Name: basophil activation test for allergy diagnosis
Uploaded: 2021-05-31T14:00:00
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Agradecemos a Claudia Corazza por su invaluable apoyo en el idioma inglés. Este trabajo ha contado con el apoyo del Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) del MINECO (subvención cofinanciada por FEDER: "Una manera de hacer Europa"; Subvenciones Nº PI20/01715; PI18/00095; PI17/01410; PI17/01318; PI17/01237 y RETIC ARADYAL RD16/0006/0001; Consejería de Sanidad de la Junta de Andalucía (Subvención Nº PI-0127-2020, PIO-0176-2018; PE-0172-2018; PE-0039-2018; PC-0098-2017; PI-0075-2017; PI-0241-2016). ID es Investigador Clínico (B-0001-2017) y AA es titular de un Contrato Postdoctoral Senior (RH-0099-2020), ambos apoyados por la Consejería de Sanidad de la Junta de Andalucía (cofinanciado por ESF: "Andalucía se mueve con Europa").

El cumplimiento del protocolo se llevó a cabo de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki y aprobado por el Comité de Ética para la Investigación Provincial de Málaga, España. Todos los sujetos fueron informados oralmente sobre el estudio de investigación y firmaron el correspondiente término de consentimiento informado.
NOTA: El presente protocolo detalla el procedimiento de MTD que los autores utilizan diariamente. Sin embargo, este no es un método estandar...

BAT es una prueba diagnóstica in vitro complementaria para la evaluación de reacciones alérgicas mediadas por IgE que ha demostrado ser útil en el diagnóstico de reacciones inducidas por diferentes desencadenantes como medicamentos, alimentos o inhalantes, así como en algunas formas de urticaria crónica. En general, se debe considerar el rendimiento de las MTD si: i) el alérgeno/fármaco produce resultados falsos positivos en el ST; ii) el alérgeno/fármaco no está disponible para ser utilizado para la...

