Name: basophil activation test for allergy diagnosis
Uploaded: 2021-05-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis at JoVE.com

Vi tackar Claudia Corazza för hennes ovärderliga engelskspråkiga stöd. Detta arbete stöddes av hälsoinstitutet "Carlos III" (ISCIII) från MINECO (bidrag som medfinansieras av ERUF: "Una manera de hacer Europa"; Bidrag nr PI20/01715; PI18/00095; PI17/01410; PI17/01318; PI17/01237 och RETIC ARADYAL RD16/0006/0001; Andalusiens regionala hälsoministerium (bidrag nr PI-0127-2020, PIO-0176-2018; PE-0172-2018; PE-0039-2018; PC-0098-2017; PI-0075-2017; PI-0241-2016). ID är en klinisk prövare (B-0001-2017) och AA har ett Senior Postdoctoral Contract (RH-0099-2020), båda stöds av andalusiska regionala hälsoministeriet (samfinansierat av ESF: "Andalucía se mueve con Europa").

Protokollutförandet genomfördes i enlighet med Helsingforsdeklarationens principer och godkändes av den lokala etikkommittén (Comité de Ética para la Investigación Provincial de Málaga, Spanien). Alla försökspersoner informerades muntligt om forskningsstudien och de undertecknade motsvarande formulär för informerat samtycke.
Det här protokollet beskriver BAT-proceduren som författarna använder dagligen. Detta är dock inte en standardiserad metod och skillnader med för...

BAT är ett kompletterande in vitro-diagnostiskt test för utvärdering av IgE-medierade allergiska reaktioner som har visat sig vara användbart vid diagnos av reaktioner som induceras av olika utlösare såsom läkemedel, mat eller inhalationsmedel, liksom i vissa former av kronisk urtikaria. I allmänhet bör BAT-prestanda övervägas om i) allergenet/läkemedlet ger falskt positiva resultat vid ST; ii) allergenet/läkemedlet inte är tillgängligt för användning för ST- eller sIgE-kvantifiering; iii) det...

