menos duas concentrações ótimas, a fim de obter os melhores resultados34 e a ativação é visualizada pela regulação positiva do CD63 na superfície celular. No caso dos alérgenos, além disso, para confirmar a reatividade basófila, a sensibilidade basófila deve ser analisada medindo-se a reatividade em múltiplas concentr...

Watch this Scientific Journal Video about Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis at JoVE.com

Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis

O teste de ativação basófila é um teste complementar de diagnóstico in vitro para a avaliação de reações alérgicas mediadas por IgE com base na detecção de ativação basofílica na presença de um estímulo específico através da medida de marcadores de ativação por citometria de fluxo.

Teste de ativação basófila para diagnóstico de alergia

The basophil activation test (BAT) is a complementary in vitro diagnostic test that can be used in addition to clinical history, skin test (ST), and ...

O teste de ativação basófila é um teste de diagnóstico in vitro complementar para a avaliação de reações alérgicas mediadas por IgE que se mostraram úteis para reações induzidas por drogas, alimentos ou inalantes, bem como em algumas formas de urticária crônica. Este teste baseia-se na determinação da resposta basófila a uma ativação de IgE de ligação cruzada de alérgenos ou fármacos através da medição de marcadores de ativação por citometria de fluxo. O teste de ativação basófilo pode ser uma ferramenta útil e complementar para evitar testes de desafio controlados para confirmar o diagnóstico de alergia, especialmente em indivíduos que experimentam reações graves com risco de vida.Além disso, este teste tem a vantagem de ser capaz de analisar a resposta contra qualquer droga ou alérgeno em comparação com outros métodos in vitro que só estão disponíveis para alguns medicamentos e alérgenos. As principais limitações do teste estão relacionadas à sensibilidade não ótima, especialmente na alergia a medicamentos. A necessidade de realizar o teste não mais de 24 horas após a extração da amostra e a falta de padronização entre laboratórios e algoritmos de diagnóstico.Comece coletando sangue periférico em tubos heparinizados de nove mililitros e coloque as amostras em um rotor para mantê-las à temperatura ambiente até que sejam necessárias para o protocolo experimental. Rotule dois tubos de citômetro de cinco mililitros cada para controle negativo e controle positivo. Também rotule um tubo cada para as diferentes concentrações de alérgenos ou drogas que estão sendo testadas.Em seguida, coloque os tubos em um rack para que os tubos se encaixem perfeitamente sem escorregar. Para o primeiro controle positivo, preparar uma solução micromolar de N-Formilmetionil-leucil-fenilalanina ou fMLP em 0,05%PBS-T Para confirmar a qualidade dos basófilos. Para o segundo controle positivo, prepare uma solução anti-IgE de 0,05 miligramas por mililitro usando PBS-T.Prepare a mistura de coloração adicionando um microlitro cada de anticorpos CCR3-APC, CD203c-PE e CD63-FITC por 20 microlitros do tampão de estimulação. Em seguida, adicione 23 microlitros desta mistura de coloração a cada tubo. Adicione 100 microlitros de PBS-T aos tubos de controle negativo.Adicione 100 microlitros de fMLP a um dos tubos de controle positivo e adicione 100 microlitros de anti-IgE E ao outro ao resto dos tubos. Adicione 100 microlitros das diferentes concentrações de alérgenos ou drogas e incube a 37 graus Celsius por 10 minutos. Após a incubação, adicione 100 microlitros de sangue a cada tubo suavemente para evitar a hemólise.Em seguida, suavemente vórtice os tubos e incube-os por 25 minutos a 37 graus Celsius no banho termostático com agitação média. Mantenha os tubos a quatro graus Celsius por pelo menos cinco minutos para parar a degranulação. Para cada tubo, adicione dois mililitros de tampão lisante para lisar os eritrócitos.Vórtice cada tubo e, em seguida, incubar os tubos por cinco minutos à temperatura ambiente. Centrifugar os tubos a 300 g a quatro graus Celsius durante cinco minutos. Em seguida, vire o rack para a pia para decantar o sobrenadante enquanto as células permanecem no fundo dos tubos.Adicione três mililitros de PBS-T a cada tubo para lavar as células e vórtice os tubos. Execute uma segunda rodada de centrifugação usando o mesmo conjunto de parâmetros e decante o sobrenadante derrubando o rack na pia. Em seguida, mantenha as amostras a quatro graus Celsius protegidas da luz até a citometria de fluxo.Conecte o citômetro de fluxo ao software do computador e aguarde até que o citômetro esteja pronto. Carregue as configurações do modelo e do instrumento conforme descrito no manuscrito do texto. Inicie o processo de aquisição da amostra.Para selecionar basófilos ativados, primeiro, pare os linfócitos do gráfico de dispersão lateral-para frente. Em seguida, pegue os basófilos da população de linfócitos como CCR3 + CD203c + células e adquira pelo menos 500 basófilos por tubo. Defina o limiar de CD63 para aproximadamente 2,5% usando os tubos de controle negativo e analise as amostras.As reações de hipersensibilidade dependentes de IgE foram investigadas através da realização de um teste de ativação basófilo, ou BAT, usando alérgenos e drogas. A sensibilidade basófila foi analisada medindo-se a reatividade em múltiplas concentrações decrescentes de alérgenos que ajudam a determinar a concentração alérgica que induz a resposta de 50% de basófilos ou CE50. Primeiro, os linfócitos foram fechados a partir do gráfico de dispersão lateral de dispersão para a frente.Em seguida, os basófilos foram isolados da população de linfócitos como células CCR3+CD203c+. Em seguida, um gráfico de CCR3-CD63 foi usado para analisar a ativação basófila usando CD63 como marcador de ativação para duas drogas e diferentes concentrações de um alérgeno. O teste é realizado com sangue total fresco e deve ser realizado não mais de 24 horas após a extração do sangue.O estímulo utilizado no teste não deve incluir excipientes e as características químicas dos fármacos precisam ser consideradas. Outros métodos in vitro adicionais para o diagnóstico de reações alérgicas mediadas por IgE, ou a determinação de sIgE, ou o teste de liberação de histamina.