El diagnóstico de alergia mediada por IgE se basa en la historia clínica, las pruebas cutáneas (ST), la cuantificación de la IgE específica sérica (sIgE) y, si es necesario e indicado, las pruebas de provocación controlada (ECC)1,2,3,4,5,6. Sin embargo, la historia clínica puede ser poco confiable ya que puede haber una falta de información precisa, y los ST y CCT no son procedimientos libres de riesgo que pueden estar contraindicados en sujetos que experimentan reacciones graves potencialmente mortales 1,2,3,4,5,6 . Estas cuestiones, junto con el hecho de que la determinación de sIgE mediante inmunoensayos de fluoroenzimas validados y comerciales solo está disponible para unos pocos alérgenos y fármacos, han puesto de relieve el importante papel de otros ensayos funcionales in vitro, como la prueba de activación basófila (MTD).
Los basófilos son células efectoras clave involucradas en reacciones alérgicas mediadas por IgE que se activan tras la reticulación de sIgE adyacente unida a receptores de alta afinidad (FcεRI) en la superficie celular después de la exposición a alérgenos / medicamentos. La activación basófila desencadena la desgranulación celular y la liberación de mediadores inflamatorios preformados y nuevos sintetizados contenidos en gránulos de secreción intracitoplasmática 7,8,9. BAT es un método in vitro que intenta imitar la activación basófila en presencia de un estímulo (alérgeno o fármaco) y determina cambios en la expresión de marcadores de activación basófilos mediante citometría de flujo 7,10. Existen diferentes estrategias para identificar basófilos (IgE+, CCR3+, CRTH2+, CD203c+) y medir la activación celular (principalmente regulación positiva de CD63 y CD203c) utilizando combinaciones de anticuerpos marcados con fluorocromo 7,10. CD63, el mejor marcador de activación clínicamente validado 11,12,13,14, es una proteína de membrana anclada en los gránulos secretores que contienen histamina que, después de la activación celular y la fusión de los gránulos con la membrana, se expresa en la superficie basófila 15,16,17,18,19,20,21 . CD203c es un marcador de superficie que se expresa constitutivamente en basófilos y se regula al alza después de la estimulación de FcεRI, que también ha mostrado resultados confiables en BAT 15,22,23,24,25. Además, parece co-expresarse con CD6326.
En las últimas décadas, las MTD han demostrado ser útiles en el diagnóstico de reacciones alérgicas mediadas por IgE inducidas por diferentes desencadenantes como medicamentos, alimentos o inhalantes, así como en algunas formas de urticaria crónica, como se describe a continuación. Sin embargo, la posición de esta técnica en los algoritmos diagnósticos es muy variable y no está bien determinada.
Hipersensibilidad a los medicamentos Las MTD han demostrado ser útiles como prueba complementaria para fármacos y pacientes seleccionados, especialmente para aquellos que experimentan reacciones graves debido al hecho de que el valor diagnóstico del ST no está bien establecido para la mayoría de los medicamentos, ya que están validados y estandarizados para un número limitado de fármacos27,28,29,30. Además, la cuantificación de sIgE está disponible sólo para un número limitado de fármacos, con menor sensibilidad que ST 27,28,29,30,31,32. Por lo tanto, el diagnóstico de hipersensibilidad a los medicamentos generalmente se basa en la prueba de provocación de drogas, que puede estar contraindicada en sujetos que experimentan reacciones graves que amenazan la vida33.
Se han reportado resultados prometedores para el uso de MTD en pacientes seleccionados que informaron reacciones de hipersensibilidad inmediata a diferentes fármacos como betalactámicos (BL)20,34,35,36,37,38,39, agentes bloqueadores neuromusculares (NMBA)19,22,40,41,42, 43,44,45, fluoroquinolonas (FQ)46,47,48,49, pirazolonas 50,51,52, medios de radiocontraste (RCM)53,54,55,56 y compuestos de platino57,58,59 . Se ha informado que las MTD tienen una sensibilidad y especificidad entre 51,7-66,9% y 89,2-97,8%, respectivamente; y se describen valores predictivos positivos y negativos que oscilan entre 93,4% y 66,3%, respectivamente27,31. Además, el BAT ha sido propuesto como un biomarcador predictivo para reacciones innovadoras durante la desensibilización con compuestos de platino, ya que la expresión de CD203c está aumentada en comparación con CD63 en pacientes con alto riesgo de reacciones adversas durante la desensibilización del fármaco57.
Cabe destacar que las MTD sólo son útiles en la hipersensibilidad a los medicamentos cuando la reacción implica la degranulación basófila; Por lo tanto, no es útil en reacciones resultantes de la inhibición enzimática de la ciclooxigenasa 142.
Alergia alimentaria Las MTD se han convertido en una herramienta diagnóstica potencial para la alergia alimentaria porque la determinación de la sIgE sérica para todo el extracto alergénico o alérgenos individuales es a menudo ambigua, lo que requiere un desafío alimentario oral para confirmar el diagnóstico, que, de manera similar a la hipersensibilidad al medicamento, es un procedimiento costoso y no exento de riesgos60. Varios estudios han mostrado resultados relevantes con leche de vaca 61,62, huevo 61,63, trigo 64,65,66,67,68, cacahuete 63,69,70,71,72, avellana 73,74,75,76 ,77, mariscos78, melocotón 79,80,81, manzana 21, apio y zanahoria82,83.
El principal valor añadido de las MTD en el diagnóstico de la alergia alimentaria en comparación con las ST y la IgE en suero es que muestra una mayor especificidad y una sensibilidad similar. Por lo tanto, las MTD son una herramienta útil para diferenciar a los pacientes clínicamente alérgicos de los sujetos sensibilizados, pero tolerantes, que tienen alta especificidad (75-100%) y sensibilidad (77-98%)63,69,84. Los valores de sensibilidad y especificidad dependen del alérgeno y otros factores como fenotipos (p. ej., síndrome de alergia oral versus anafilaxia), edad y patrones de sensibilización relacionados con la geografía63,85.
Las MTD que utilizan componentes de alérgenos individuales pueden mejorar potencialmente la precisión diagnóstica de algunos alérgenos alimentarios61,80. Existen estudios que utilizan proteínas de almacenamiento de semillas (por ejemplo, Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3 y Ara h 6 del maní)86; proteínas de transferencia de lípidos (p. ej., Pru p 3 del melocotón y Ara h 9 del maní)80,86; y homólogos de Bet v 1 (por ejemplo, Ara h 8 de maní)87. Otras utilidades potenciales están relacionadas con la identificación del alérgeno culpable en casos de síndrome de alergia polen-alimentos 21,87,88, alergia a la carne roja 89 o anafilaxia inducida por el ejercicio dependiente de alimentos66.
Curiosamente, las MTD pueden proporcionar información sobre la gravedad y el umbral de las reacciones alérgicas, ya que los pacientes con reacciones más graves muestran una mayor proporción de basófilos activados, como se observó en estudios de pacientes alérgicos al maní y a la leche de vaca 84,90,91; y los pacientes que reaccionan a trazas del alérgeno muestran una mayor sensibilidad basófila 84,90,92. Estos datos sugieren que las MTD pueden ser útiles para identificar a los pacientes alérgicos de alto riesgo que requieren un seguimiento más estrecho y una educación más intensa93. Además, se ha informado que las MTD pueden predecir las respuestas al desafío alimentario 70,91,92,94 y los umbrales de reactividad90,95 para ayudar a determinar cuándo los alimentos pueden ser (re)introducidos de manera segura 84. Sin embargo, estos hallazgos son controvertidos en algunos estudios63,96 y se requiere más investigación.
Por otro lado, las MTD se han utilizado para monitorizar la resolución de la alergia alimentaria, ya sea de forma natural o bajo tratamientos inmunomoduladores, a lo largo del tiempo, que hasta ahora solo se ha evaluado mediante provocación alimentaria oral, con los riesgos y costes asociados 84,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106 ,107,108. Además, también se ha utilizado para controlar el efecto de omalizumab en la alergia alimentaria, ya que la activación basófila disminuye durante el tratamiento con omalizumab, pero aumenta después del cese del tratamiento109.
Alergia por inhalación Las MTD rara vez son beneficiosas en la alergia por inhalación, ya que el diagnóstico se puede establecer de forma rutinaria mediante la cuantificación de sIgE y ST. Sin embargo, en casos de rinitis alérgica local (niveles indetectables de sIgE y ST negativos con pruebas de provocación nasal positivas), la MTD ha permitido el diagnóstico en el 50% de los casos110. Se ha reportado además una correlación entre la sensibilidad basófila y la respuesta a las pruebas de provocación nasal/bronquial, así como entre la gravedad del asma y la eficacia del tratamiento con omalizumab111,112.
Las MTD también se han utilizado para controlar la inmunoterapia con alérgenos para los ácaros del polvo doméstico y el polen, ya que la sensibilidad basófila disminuye durante la inmunoterapia, probablemente debido a la interferencia del bloqueo de anticuerpos IgG 113,114,115,116,117.
Alergia al veneno de himenópteros El diagnóstico de la alergia al veneno de himenópteros se basa rutinariamente en ST y sIgE sérica. La MTD ha mostrado una alta sensibilidad (85-100%) y especificidad (83-100%) y se ha informado que es útil en casos que arrojan resultados equívocos o en pacientes con una historia clínica sugestiva de alergia al veneno pero sIgE indetectable y ST118,119 negativo. Sin embargo, las MTD no parecen ser predictivas de la gravedad de estas reacciones120,121.
Hasta el 60% de los pacientes presentan sIgE tanto para el veneno de avispa como de abeja, y la identificación del alérgeno dominante es crucial para un tratamiento adecuado de inmunoterapia. En estos casos, se ha informado que las MTD son útiles para identificar el alérgeno dominante119,122,123,124. Aunque la sIgE a los principales alérgenos de los venenos de abeja y avispa puede reducir la utilidad de las MTD en pacientes con doble positividad a ambos venenos, proporciona información útil principalmente en sujetos con resultados negativos en las determinaciones de IgE123.
Algunos estudios sugieren que las MTD pueden ser útiles como biomarcador predictivo de los efectos secundarios durante la fase de acumulación de la inmunoterapia con veneno, ya que se ha informado que esta opción de tratamiento disminuye la sensibilidad basófila. Sin embargo, la reactividad no disminuye y esta utilidad BAT es hoy controvertida 13,120,125,126,127,128,129,130.
Urticaria y angioedema Un subconjunto de pacientes con urticaria crónica tiene una fisiopatología autoinmune, debido a los autoanticuerpos IgE contra autoalérgenos y autoanticuerpos IgG que se dirigen a los complejos FcεRI o IgE-FcεRI presentes en la superficie de los mastocitos131,132. En la práctica clínica, el diagnóstico de este tipo de urticaria crónica se ha basado en ST sérico autólogo positivo, que tiene riesgo de infección accidental. Las MTD se han propuesto como una prueba in vitro para diagnosticar y monitorizar a los pacientes con sospecha de urticaria crónica. Se ha informado que la expresión de CD63 y CD203c en la superficie de los basófilos aumenta después de la estimulación con sueros de pacientes con urticaria crónica, mostrando la detección de autoanticuerpos activos 133,134,135,136,137. Recientemente, se ha informado que los pacientes con BAT positivas a menudo experimentan el estado de enfermedad más activo, evaluado por la puntuación de actividad de la urticaria, y requieren dosis más altas de antihistamínicos junto con tratamientos de tercera línea (ciclosporina A u omalizumab), en comparación con aquellos con BAT138 negativo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, without Cap, Nonsterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD193 (CCR3) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>310708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCalibur Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD63 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>353006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Solution 10x concentrated</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Formyl-Met-Leu-Phe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD203c (E-NPP3) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>324606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse Anti-Human IgE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-3</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>203-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheath Fluid</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>342003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUBE 9 mL LH Lithium Heparin</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>455084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