IgE-medierad allergidiagnos baseras på klinisk historia, hudtester (STs), kvantifiering av serumspecifik IgE (sIgE) och, om det krävs och indikeras, kontrollerade utmaningstester (CCT)1,2,3,4,5,6. Klinisk historia kan dock vara opålitlig eftersom det kan saknas korrekt information, och STs och CCT är inte riskfria förfaranden som kan kontraindiceras hos patienter som upplever allvarliga livshotande reaktioner 1,2,3,4,5,6 . Dessa frågor, tillsammans med det faktum att bestämningen av sIgE genom validerade och kommersiella fluorenzymimmunanalyser endast är tillgänglig för få allergener och läkemedel, har belyst den viktiga rollen för andra in vitro-funktionella analyser såsom basofilaktiveringstest (BAT).
Basofiler är viktiga effektorceller som är involverade i IgE-medierade allergiska reaktioner som aktiveras vid tvärbindning av intilliggande sIgE bunden på receptorer med hög affinitet (FcεRI) på cellytan efter allergen / läkemedelsexponering. Basofilaktivering utlöser celldegranulering och frisättning av förformade och nya syntetiserade inflammatoriska mediatorer som ingår i intracytoplasmatiska sekretionsgranuler 7,8,9. BAT är en in vitro-metod som försöker efterlikna basofilaktiveringen i närvaro av en stimulans (allergen eller läkemedel) och bestämmer förändringar i uttrycket av basofilaktiveringsmarkörer genom flödescytometri 7,10. Det finns olika strategier för att identifiera basofiler (IgE+, CCR3+, CRTH2+, CD203c+) och för att mäta cellaktivering (främst uppreglering av CD63 och CD203c) med hjälp av kombinationer av fluorokrommärkta antikroppar 7,10. CD63, den bästa kliniskt validerade aktiveringsmarkören 11,12,13,14, är ett membranprotein förankrat vid sekretoriska granuler innehållande histamin som efter cellaktivering och fusion av granulerna med membranet uttrycks på basofilytan 15,16,17,18,19,20,21 . CD203c är en ytmarkör som är konstitutivt uttryckt på basofiler och uppreglerad efter FcεRI-stimulering, vilket också har visat tillförlitliga resultat i BAT 15,22,23,24,25. Dessutom verkar det samuttrycka med CD6326.
Under de senaste decennierna har BAT visat sig vara användbart vid diagnos av IgE-medierade allergiska reaktioner som induceras av olika utlösare som läkemedel, mat eller inhalationsmedel, liksom i vissa former av kronisk urtikaria, som beskrivs nedan. Positionen för denna teknik i de diagnostiska algoritmerna är emellertid mycket variabel och inte väl bestämd.
Läkemedelsöverkänslighet BAT har visat sig vara användbart som ett kompletterande test för utvalda läkemedel och patienter, särskilt för dem som upplever allvarliga reaktioner på grund av att diagnostiskt värde för ST inte är väl etablerat för de flesta läkemedel, eftersom de är validerade och standardiserade för ett begränsat antal läkemedel27,28,29,30. Dessutom är kvantifiering av sIgE endast tillgänglig för ett begränsat antal läkemedel, med lägre känslighet än ST 27,28,29,30,31,32. Därför är diagnosen läkemedelsöverkänslighet vanligtvis beroende av drogprovokationstest, vilket kan kontraindiceras hos personer som upplever allvarliga livshotande reaktioner33.
Lovande resultat har rapporterats för användning av BAT hos utvalda patienter som rapporterar omedelbara överkänslighetsreaktioner mot olika läkemedel som betalactams (BLs)20,34,35,36,37,38,39, neuromuskulära blockerande medel (NMBA)19,22,40,41,42, 43,44,45, fluorokinoloner (FQ)46,47,48,49, pyrazoloner 50,51,52, radiokontrastmedel (RCM)53,54,55,56 och platinaföreningar 57,58,59 . BAT har rapporterats ha en känslighet och specificitet mellan 51,7–66,9 % respektive 89,2–97,8 %. och positiva och negativa prediktiva värden beskrivs ligga mellan 93,4% respektive 66,3%,27,31. Dessutom har BAT föreslagits som en prediktiv biomarkör för genombrottsreaktioner under desensibilisering med platinaföreningar, eftersom CD203c-uttrycket ökar jämfört med CD63 hos patienter med hög risk för biverkningar under läkemedelsdesensibilisering57.
Det är värt att notera att BAT endast är användbart vid överkänslighet mot läkemedel när reaktionen innefattar basofildegranulering. Därför är det inte användbart vid reaktioner som härrör från enzymatisk hämning av cyklooxygenas 142.
Födoämnesallergi BAT har framstått som ett potentiellt diagnostiskt verktyg för födoämnesallergi eftersom bestämning av serum-sIgE till hela allergenextraktet eller enstaka allergener ofta är tvetydig, vilket kräver oral matutmaning för att bekräfta diagnosen, vilket, i likhet med läkemedelsöverkänslighet, är ett kostsamt och inte riskfritt förfarande60. Flera studier har visat relevanta resultat med komjölk 61,62, ägg 61,63, vete 64,65,66,67,68, jordnöt 63,69,70,71,72, hasselnöt 73,74,75,76 ,77, skaldjur78, persika 79,80,81, äpple21, selleri och morot 82,83.
Det främsta mervärdet av BAT vid diagnos av födoämnesallergi jämfört med STs och sIgE i serum är att det visar en högre specificitet och liknande känslighet. Således är BAT ett användbart verktyg för att skilja kliniskt allergiska patienter från sensibiliserade, men toleranta, patienter som har både hög specificitet (75-100%) och känslighet (77-98%)63,69,84. Känslighets- och specificitetsvärden beror på allergenet och andra faktorer som fenotyper (t.ex. oralt allergisyndrom kontra anafylaxi), ålder och geografirelaterade sensibiliseringsmönster63,85.
BAT med användning av enstaka allergenkomponenter kan potentiellt förbättra diagnostisk noggrannhet för vissa livsmedelsallergener61,80. Det finns studier med frölagringsproteiner (t.ex. Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3 och Ara h 6 från jordnöt)86; lipidöverföringsproteiner (t.ex. Pru p 3 från persika och Ara h 9 från jordnötter)80,86; och Bet v 1 homologer (t.ex. Ara h 8 från jordnöt)87. Andra potentiella verktyg är relaterade till identifieringen av det skyldige allergenet i fall av pollen-matallergisyndrom 21,87,88, allergi mot rött kött 89 eller matberoende träningsinducerad anafylaxi66.