basophil-activation-test-for-allergy-diagnosis

Research

JoVE Journal

Medicine

FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis

Pre-implantation genetic diagnosis (PGD) is an established alternative to pre-natal diagnosis, and involves selecting pre-implantation embryos from a cohort generated by assisted reproduction technology (ART). This selection may be required because of familial monogenic disease (e.g. cystic fibrosis), or because one partner carries a chromosome rearrangement (e.g. a two-way reciprocal translocation). PGD is available for couples who have had previous affected children, and/or in the case of chromosome rearrangements, recurrent miscarriages, or infertility. Oocytes aspirated following ovarian stimulation are fertilized by in vitro immersion in semen (IVF) or by intracytoplasmic injection of an individual spermatozoon (ICSI). Pre-implantation cleavage-stage embryos are biopsied, usually by the removal of a single cell on day 3 post-fertilization, and the biopsied cell is tested to establish the genetic status of the embryo. Fluorescence in situ hybridization (FISH) on the fixed nuclei of biopsied cells with target-specific DNA probes is the technique of choice to detect chromosome imbalance associated with chromosome rearrangements, and to select female embryos in families with X-linked disease for which there is no mutation-specific test. FISH has also been used to screen embryos for spontaneous chromosome aneuploidy (also known as PGS or PGD-AS) in order to try and improve the efficiency of assisted reproduction; however, the predictive value of this test using the spreading and FISH technique described here is likely to be unacceptably low in most people's hands and it is not recommended for routine clinical use. We describe the selection of suitable probes for single-cell FISH, spreading techniques for blastomere nuclei, and in situ hybridization and signal scoring, applied to PGD in a clinical setting.

This article describes the selection of suitable probes for single-cell FISH, spreading techniques for blastomere nuclei, and in situ hybridization and signal scoring, applied to pre-implantation genetic diagnosis (PGD) in a clinical setting.

FISH para diagnóstico pré-implantação Genética

Pre-implantation genetic diagnosis (PGD) is an established alternative to pre-natal diagnosis, and involves selecting pre-implantation embryos from a ...