basophil activation test for allergy diagnosis

La prueba de activación de basófilos (BAT) es una prueba diagnóstica in vitro complementaria que se puede utilizar además de la historia clínica, la prueba cutánea (ST) y la determinación específica de IgE (sIgE) en la evaluación de reacciones alérgicas mediadas por IgE a alimentos, veneno de insectos, medicamentos, así como algunas formas de urticaria crónica. Sin embargo, el papel de esta técnica en los algoritmos de diagnóstico es muy variable y no está bien determinado.
Las MTD se basan en la determinación de la respuesta basófila a la activación de IgE de reticulación alérgeno/fármaco mediante la medición de marcadores de activación (como CD63, CD203c) mediante citometría de flujo. Esta prueba puede ser una herramienta útil y complementaria para evitar las pruebas de provocación controladas para confirmar el diagnóstico de alergia, especialmente en sujetos que experimentan reacciones graves potencialmente mortales. En general, se debe considerar el rendimiento de las MTD si: i) el alérgeno/fármaco produce resultados falsos positivos en el ST; ii) no hay ninguna fuente de alérgenos/medicamentos para la determinación de ST o sIgE; iii) existe discordancia entre la historia del paciente y la determinación del ST o la sIgE; iv) los síntomas sugieren que el ST puede dar lugar a una respuesta sistémica; v) antes de considerar un CCT para confirmar el alérgeno / medicamento culpable. Las principales limitaciones de la prueba están relacionadas con la sensibilidad no óptima, especialmente en la alergia a medicamentos, la necesidad de realizar la prueba no más de 24 h después de la extracción de la muestra y la falta de estandarización entre laboratorios en términos de procedimientos, concentraciones y marcadores celulares.