Intressant nog kan BAT ge information om svårighetsgraden och tröskeln för allergiska reaktioner eftersom patienter med allvarligare reaktioner uppvisar en större andel aktiverade basofiler, vilket observerats i studier av jordnöts- och komjölkallergiska patienter 84,90,91; och patienter som reagerar på spårmängder av allergenet visar en större basofilkänslighet 84,90,92. Dessa data tyder på att BAT kan vara användbart för att identifiera högriskallergiska patienter som kräver närmare uppföljning och mer intensifierad utbildning93. Dessutom har det rapporterats att BAT kan förutsäga svar på livsmedelsutmaningen 70,91,92,94 och tröskelvärden för reaktivitet90,95 för att avgöra när livsmedel säkert kan (åter)införas 84. Emellertid, dessa resultat är kontroversiella i vissa studier63,96 och mer forskning krävs.
Å andra sidan har BAT använts för att övervaka upplösningen av födoämnesallergi, antingen naturligt eller under immunmodulerande behandlingar, över tid, som hittills endast har bedömts genom oral livsmedelsutmaning, med tillhörande risker och kostnader 84,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106 ,107,108. Dessutom har det också använts för att övervaka effekten av omalizumab vid födoämnesallergi eftersom basofilaktiveringen minskar under behandling med omalizumab, men det ökar efter avslutad behandling109.
Inhalationsallergi BAT är sällan fördelaktigt vid inhalationsallergi eftersom diagnos rutinmässigt kan fastställas genom sIgE-kvantifiering och ST. I fall av lokal allergisk rinit (omätbara nivåer av sIgE och negativa ST med positiva näsprovokationstester) har BAT dock tillåtit diagnos i 50% av fallen110. Det har vidare rapporterats en korrelation mellan basofilkänslighet och svar på nasal/bronkial provokationstester, samt mellan astmans svårighetsgrad och effekt av behandling med omalizumab111,112.
BAT har också använts för att övervaka allergenimmunterapi för husdammkvalster och pollen, eftersom basofilkänsligheten minskar under immunterapi, sannolikt på grund av interferens av blockerande IgG-antikroppar 113,114,115,116,117.
Hymenopteragiftallergi Diagnos av hymenoptera giftallergi baseras rutinmässigt på ST och serum sIgE. BAT har visat en hög känslighet (85-100%) och specificitet (83-100%) och det har rapporterats vara användbart i fall som ger tvetydiga resultat eller hos patienter med en suggestiv klinisk historia av giftallergi men omätbar sIgE och negativ ST118,119. BAT verkar dock inte förutsäga allvarlighetsgraden för dessa reaktioner 120 121.
Upp till 60% av patienterna uppvisar sIgE till både geting- och bigift, och identifieringen av dominerande allergen är avgörande för adekvat immunterapibehandling. I dessa fall har BAT rapporterats vara användbart vid identifiering av det dominerande allergenet 119,122,123,124. Även om sIgE till de viktigaste allergenerna hos bi- och getinggifter kan minska nyttan av BAT hos patienter med dubbel positivitet för båda gifterna, ger det användbar information främst hos patienter med negativa resultat i sIgE-bestämningar123.
Vissa studier tyder på att BAT kan vara användbart som en prediktiv biomarkör för biverkningar under uppbyggnadsfasen av giftimmunterapi eftersom detta behandlingsalternativ har rapporterats minska basofilkänsligheten. Reaktiviteten minskar dock inte och detta BAT-verktyg är numera kontroversiellt 13,120,125,126,127,128,129,130.
Urtikaria och angioödem En delmängd av kroniska urtikariapatienter har en autoinmun patofysiologi på grund av IgE-autoantikroppar mot autoallergener och IgG-autoantikroppar som riktar sig mot FcεRI- eller IgE-FcεRI-komplex som finns på mastcellytan 131 132. I klinisk praxis har diagnos av denna typ av kronisk urtikaria förlitat sig på positivt autologt serum ST, vilket har risk för oavsiktlig infektion. BAT har föreslagits som ett in vitro-test för att diagnostisera och övervaka patienter med misstänkt kronisk urtikaria. Både CD63- och CD203c-uttryck på ytan av basofiler har rapporterats ökas efter stimulering med serum från kroniska urtikariapatienter, vilket visar detektion av aktiva autoantikroppar 133 134 135 136 137. Nyligen har det rapporterats att patienter med positiv BAT ofta upplever det mest aktiva sjukdomstillståndet, bedömt med urtikaria aktivitetspoäng, och kräver högre doser av antihistaminer tillsammans med tredje linjens behandlingar (ciklosporin A eller omalizumab), jämfört med dem med negativ BAT138.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, without Cap, Nonsterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD193 (CCR3) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>310708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCalibur Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD63 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>353006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Solution 10x concentrated</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Formyl-Met-Leu-Phe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD203c (E-NPP3) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>324606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse Anti-Human IgE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-3</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>203-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheath Fluid</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>342003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUBE 9 mL LH Lithium Heparin</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>455084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