Medicina

The Trier Social Stress Test Protocol for Inducing Psychological Stress

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting. Protocols that allow researchers to study the biological pathways of the stress response in health and disease are fundamental to the progress of research in stress and anxiety.1 Although numerous protocols exist for inducing stress response in the laboratory, many neglect to provide a naturalistic context or to incorporate aspects of social and psychological stress. Of psychological stress protocols, meta-analysis suggests that the Trier Social Stress Test (TSST) is the most useful and appropriate standardized protocol for studies of stress hormone reactivity.2 In the original description of the TSST, researchers sought to design and evaluate a procedure capable of inducing a reliable stress response in the majority of healthy volunteers.3 These researchers found elevations in heart rate, blood pressure and several endocrine stress markers in response to the TSST (a psychological stressor) compared to a saline injection (a physical stressor).3 Although the TSST has been modified to meet the needs of various research groups, it generally consists of a waiting period upon arrival, anticipatory speech preparation, speech performance, and verbal arithmetic performance periods, followed by one or more recovery periods. The TSST requires participants to prepare and deliver a speech, and verbally respond to a challenging arithmetic problem in the presence of a socially evaluative audience.3 Social evaluation and uncontrollability have been identified as key components of stress induction by the TSST.4 In use for over a decade, the goal of the TSST is to systematically induce a stress response in order to measure differences in reactivity, anxiety and activation of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) or sympathetic-adrenal-medullary (SAM) axis during the task.1 Researchers generally assess changes in self-reported anxiety, physiological measures (e.g. heart rate), and/or neuroendocrine indices (e.g. the stress hormone cortisol) in response to the TSST. Many investigators have adopted salivary sampling for stress markers such as cortisol and alpha-amylase (a marker of autonomic nervous system activation) as an alternative to blood sampling to reduce the confounding stress of blood-collection techniques. In addition to changes experienced by an individual completing the TSST, researchers can compare changes between different treatment groups (e.g. clinical versus healthy control samples) or the effectiveness of stress-reducing interventions.1

This article describes a protocol for inducing psychological stress in participants, which enables researchers to measure psychological, physiological and neuroendocrine responses to stress within single participants or between groups.

O Trier Protocolo de teste de estresse social para induzir Estresse Psicológico

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting.  Protocols that allow researchers to study the biological ...

Transabdominal Ultrasound for Pregnancy Diagnosis in Reeves' Muntjac Deer

Reeves' muntjac deer (Muntiacus reevesi) are a small cervid species native to southeast Asia, and are currently being investigated as a potential model of prion disease transmission and pathogenesis. Vertical transmission is an area of interest among researchers studying infectious diseases, including prion disease, and these investigations require efficient methods for evaluating the effects of maternal infection on reproductive performance. Ultrasonographic examination is a well-established tool for diagnosing pregnancy and assessing fetal health in many animal species1-7, including several species of farmed cervids8-19, however this technique has not been described in Reeves' muntjac deer. Here we describe the application of transabdominal ultrasound to detect pregnancy in muntjac does and to evaluate fetal growth and development throughout the gestational period. Using this procedure, pregnant animals were identified as early as 35 days following doe-buck pairing and this was an effective means to safely monitor the pregnancy at regular intervals. Future goals of this work will include establishing normal fetal measurement references for estimation of gestational age, determining sensitivity and specificity of the technique for diagnosing pregnancy at various stages of gestation, and identifying variations in fetal growth and development under different experimental conditions.

Transabdominal Ultrasound for Pregnancy Diagnosis in Reeves&#039; Muntjac Deer

Transabdominal ultrasound is described as an effective, noninvasive means for assessing reproductive status in Reeves' muntjac deer. These methods can be used to achieve early pregnancy diagnosis and to evaluate fetal viability. Future applications of this technique include estimation of gestational age and effects of maternal disease on fetal development.

Ultrassom transabdominal para diagnóstico de gravidez no Cervo Muntjac de Reeves

Reeves' muntjac deer (Muntiacus reevesi) are a small cervid species native to southeast Asia, and are currently being investigated as a potential model of ...