Las MTD realizadas con alérgenos o fármacos permiten investigar las reacciones de hipersensibilidad dependientes de IgE. La reactividad basófila debe medirse en al menos dos concentraciones óptimas para obtener los mejores resultados34 y la activación se visualiza mediante la regulación positiva de CD63 en la superficie celular. En el caso de los alérgenos, además, para confirmar la reactividad basófila, la sensibilidad basófila debe analizarse midiendo la reactividad a múltiples concen...

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Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis

La prueba de activación basófila es una prueba diagnóstica in vitro complementaria para la evaluación de reacciones alérgicas mediadas por IgE basada en la detección de la activación basófila en presencia de un estímulo específico mediante la medida de marcadores de activación mediante citometría de flujo.

Prueba de activación de basófilos para el diagnóstico de alergia

The basophil activation test (BAT) is a complementary in vitro diagnostic test that can be used in addition to clinical history, skin test (ST), and ...

La prueba de activación de basófilos es una prueba diagnóstica in vitro complementaria para la evaluación de reacciones alérgicas mediadas por IgE que han demostrado ser útiles para reacciones inducidas por medicamentos, alimentos o inhalantes, así como en algunas formas de urticaria crónica. Esta prueba se basa en determinar la respuesta basófila a la activación de IgE de reticulación de un alérgeno o fármaco mediante la medición de marcadores de activación mediante citometría de flujo. La prueba de activación de basófilos puede ser una herramienta útil y complementaria para evitar pruebas de provocación controladas para confirmar el diagnóstico de alergia, especialmente en sujetos que experimentan reacciones graves potencialmente mortales.Además, esta prueba tiene la ventaja de poder analizar la respuesta frente a cualquier fármaco o alérgeno frente a otros métodos in vitro que solo están disponibles para unos pocos fármacos y alérgenos. Las principales limitaciones de la prueba están relacionadas con la sensibilidad no óptima, especialmente en la alergia a medicamentos. La necesidad de realizar la prueba no más de 24 horas después de la extracción de la muestra y la falta de estandarización entre laboratorios y algoritmos de diagnóstico.Comience recolectando sangre periférica en tubos heparinizados de nueve mililitros y coloque las muestras en un rotor para mantenerlas a temperatura ambiente hasta que sean requeridas para el protocolo experimental. Etiquete dos tubos de citómetro de cinco mililitros cada uno para control negativo y control positivo. También etiquete un tubo para cada uno de los diferentes alérgenos o concentraciones de medicamentos que se están probando.Luego coloque los tubos en una rejilla para que los tubos encajen perfectamente sin resbalar. Para el primer control positivo, prepare una solución de cuatro micromolares de N-formilmetionil-leucil-fenilalanina o fMLP en 0.05% PBS-T para confirmar la calidad de los basófilos. Para el segundo control positivo, prepare una solución anti-IgE de 0,05 miligramos por mililitro utilizando PBS-T.Prepare la mezcla de tinción agregando un microlitro de anticuerpos CCR3-APC, CD203c-PE y CD63-FITC por cada 20 microlitros del tampón de estimulación. Luego agregue 23 microlitros de esta mezcla de tinción a cada tubo. Agregue 100 microlitros de PBS-T a los tubos de control negativo.Agregue 100 microlitros de fMLP a uno de los tubos de control positivo y agregue 100 microlitros de anti-IgE al otro al resto de los tubos. Agregue 100 microlitros de las diferentes concentraciones de alérgenos o medicamentos e incubar a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Después de la incubación, agregue 100 microlitros de sangre a cada tubo suavemente para evitar la hemólisis.Luego vórtice suavemente los tubos e incubarlos durante 25 minutos a 37 grados centígrados en el baño termostático con agitación media. Mantenga los tubos a cuatro grados centígrados durante al menos cinco minutos para detener la desgranulación. A cada tubo, agregue dos mililitros de tampón de lisis para lisar los eritrocitos.Vortex cada tubo y luego incubar los tubos durante cinco minutos a temperatura ambiente. Centrifugar los tubos a 300 g a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Luego vuelque la rejilla en el fregadero para decantar el sobrenadante mientras las células permanecen en el fondo de los tubos.Agregue tres mililitros de PBS-T a cada tubo para lavar las células y hacer vórtice los tubos. Realice una segunda ronda de centrifugación utilizando el mismo conjunto de parámetros y decanta el sobrenadante volcando la rejilla en el fregadero. Luego mantenga las muestras a cuatro grados centígrados protegidas de la luz hasta la citometría de flujo.Conecte el citómetro de flujo al software de la computadora y espere hasta que el citómetro esté listo. Cargue la plantilla y la configuración del instrumento como se describe en el texto manuscrito. Inicie el proceso de adquisición de muestras.Para seleccionar basófilos activados, primero, compuerta los linfocitos del gráfico de dispersión lateral hacia adelante. Luego compuerta los basófilos de la población de linfocitos como células CCR3 + CD203c + y adquiere al menos 500 basófilos por tubo. Ajuste el umbral CD63 a aproximadamente 2.5% usando los tubos de control negativo y analice las muestras.Las reacciones de hipersensibilidad dependientes de IgE se investigaron mediante la realización de una prueba de activación basófila, o BAT, utilizando alérgenos y fármacos. La sensibilidad basófila se analizó midiendo la reactividad a múltiples concentraciones decrecientes de alérgenos que ayudan a determinar la concentración alérgica que induce la respuesta de 50% basófilos o CE50. Primero, los linfocitos fueron cerrados desde el diagrama de dispersión lateral hacia adelante.Luego, los basófilos fueron cerrados de la población de linfocitos como células CCR3 + CD203c +. Luego se utilizó una gráfica CCR3-CD63 para analizar la activación basófila utilizando CD63 como marcador de activación para dos fármacos y diferentes concentraciones de un alérgeno. La prueba se realiza con sangre entera fresca y debe realizarse no más de 24 horas después de la extracción de sangre.El estímulo utilizado en la prueba no debe incluir ningún excipiente y se deben considerar las características químicas de los medicamentos. Otros métodos in vitro adicionales para el diagnóstico de reacciones alérgicas mediadas por IgE, o la determinación de sIgE, o la prueba de liberación de histamina.