basophil activation test for allergy diagnosis

Basofilaktiveringstestet (BAT) är ett kompletterande in vitro-diagnostiskt test som kan användas utöver klinisk historia, hudtest (ST) och specifik IgE (sIgE) bestämning vid utvärdering av IgE-medierade allergiska reaktioner mot mat, insektsgift, läkemedel samt vissa former av kronisk urtikaria. Emellertid är denna tekniks roll i de diagnostiska algoritmerna mycket varierande och inte väl bestämd.
BAT baseras på bestämning av basofilsvaret på allergen/läkemedels tvärbindande IgE-aktivering genom mätning av aktiveringsmarkörer (såsom CD63, CD203c) genom flödescytometri. Detta test kan vara ett användbart och kompletterande verktyg för att undvika kontrollerade utmaningstester för att bekräfta allergidiagnos, särskilt hos personer som upplever allvarliga livshotande reaktioner. I allmänhet bör BAT:s prestanda övervägas om i) allergenet/läkemedlet ger falskt positiva resultat i ST; ii) det inte finns någon allergen/läkemedelskälla att använda för bestämning av ST eller sIgE; iii) det finns diskordans mellan patienthistoria och ST- eller sIgE-bestämning; iv) symtom tyder på att ST kan leda till systemiskt svar; v) innan man överväger en CCT för att bekräfta det skyldige allergenet / läkemedlet. Testets huvudsakliga begränsningar är relaterade till icke-optimal känslighet, särskilt vid läkemedelsallergi, behovet av att utföra testet inte längre än 24 timmar efter provutvinning och bristen på standardisering mellan laboratorier när det gäller procedurer, koncentrationer och cellmarkörer.

BAT som utförs med allergener eller läkemedel möjliggör undersökning av IgE-beroende överkänslighetsreaktioner. Basofilreaktivitet bör mätas i minst två optimala koncentrationer för att uppnå bästa resultat34 och aktiveringen visualiseras genom uppreglering av CD63 på cellytan. När det gäller allergener, dessutom, för att bekräfta basofilreaktiviteten, bör basofilkänsligheten analyseras genom att mäta reaktiviteten vid flera minskande allergenkoncentrationer1...

Watch this Scientific Journal Video about Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis at JoVE.com

Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis

Basofilaktiveringstestet är ett kompletterande in vitro-diagnostiskt test för utvärdering av IgE-medierade allergiska reaktioner baserat på detektion av basofilaktivering i närvaro av en specifik stimulans genom måttet av aktiveringsmarkörer genom flödescytometri.

Basofilaktiveringstest för allergidiagnos

The basophil activation test (BAT) is a complementary in vitro diagnostic test that can be used in addition to clinical history, skin test (ST), and ...