Diagnosis of Musculus Gastrocnemius Tightness - Key Factors for the Clinical Examination

Common foot and ankle pathologies have been linked to isolated Musculus gastrocnemius tightness (MGT). Various examination techniques have been described to assess MGT. Still, a standardized examination procedure is missing. Literature argues for weightbearing examination but the degree of knee flexion needed to eliminate the restraining effect of the M. gastrocnemius on ankle dorsiflexion (ADF) is unknown. This manuscript investigates the effect of knee flexion on ankle dorsiflexion and provides a detailed description of a standardized examination protocol. Examination on 20 healthy individuals revealed, that 20&#176; of knee flexion is sufficient to fully eliminate the influence of the M. gastrocnemius on ADF. This builds the prerequisite for a standardized examination for MGT. Non-weightbearing and weightbearing examination of ADF has to be conducted with the knee fully extended and at least 20&#176; flexed. Two investigators should conduct non-weightbearing testing with the subject in supine position. In order to obtain reliable results, the axis of the fibula should be marked. One examiner can conduct weightbearing examination with the subject in lunge stance. Isolated MGT is present if ADF is impaired with the knee fully extended and knee flexion results in a significant ADF increase. The herein presented standardized examination is the prerequisite for future studies aiming at establishing norm values.

Diagnosis of Musculus Gastrocnemius Tightness - Key Factors for the Clinical Examination

Isolated Musculus gastrocnemius tightness is a common cause for foot and ankle pathologies. Currently no standardized examination procedure exists. This manuscript demonstrates that 20 degree of knee flexion eliminates the restraining effect of the M. gastrocnemius on ankle dorsiflexion and presents a video description of a standardized examination protocol.

diagnóstico de<em&gt; Musculus Gastrocnemius</em&gt; Aperto - fatores-chave para o exame clínico

Common foot and ankle pathologies have been linked to isolated Musculus gastrocnemius tightness (MGT). Various examination techniques have been described ...

Hydra, a Computer-Based Platform for Aiding Clinicians in Cardiovascular Analysis and Diagnosis

Cardiovascular diseases (CVDs) are the leading cause of death throughout the world. The total risk of developing CVD is determined by the combined effect of different cardiovascular risk factors (e.g., diabetes, raised blood pressure, unhealthy diet, tobacco use, stress, etc.) that commonly coexist and act multiplicatively. Most CVDs can be prevented by an early identification of the highest risk factors and an appropriate treatment. The stratification of cardiovascular risk factors involves a wide range of parameters and tests that specialists use in their clinical practice. In addition to cardiovascular (CV) risk stratification, ambulatory blood pressure monitoring (ABPM) also provides relevant information for diagnostic and treatment purposes. This work presents a list of protocols based on the Hydra platform, a web-based system for clinical decision support which incorporates a set of functionalities and services that are required for complete cardiovascular analysis, risk assessment, early diagnosis, treatment and monitoring of patients over time. The program includes tools for inputting and managing comprehensive patient data, organized into different checkups to track the evolution over time. It also has a risk stratification tool to compute a CV risk factor based upon several risk stratification tables of reference. Additionally, the program includes a tool that incorporates ABPM analysis and allows the extraction of valuable information by monitoring blood pressure over a specific period of time. Finally, the reporting service summarizes the most relevant information in a set of reports that aid clinicians in their clinical decision-making process.

This article presents a protocol based on Hydra &#8212; a web-based system for clinical decision support that integrates a full and detailed set of functionalities and services required by physicians for complete cardiovascular analysis, risk assessment, early diagnosis, treatment, and monitoring over time.

Hydra, uma plataforma baseada em computador para auxiliar os médicos no diagnóstico e análise Cardiovascular

Cardiovascular diseases (CVDs) are the leading cause of death throughout the world. The total risk of developing CVD is determined by the combined effect ...

International Expert Consensus and Recommendations for Neonatal Pneumothorax Ultrasound Diagnosis and Ultrasound-guided Thoracentesis Procedure

Pneumothorax (PTX) represents accumulation of the air in the pleural space. A large or tension pneumothorax can collapse the lung and cause hemodynamic compromise, a life-threatening disorder. Traditionally, neonatal pneumothorax diagnosis has been based on clinical images, auscultation, transillumination, and chest X-ray findings. This approach may potentially lead to a delay in both diagnosis and treatment. The use of lung US in diagnosis of PTX together with US-guided thoracentesis results in earlier and more precise management. The recommendations presented in this publication are aimed at improving the application of lung US in guiding neonatal PTX diagnosis and management.