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Research

JoVE Journal

Medicine

FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis

Pre-implantation genetic diagnosis (PGD) is an established alternative to pre-natal diagnosis, and involves selecting pre-implantation embryos from a cohort generated by assisted reproduction technology (ART). This selection may be required because of familial monogenic disease (e.g. cystic fibrosis), or because one partner carries a chromosome rearrangement (e.g. a two-way reciprocal translocation). PGD is available for couples who have had previous affected children, and/or in the case of chromosome rearrangements, recurrent miscarriages, or infertility. Oocytes aspirated following ovarian stimulation are fertilized by in vitro immersion in semen (IVF) or by intracytoplasmic injection of an individual spermatozoon (ICSI). Pre-implantation cleavage-stage embryos are biopsied, usually by the removal of a single cell on day 3 post-fertilization, and the biopsied cell is tested to establish the genetic status of the embryo. Fluorescence in situ hybridization (FISH) on the fixed nuclei of biopsied cells with target-specific DNA probes is the technique of choice to detect chromosome imbalance associated with chromosome rearrangements, and to select female embryos in families with X-linked disease for which there is no mutation-specific test. FISH has also been used to screen embryos for spontaneous chromosome aneuploidy (also known as PGS or PGD-AS) in order to try and improve the efficiency of assisted reproduction; however, the predictive value of this test using the spreading and FISH technique described here is likely to be unacceptably low in most people's hands and it is not recommended for routine clinical use. We describe the selection of suitable probes for single-cell FISH, spreading techniques for blastomere nuclei, and in situ hybridization and signal scoring, applied to PGD in a clinical setting.

This article describes the selection of suitable probes for single-cell FISH, spreading techniques for blastomere nuclei, and in situ hybridization and signal scoring, applied to pre-implantation genetic diagnosis (PGD) in a clinical setting.

FISH para el diagnóstico genético preimplantacional

Pre-implantation genetic diagnosis (PGD) is an established alternative to pre-natal diagnosis, and involves selecting pre-implantation embryos from a ...

Investigación

Medicina

The Trier Social Stress Test Protocol for Inducing Psychological Stress

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting. Protocols that allow researchers to study the biological pathways of the stress response in health and disease are fundamental to the progress of research in stress and anxiety.1 Although numerous protocols exist for inducing stress response in the laboratory, many neglect to provide a naturalistic context or to incorporate aspects of social and psychological stress. Of psychological stress protocols, meta-analysis suggests that the Trier Social Stress Test (TSST) is the most useful and appropriate standardized protocol for studies of stress hormone reactivity.2 In the original description of the TSST, researchers sought to design and evaluate a procedure capable of inducing a reliable stress response in the majority of healthy volunteers.3 These researchers found elevations in heart rate, blood pressure and several endocrine stress markers in response to the TSST (a psychological stressor) compared to a saline injection (a physical stressor).3 Although the TSST has been modified to meet the needs of various research groups, it generally consists of a waiting period upon arrival, anticipatory speech preparation, speech performance, and verbal arithmetic performance periods, followed by one or more recovery periods. The TSST requires participants to prepare and deliver a speech, and verbally respond to a challenging arithmetic problem in the presence of a socially evaluative audience.3 Social evaluation and uncontrollability have been identified as key components of stress induction by the TSST.4 In use for over a decade, the goal of the TSST is to systematically induce a stress response in order to measure differences in reactivity, anxiety and activation of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) or sympathetic-adrenal-medullary (SAM) axis during the task.1 Researchers generally assess changes in self-reported anxiety, physiological measures (e.g. heart rate), and/or neuroendocrine indices (e.g. the stress hormone cortisol) in response to the TSST. Many investigators have adopted salivary sampling for stress markers such as cortisol and alpha-amylase (a marker of autonomic nervous system activation) as an alternative to blood sampling to reduce the confounding stress of blood-collection techniques. In addition to changes experienced by an individual completing the TSST, researchers can compare changes between different treatment groups (e.g. clinical versus healthy control samples) or the effectiveness of stress-reducing interventions.1

This article describes a protocol for inducing psychological stress in participants, which enables researchers to measure psychological, physiological and neuroendocrine responses to stress within single participants or between groups.