Basofilaktiveringstestet är ett gratis in vitro-diagnostiskt test för utvärdering av IgE-medierade allergiska reaktioner som har visat sig vara användbara för reaktioner inducerade av läkemedel, mat eller inhalationsmedel, liksom i vissa former av kronisk urtikaria. Detta test är baserat på bestämning av basofilsvar på ett allergen eller läkemedelskorslänkande IgE-aktivering genom mätning av aktiveringsmarkörer genom flödescytometri. Basofilaktiveringstestet kan vara ett användbart och gratis verktyg för att undvika kontrollerade utmaningstester för att bekräfta allergidiagnos, särskilt hos personer som upplever allvarliga livshotande reaktioner.Dessutom har detta test fördelen att kunna analysera svaret mot något läkemedel eller allergen jämfört med andra in vitro-metoder som endast är tillgängliga för ett fåtal läkemedel och allergener. Testets huvudsakliga begränsningar är relaterade till icke-optimal känslighet, särskilt vid läkemedelsallergi. Behovet av att utföra testet inte längre än 24 timmar efter provutvinning och bristen på standardisering mellan laboratorier och diagnostiska algoritmer.Börja med att samla perifert blod i nio milliliter hepariniserade rör och placera proverna i en rotor för att hålla dem vid rumstemperatur tills de krävs för experimentprotokollet. Märk två fem milliliter cytometerrör vardera för negativ kontroll och positiv kontroll. Märk också ett rör vardera för de olika allergen- eller läkemedelskoncentrationerna som testas.Placera sedan rören i ett ställ så att rören passar perfekt utan att glida. För den första positiva kontrollen, förbered en fyra mikromolär lösning av N-Formylmetionyl-leucyl-fenylalanin eller fMLP i 0,05% PBS-T För att bekräfta kvaliteten på basofiler. För den andra positiva kontrollen, förbered en 0,05 milligram per milliliter anti-IgE-lösning med användning av PBS-T.Förbered färgningsblandningen genom att tillsätta en mikroliter vardera av CCR3-APC-, CD203c-PE- och CD63-FITC-antikroppar per 20 mikroliter av stimuleringsbufferten. Tillsätt sedan 23 mikroliter av denna färgningsblandning till varje rör. Tillsätt 100 mikroliter PBS-T till de negativa kontrollrören.Tillsätt 100 mikroliter fMLP till ett av de positiva kontrollrören och tillsätt 100 mikroliter anti-IgE E till det andra till resten av rören. Tillsätt 100 mikroliter av de olika allergen- eller läkemedelskoncentrationerna och inkubera vid 37 grader Celsius i 10 minuter. Efter inkubation, tillsätt 100 mikroliter blod till varje rör försiktigt för att undvika hemolys.Virvla sedan försiktigt rören och inkubera dem i 25 minuter vid 37 grader Celsius i det termostatiska badet med medium omrörning. Håll rören vid fyra grader Celsius i minst fem minuter för att stoppa degranuleringen. Till varje rör, tillsätt två milliliter lysbuffert för att lysera erytrocyterna.Vörda varje rör och inkubera sedan rören i fem minuter vid rumstemperatur. Centrifugera rören vid 300 g vid fyra grader Celsius i fem minuter. Vänd sedan racket i diskbänken för att dekantera supernatanten medan cellerna förblir längst ner på rören.Tillsätt tre milliliter PBS-T till varje rör för att tvätta cellerna och virvla rören. Utför en andra centrifugeringsrunda med samma uppsättning parametrar och dekantera supernatanten genom att välta racket i diskbänken. Håll sedan proverna vid fyra grader Celsius skyddade från ljus tills flödescytometri.Anslut flödescytometern till datorprogramvaran och vänta tills cytometern är klar. Ladda mall- och instrumentinställningarna enligt beskrivningen i textmanuskriptet. Starta processen för provförvärv.För att välja aktiverade basofiler, grinda först lymfocyterna från sidospridningsspridningsdiagrammet. Porta sedan basofilerna från lymfocytpopulationen som CCR3 + CD203c + celler och förvärva minst 500 basofiler per rör. Ställ in CD63-tröskeln på cirka 2,5% med hjälp av de negativa kontrollrören och analysera proverna.IgE-beroende överkänslighetsreaktioner undersöktes genom att utföra ett basofilaktiveringstest, eller BAT, med hjälp av allergener och läkemedel. Basofilkänslighet analyserades genom att mäta reaktiviteten vid flera minskande allergenkoncentrationer som hjälper till att bestämma den allergiska koncentrationen som inducerar svaret på 50% basofiler eller EC50. Först gated lymfocyter från sidospridningsspridningsdiagrammet.Sedan gated basofiler från lymfocytpopulationen som CCR3 + CD203c + celler. Därefter användes en CCR3-CD63-plot för att analysera basofilaktivering med CD63 som en aktiveringsmarkör för två läkemedel och olika koncentrationer av ett allergen. Testet utförs med färskt helblod och måste utföras inte längre än 24 timmar efter bloduttag.Den stimulans som används i testet bör inte innehålla några hjälpämnen och läkemedlets kemiska egenskaper måste beaktas. Andra ytterligare in vitro-metoder för diagnos av IgE-medierade allergiska reaktioner, eller bestämning av sIgE, eller histaminfrisättningstestet.