Pneumothorax is a common emergency and critical disease in newborn infants that needs rapid, clear diagnosis and timely treatment. Diagnosis and treatment based on chest X-rays are associated with delayed management and radiation damage. Lung ultrasound (US) provides useful guidance for rapid, accurate diagnosis and the precise thoracentesis of pneumothorax.

Consenso internacional de especialistas e recomendações para diagnóstico de ultrassom pneumotórax neonatal e procedimento de toracentese guiado por ultrassom

Pneumothorax (PTX) represents accumulation of the air in the pleural space. A large or tension pneumothorax can collapse the lung and cause hemodynamic ...

Diagnosis and Surgical Treatment of Human Brucellar Spondylodiscitis

Brucellar spondylodiscitis (BS) is the most prevalent and significant osteoarticular presentation of human Brucellosis, which is commonly manifested in pastoral communities. It is difficult to differentially diagnose and usually leads to irreversible neurologic deficits and spinal deformities. The initial diagnosis of BS is based on clinical findings and radiographic assessments, and the confirmed diagnosis should be established by the isolation of Brucella species from the blood and/or the standard tube agglutination test. Differential diagnosis of multifocal BS from either degenerative disc diseases or tuberculosis is especially highlighted. The surgical approach, either endoscopic or open, is demonstrated in detail, accompanied by radiographic evidence of structural compression or severe instability. Further, the crucial surgical steps, including single-stage transforaminal decompression, debridement, interbody fusion, and internal fixation, are explained. Moreover, perioperative care and postoperative rehabilitation are also addressed. Taken together, this clinical algorithm presents a practical guide that has yielded substantially satisfactory outcomes in the past decades, which can also be introduced for large-scale application to manage human BS, especially in endemic regions.

We describe a clinical algorithm, based on decades of front-line experience of diagnosis and surgical treatment of human Brucellar spondylodiscitis in the largest medical center of the China's Xinjiang Pastoral Area.

Diagnóstico e Tratamento Cirúrgico da Espondilodiscite Humana de Brucellar

Brucellar spondylodiscitis (BS) is the most prevalent and significant osteoarticular presentation of human Brucellosis, which is commonly manifested in ...

Testing Acetylcholine Followed by Adenosine for Invasive Diagnosis of Coronary Vasomotor Disorders

More than 50% of patients with signs and symptoms of myocardial ischemia undergoing coronary angiography have unobstructed coronary arteries. Coronary vasomotor disorders (impaired vasodilatation and/or enhanced vasoconstriction/spasm) represent important functional causes for such a clinical presentation. Although impaired vasodilatation may be assessed with non-invasive techniques such as positron emission tomography or cardiac magnetic resonance imaging, there is currently no reliable non-invasive technique for the diagnosis of coronary spasm available. Thus, invasive diagnostic procedures (IDP) have been developed for the diagnosis of coronary vasomotor disorders including spasm testing as well as assessment of coronary vasodilatation. The identification of the underlying type of disorder (so called endotype) allows the initiation of targeted pharmacological treatments. Despite the fact that such an approach is recommended by the current European Society of Cardiology guidelines for the management of chronic coronary syndromes based on the CorMicA study, comparability of results as well as multicenter trials are currently hampered by major differences in institutional protocols for coronary functional testing. This article describes a comprehensive IDP protocol including intracoronary acetylcholine provocation testing for diagnosis of epicardial/microvascular spasm, followed by Doppler wire-based assessment of coronary flow reserve (CFR) and hyperemic microvascular resistance (HMR) in search of coronary vasodilatory impairment.

Coronary vasomotion disorders represent frequent functional causes of angina in patients with unobstructed coronaries. The underlying mechanism of angina (endotype) in these patients can be determined by a comprehensive invasive diagnostic procedure based on acetylcholine provocation testing followed by Doppler-derived assessment of the coronary flow reserve and microvascular resistance.

Testando acetilcolina seguida de adenosina para diagnóstico invasivo de distúrbios vasomotores coronários

More than 50% of patients with signs and symptoms of myocardial ischemia undergoing coronary angiography have unobstructed coronary arteries. Coronary ...