El estrés social Trier Protocolo de prueba para la inducción de estrés psicológico

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting.  Protocols that allow researchers to study the biological ...

Transabdominal Ultrasound for Pregnancy Diagnosis in Reeves' Muntjac Deer

Reeves' muntjac deer (Muntiacus reevesi) are a small cervid species native to southeast Asia, and are currently being investigated as a potential model of prion disease transmission and pathogenesis. Vertical transmission is an area of interest among researchers studying infectious diseases, including prion disease, and these investigations require efficient methods for evaluating the effects of maternal infection on reproductive performance. Ultrasonographic examination is a well-established tool for diagnosing pregnancy and assessing fetal health in many animal species1-7, including several species of farmed cervids8-19, however this technique has not been described in Reeves' muntjac deer. Here we describe the application of transabdominal ultrasound to detect pregnancy in muntjac does and to evaluate fetal growth and development throughout the gestational period. Using this procedure, pregnant animals were identified as early as 35 days following doe-buck pairing and this was an effective means to safely monitor the pregnancy at regular intervals. Future goals of this work will include establishing normal fetal measurement references for estimation of gestational age, determining sensitivity and specificity of the technique for diagnosing pregnancy at various stages of gestation, and identifying variations in fetal growth and development under different experimental conditions.

Transabdominal Ultrasound for Pregnancy Diagnosis in Reeves&#039; Muntjac Deer

Transabdominal ultrasound is described as an effective, noninvasive means for assessing reproductive status in Reeves' muntjac deer. These methods can be used to achieve early pregnancy diagnosis and to evaluate fetal viability. Future applications of this technique include estimation of gestational age and effects of maternal disease on fetal development.

Ultrasonido transabdominal para el diagnóstico del embarazo en los ciervos muntjac de Reeves

Reeves' muntjac deer (Muntiacus reevesi) are a small cervid species native to southeast Asia, and are currently being investigated as a potential model of ...

Diagnosis of Musculus Gastrocnemius Tightness - Key Factors for the Clinical Examination

Common foot and ankle pathologies have been linked to isolated Musculus gastrocnemius tightness (MGT). Various examination techniques have been described to assess MGT. Still, a standardized examination procedure is missing. Literature argues for weightbearing examination but the degree of knee flexion needed to eliminate the restraining effect of the M. gastrocnemius on ankle dorsiflexion (ADF) is unknown. This manuscript investigates the effect of knee flexion on ankle dorsiflexion and provides a detailed description of a standardized examination protocol. Examination on 20 healthy individuals revealed, that 20&#176; of knee flexion is sufficient to fully eliminate the influence of the M. gastrocnemius on ADF. This builds the prerequisite for a standardized examination for MGT. Non-weightbearing and weightbearing examination of ADF has to be conducted with the knee fully extended and at least 20&#176; flexed. Two investigators should conduct non-weightbearing testing with the subject in supine position. In order to obtain reliable results, the axis of the fibula should be marked. One examiner can conduct weightbearing examination with the subject in lunge stance. Isolated MGT is present if ADF is impaired with the knee fully extended and knee flexion results in a significant ADF increase. The herein presented standardized examination is the prerequisite for future studies aiming at establishing norm values.

Diagnosis of Musculus Gastrocnemius Tightness - Key Factors for the Clinical Examination

Isolated Musculus gastrocnemius tightness is a common cause for foot and ankle pathologies. Currently no standardized examination procedure exists. This manuscript demonstrates that 20 degree of knee flexion eliminates the restraining effect of the M. gastrocnemius on ankle dorsiflexion and presents a video description of a standardized examination protocol.

El diagnóstico de la<em&gt; Musculus Gastronemio</em&gt; Opresión - Factores clave para el Examen Clínico

Common foot and ankle pathologies have been linked to isolated Musculus gastrocnemius tightness (MGT). Various examination techniques have been described ...

Hydra, a Computer-Based Platform for Aiding Clinicians in Cardiovascular Analysis and Diagnosis

Cardiovascular diseases (CVDs) are the leading cause of death throughout the world. The total risk of developing CVD is determined by the combined effect of different cardiovascular risk factors (e.g., diabetes, raised blood pressure, unhealthy diet, tobacco use, stress, etc.) that commonly coexist and act multiplicatively. Most CVDs can be prevented by an early identification of the highest risk factors and an appropriate treatment. The stratification of cardiovascular risk factors involves a wide range of parameters and tests that specialists use in their clinical practice. In addition to cardiovascular (CV) risk stratification, ambulatory blood pressure monitoring (ABPM) also provides relevant information for diagnostic and treatment purposes. This work presents a list of protocols based on the Hydra platform, a web-based system for clinical decision support which incorporates a set of functionalities and services that are required for complete cardiovascular analysis, risk assessment, early diagnosis, treatment and monitoring of patients over time. The program includes tools for inputting and managing comprehensive patient data, organized into different checkups to track the evolution over time. It also has a risk stratification tool to compute a CV risk factor based upon several risk stratification tables of reference. Additionally, the program includes a tool that incorporates ABPM analysis and allows the extraction of valuable information by monitoring blood pressure over a specific period of time. Finally, the reporting service summarizes the most relevant information in a set of reports that aid clinicians in their clinical decision-making process.