basophil-activation-test-for-allergy-diagnosis

Research

JoVE Journal

Medicine

FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis

Pre-implantation genetic diagnosis (PGD) is an established alternative to pre-natal diagnosis, and involves selecting pre-implantation embryos from a cohort generated by assisted reproduction technology (ART). This selection may be required because of familial monogenic disease (e.g. cystic fibrosis), or because one partner carries a chromosome rearrangement (e.g. a two-way reciprocal translocation). PGD is available for couples who have had previous affected children, and/or in the case of chromosome rearrangements, recurrent miscarriages, or infertility. Oocytes aspirated following ovarian stimulation are fertilized by in vitro immersion in semen (IVF) or by intracytoplasmic injection of an individual spermatozoon (ICSI). Pre-implantation cleavage-stage embryos are biopsied, usually by the removal of a single cell on day 3 post-fertilization, and the biopsied cell is tested to establish the genetic status of the embryo. Fluorescence in situ hybridization (FISH) on the fixed nuclei of biopsied cells with target-specific DNA probes is the technique of choice to detect chromosome imbalance associated with chromosome rearrangements, and to select female embryos in families with X-linked disease for which there is no mutation-specific test. FISH has also been used to screen embryos for spontaneous chromosome aneuploidy (also known as PGS or PGD-AS) in order to try and improve the efficiency of assisted reproduction; however, the predictive value of this test using the spreading and FISH technique described here is likely to be unacceptably low in most people's hands and it is not recommended for routine clinical use. We describe the selection of suitable probes for single-cell FISH, spreading techniques for blastomere nuclei, and in situ hybridization and signal scoring, applied to PGD in a clinical setting.

This article describes the selection of suitable probes for single-cell FISH, spreading techniques for blastomere nuclei, and in situ hybridization and signal scoring, applied to pre-implantation genetic diagnosis (PGD) in a clinical setting.

Fisk för preimplantatorisk genetisk diagnos

Pre-implantation genetic diagnosis (PGD) is an established alternative to pre-natal diagnosis, and involves selecting pre-implantation embryos from a ...

The Trier Social Stress Test Protocol for Inducing Psychological Stress

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting. Protocols that allow researchers to study the biological pathways of the stress response in health and disease are fundamental to the progress of research in stress and anxiety.1 Although numerous protocols exist for inducing stress response in the laboratory, many neglect to provide a naturalistic context or to incorporate aspects of social and psychological stress. Of psychological stress protocols, meta-analysis suggests that the Trier Social Stress Test (TSST) is the most useful and appropriate standardized protocol for studies of stress hormone reactivity.2 In the original description of the TSST, researchers sought to design and evaluate a procedure capable of inducing a reliable stress response in the majority of healthy volunteers.3 These researchers found elevations in heart rate, blood pressure and several endocrine stress markers in response to the TSST (a psychological stressor) compared to a saline injection (a physical stressor).3 Although the TSST has been modified to meet the needs of various research groups, it generally consists of a waiting period upon arrival, anticipatory speech preparation, speech performance, and verbal arithmetic performance periods, followed by one or more recovery periods. The TSST requires participants to prepare and deliver a speech, and verbally respond to a challenging arithmetic problem in the presence of a socially evaluative audience.3 Social evaluation and uncontrollability have been identified as key components of stress induction by the TSST.4 In use for over a decade, the goal of the TSST is to systematically induce a stress response in order to measure differences in reactivity, anxiety and activation of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) or sympathetic-adrenal-medullary (SAM) axis during the task.1 Researchers generally assess changes in self-reported anxiety, physiological measures (e.g. heart rate), and/or neuroendocrine indices (e.g. the stress hormone cortisol) in response to the TSST. Many investigators have adopted salivary sampling for stress markers such as cortisol and alpha-amylase (a marker of autonomic nervous system activation) as an alternative to blood sampling to reduce the confounding stress of blood-collection techniques. In addition to changes experienced by an individual completing the TSST, researchers can compare changes between different treatment groups (e.g. clinical versus healthy control samples) or the effectiveness of stress-reducing interventions.1

This article describes a protocol for inducing psychological stress in participants, which enables researchers to measure psychological, physiological and neuroendocrine responses to stress within single participants or between groups.

Den Trier Social Stress Test protokoll för att framkalla psykisk stress

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting.  Protocols that allow researchers to study the biological ...