Measurement of Myocardial Lactate Production for Diagnosis of Coronary Microvascular Spasm

In about a quarter of patients with angina and non-obstructive coronary arteries, no epicardial spasm is noted on coronary arteriography during an angina attack. Since the pressure-rate product is almost identical at rest and the onset of attack in those patients, the decrease in coronary blood flow rather than increased myocardial oxygen consumption is likely to explain myocardial ischemia, indicating a substantial involvement with coronary microvascular spasm (MVS). Myocardial lactate production, which could be defined as a negative myocardial lactate extraction ratio (ratio of the coronary arterial-venous difference in lactate concentration to arterial concentration), is considered indicative of objective evidence to support the emerging myocardial ischemia. Thus, monitoring of the myocardial lactate production and the emergence of chest pain and ischemic electrocardiographic changes during acetylcholine (ACh) provocation testing is of significant value for detecting the entity of MVS. Practically, 1 min after incremental doses of ACh (20, 50, and 100 &#956;g) are administered into the left coronary artery (LCA), paired samples of 1 mL of blood are collected from the LCA ostium and coronary sinus for measurement of lactate concentration by a calibrated automatic lactate analyzer. Then, the development of MVS could be confirmed by negative myocardial lactate extraction ratio despite the absence of angiographically demonstrable epicardial coronary spasm or before its occurrence throughout ACh provocation testing. In conclusion, assessment of myocardial lactate production is essential and valuable for the diagnosis of MVS.

Myocardial lactate production (coronary arterial-venous difference in serum lactate level) during coronary spasm provocation testing is considered as a highly sensitive marker that reflects acetylcholine-induced myocardial ischemia due to microvascular spasm. This article presents the procedures to assess myocardial lactate production for the diagnosis of coronary microvascular spasm.

Mensuração da Produção de Lactato Miocárdico para Diagnóstico de Microvascular Coronariano

In about a quarter of patients with angina and non-obstructive coronary arteries, no epicardial spasm is noted on coronary arteriography during an angina ...

High-speed Video Microscopy Analysis for First-line Diagnosis of Primary Ciliary Dyskinesia

Primary ciliary dyskinesia (PCD) is a congenital disorder predominantly inherited in an autosomal recessive trait. The disorder causes disturbance in the motion of cilia, leading to severe impairment of mucociliary clearance (MCC). If undiagnosed or diagnosed too late, the condition leads to the development of bronchiectasis and serious damage to the lungs in later life. Most of the methods for diagnosing PCD are time-consuming and demand extensive economic resources to establish them. High-speed video microscopy analysis (HSVMA) is the only diagnostic tool to visualize and analyze living respiratory cells with beating cilia in vitro. It is fast, cost-effective, and, in experienced hands, very reliable as a diagnostic tool for PCD. In addition, classical diagnostic measures such as transmission electron microscopy (TEM) are not applicable for some mutations as morphological changes are absent. 
This paper describes the process of collecting respiratory epithelial cells, the further preparation of the specimen, and the process of HSVMA. We also describe how brushed cells can be successfully kept unharmed and beating by keeping them in a nourishing medium for storage and transport to the investigation site in cases where a clinic does not possess the equipment to perform HSVMA. Also shown are videos with pathologic beating patterns from patients with a mutation in the dynein arm heavy chain 11 gene (DNAH11), which cannot be diagnosed with TEM; the result of an inconclusive HSVMA due to infection of the upper airways, as well as an unsuccessful brushing with superimposition of red blood cells. With this article, we would like to encourage every unit dealing with pulmonology patients and rare lung diseases to perform HSVMA as part of their daily routine diagnostics for PCD or send the specimens over to a center specializing in performing HSVMA.

High-speed video microscopy analysis is a relatively easy-to-perform, fast, cost-effective, and, in experienced hands, a considerably reliable tool for first-line diagnostics of primary ciliary dyskinesia, which should be available in every center involved in diagnostics and the treatment of severe lung diseases.

Análise de microscopia de vídeo de alta velocidade para diagnóstico de primeira linha da dyskinesia ciliar primária

Primary ciliary dyskinesia (PCD) is a congenital disorder predominantly inherited in an autosomal recessive trait. The disorder causes disturbance in the ...