This article presents a protocol based on Hydra &#8212; a web-based system for clinical decision support that integrates a full and detailed set of functionalities and services required by physicians for complete cardiovascular analysis, risk assessment, early diagnosis, treatment, and monitoring over time.

Hydra, una plataforma basada en la computadora para ayudar a los clínicos en el diagnóstico y análisis Cardiovascular

Cardiovascular diseases (CVDs) are the leading cause of death throughout the world. The total risk of developing CVD is determined by the combined effect ...

International Expert Consensus and Recommendations for Neonatal Pneumothorax Ultrasound Diagnosis and Ultrasound-guided Thoracentesis Procedure

Pneumothorax (PTX) represents accumulation of the air in the pleural space. A large or tension pneumothorax can collapse the lung and cause hemodynamic compromise, a life-threatening disorder. Traditionally, neonatal pneumothorax diagnosis has been based on clinical images, auscultation, transillumination, and chest X-ray findings. This approach may potentially lead to a delay in both diagnosis and treatment. The use of lung US in diagnosis of PTX together with US-guided thoracentesis results in earlier and more precise management. The recommendations presented in this publication are aimed at improving the application of lung US in guiding neonatal PTX diagnosis and management.

Pneumothorax is a common emergency and critical disease in newborn infants that needs rapid, clear diagnosis and timely treatment. Diagnosis and treatment based on chest X-rays are associated with delayed management and radiation damage. Lung ultrasound (US) provides useful guidance for rapid, accurate diagnosis and the precise thoracentesis of pneumothorax.

Consenso Internacional de Expertos y Recomendaciones para el Diagnóstico por Ultrasonido Neumotórax Neonatal y Procedimiento de Toracentesis guiada por Ultrasonido

Pneumothorax (PTX) represents accumulation of the air in the pleural space. A large or tension pneumothorax can collapse the lung and cause hemodynamic ...

Diagnosis and Surgical Treatment of Human Brucellar Spondylodiscitis

Brucellar spondylodiscitis (BS) is the most prevalent and significant osteoarticular presentation of human Brucellosis, which is commonly manifested in pastoral communities. It is difficult to differentially diagnose and usually leads to irreversible neurologic deficits and spinal deformities. The initial diagnosis of BS is based on clinical findings and radiographic assessments, and the confirmed diagnosis should be established by the isolation of Brucella species from the blood and/or the standard tube agglutination test. Differential diagnosis of multifocal BS from either degenerative disc diseases or tuberculosis is especially highlighted. The surgical approach, either endoscopic or open, is demonstrated in detail, accompanied by radiographic evidence of structural compression or severe instability. Further, the crucial surgical steps, including single-stage transforaminal decompression, debridement, interbody fusion, and internal fixation, are explained. Moreover, perioperative care and postoperative rehabilitation are also addressed. Taken together, this clinical algorithm presents a practical guide that has yielded substantially satisfactory outcomes in the past decades, which can also be introduced for large-scale application to manage human BS, especially in endemic regions.

We describe a clinical algorithm, based on decades of front-line experience of diagnosis and surgical treatment of human Brucellar spondylodiscitis in the largest medical center of the China's Xinjiang Pastoral Area.

Diagnóstico y Tratamiento Quirúrgico de la Espondylodiscitis Humana Brucellar

Brucellar spondylodiscitis (BS) is the most prevalent and significant osteoarticular presentation of human Brucellosis, which is commonly manifested in ...

Testing Acetylcholine Followed by Adenosine for Invasive Diagnosis of Coronary Vasomotor Disorders

More than 50% of patients with signs and symptoms of myocardial ischemia undergoing coronary angiography have unobstructed coronary arteries. Coronary vasomotor disorders (impaired vasodilatation and/or enhanced vasoconstriction/spasm) represent important functional causes for such a clinical presentation. Although impaired vasodilatation may be assessed with non-invasive techniques such as positron emission tomography or cardiac magnetic resonance imaging, there is currently no reliable non-invasive technique for the diagnosis of coronary spasm available. Thus, invasive diagnostic procedures (IDP) have been developed for the diagnosis of coronary vasomotor disorders including spasm testing as well as assessment of coronary vasodilatation. The identification of the underlying type of disorder (so called endotype) allows the initiation of targeted pharmacological treatments. Despite the fact that such an approach is recommended by the current European Society of Cardiology guidelines for the management of chronic coronary syndromes based on the CorMicA study, comparability of results as well as multicenter trials are currently hampered by major differences in institutional protocols for coronary functional testing. This article describes a comprehensive IDP protocol including intracoronary acetylcholine provocation testing for diagnosis of epicardial/microvascular spasm, followed by Doppler wire-based assessment of coronary flow reserve (CFR) and hyperemic microvascular resistance (HMR) in search of coronary vasodilatory impairment.

Coronary vasomotion disorders represent frequent functional causes of angina in patients with unobstructed coronaries. The underlying mechanism of angina (endotype) in these patients can be determined by a comprehensive invasive diagnostic procedure based on acetylcholine provocation testing followed by Doppler-derived assessment of the coronary flow reserve and microvascular resistance.

Prueba de acetilcolina seguida de adenosina para el diagnóstico invasivo de trastornos vasomotores coronarios

More than 50% of patients with signs and symptoms of myocardial ischemia undergoing coronary angiography have unobstructed coronary arteries. Coronary ...

Measurement of Myocardial Lactate Production for Diagnosis of Coronary Microvascular Spasm

In about a quarter of patients with angina and non-obstructive coronary arteries, no epicardial spasm is noted on coronary arteriography during an angina attack. Since the pressure-rate product is almost identical at rest and the onset of attack in those patients, the decrease in coronary blood flow rather than increased myocardial oxygen consumption is likely to explain myocardial ischemia, indicating a substantial involvement with coronary microvascular spasm (MVS). Myocardial lactate production, which could be defined as a negative myocardial lactate extraction ratio (ratio of the coronary arterial-venous difference in lactate concentration to arterial concentration), is considered indicative of objective evidence to support the emerging myocardial ischemia. Thus, monitoring of the myocardial lactate production and the emergence of chest pain and ischemic electrocardiographic changes during acetylcholine (ACh) provocation testing is of significant value for detecting the entity of MVS. Practically, 1 min after incremental doses of ACh (20, 50, and 100 &#956;g) are administered into the left coronary artery (LCA), paired samples of 1 mL of blood are collected from the LCA ostium and coronary sinus for measurement of lactate concentration by a calibrated automatic lactate analyzer. Then, the development of MVS could be confirmed by negative myocardial lactate extraction ratio despite the absence of angiographically demonstrable epicardial coronary spasm or before its occurrence throughout ACh provocation testing. In conclusion, assessment of myocardial lactate production is essential and valuable for the diagnosis of MVS.

Myocardial lactate production (coronary arterial-venous difference in serum lactate level) during coronary spasm provocation testing is considered as a highly sensitive marker that reflects acetylcholine-induced myocardial ischemia due to microvascular spasm. This article presents the procedures to assess myocardial lactate production for the diagnosis of coronary microvascular spasm.

Medición de la producción de lactato miocárdico para el diagnóstico del espasmo microvascular coronario

In about a quarter of patients with angina and non-obstructive coronary arteries, no epicardial spasm is noted on coronary arteriography during an angina ...

High-speed Video Microscopy Analysis for First-line Diagnosis of Primary Ciliary Dyskinesia

Primary ciliary dyskinesia (PCD) is a congenital disorder predominantly inherited in an autosomal recessive trait. The disorder causes disturbance in the motion of cilia, leading to severe impairment of mucociliary clearance (MCC). If undiagnosed or diagnosed too late, the condition leads to the development of bronchiectasis and serious damage to the lungs in later life. Most of the methods for diagnosing PCD are time-consuming and demand extensive economic resources to establish them. High-speed video microscopy analysis (HSVMA) is the only diagnostic tool to visualize and analyze living respiratory cells with beating cilia in vitro. It is fast, cost-effective, and, in experienced hands, very reliable as a diagnostic tool for PCD. In addition, classical diagnostic measures such as transmission electron microscopy (TEM) are not applicable for some mutations as morphological changes are absent. 
This paper describes the process of collecting respiratory epithelial cells, the further preparation of the specimen, and the process of HSVMA. We also describe how brushed cells can be successfully kept unharmed and beating by keeping them in a nourishing medium for storage and transport to the investigation site in cases where a clinic does not possess the equipment to perform HSVMA. Also shown are videos with pathologic beating patterns from patients with a mutation in the dynein arm heavy chain 11 gene (DNAH11), which cannot be diagnosed with TEM; the result of an inconclusive HSVMA due to infection of the upper airways, as well as an unsuccessful brushing with superimposition of red blood cells. With this article, we would like to encourage every unit dealing with pulmonology patients and rare lung diseases to perform HSVMA as part of their daily routine diagnostics for PCD or send the specimens over to a center specializing in performing HSVMA.

High-speed video microscopy analysis is a relatively easy-to-perform, fast, cost-effective, and, in experienced hands, a considerably reliable tool for first-line diagnostics of primary ciliary dyskinesia, which should be available in every center involved in diagnostics and the treatment of severe lung diseases.

Análisis de microscopía de video de alta velocidad para el diagnóstico de primera línea de discinesia ciliar primaria

Primary ciliary dyskinesia (PCD) is a congenital disorder predominantly inherited in an autosomal recessive trait. The disorder causes disturbance in the ...