Transabdominal Ultrasound for Pregnancy Diagnosis in Reeves' Muntjac Deer

Reeves' muntjac deer (Muntiacus reevesi) are a small cervid species native to southeast Asia, and are currently being investigated as a potential model of prion disease transmission and pathogenesis. Vertical transmission is an area of interest among researchers studying infectious diseases, including prion disease, and these investigations require efficient methods for evaluating the effects of maternal infection on reproductive performance. Ultrasonographic examination is a well-established tool for diagnosing pregnancy and assessing fetal health in many animal species1-7, including several species of farmed cervids8-19, however this technique has not been described in Reeves' muntjac deer. Here we describe the application of transabdominal ultrasound to detect pregnancy in muntjac does and to evaluate fetal growth and development throughout the gestational period. Using this procedure, pregnant animals were identified as early as 35 days following doe-buck pairing and this was an effective means to safely monitor the pregnancy at regular intervals. Future goals of this work will include establishing normal fetal measurement references for estimation of gestational age, determining sensitivity and specificity of the technique for diagnosing pregnancy at various stages of gestation, and identifying variations in fetal growth and development under different experimental conditions.

Transabdominal Ultrasound for Pregnancy Diagnosis in Reeves&#039; Muntjac Deer

Transabdominal ultrasound is described as an effective, noninvasive means for assessing reproductive status in Reeves' muntjac deer. These methods can be used to achieve early pregnancy diagnosis and to evaluate fetal viability. Future applications of this technique include estimation of gestational age and effects of maternal disease on fetal development.

Transabdominal ultraljud för graviditetsdiagnos i Reeves Muntjac Hjort

Reeves' muntjac deer (Muntiacus reevesi) are a small cervid species native to southeast Asia, and are currently being investigated as a potential model of ...

Diagnosis of Musculus Gastrocnemius Tightness - Key Factors for the Clinical Examination

Common foot and ankle pathologies have been linked to isolated Musculus gastrocnemius tightness (MGT). Various examination techniques have been described to assess MGT. Still, a standardized examination procedure is missing. Literature argues for weightbearing examination but the degree of knee flexion needed to eliminate the restraining effect of the M. gastrocnemius on ankle dorsiflexion (ADF) is unknown. This manuscript investigates the effect of knee flexion on ankle dorsiflexion and provides a detailed description of a standardized examination protocol. Examination on 20 healthy individuals revealed, that 20&#176; of knee flexion is sufficient to fully eliminate the influence of the M. gastrocnemius on ADF. This builds the prerequisite for a standardized examination for MGT. Non-weightbearing and weightbearing examination of ADF has to be conducted with the knee fully extended and at least 20&#176; flexed. Two investigators should conduct non-weightbearing testing with the subject in supine position. In order to obtain reliable results, the axis of the fibula should be marked. One examiner can conduct weightbearing examination with the subject in lunge stance. Isolated MGT is present if ADF is impaired with the knee fully extended and knee flexion results in a significant ADF increase. The herein presented standardized examination is the prerequisite for future studies aiming at establishing norm values.

Diagnosis of Musculus Gastrocnemius Tightness - Key Factors for the Clinical Examination

Isolated Musculus gastrocnemius tightness is a common cause for foot and ankle pathologies. Currently no standardized examination procedure exists. This manuscript demonstrates that 20 degree of knee flexion eliminates the restraining effect of the M. gastrocnemius on ankle dorsiflexion and presents a video description of a standardized examination protocol.

diagnos av<em&gt; Musculus Gastrocnemius</em&gt; Täthet - nyckelfaktorer för den kliniska undersökningen

Common foot and ankle pathologies have been linked to isolated Musculus gastrocnemius tightness (MGT). Various examination techniques have been described ...

Hydra, a Computer-Based Platform for Aiding Clinicians in Cardiovascular Analysis and Diagnosis

Cardiovascular diseases (CVDs) are the leading cause of death throughout the world. The total risk of developing CVD is determined by the combined effect of different cardiovascular risk factors (e.g., diabetes, raised blood pressure, unhealthy diet, tobacco use, stress, etc.) that commonly coexist and act multiplicatively. Most CVDs can be prevented by an early identification of the highest risk factors and an appropriate treatment. The stratification of cardiovascular risk factors involves a wide range of parameters and tests that specialists use in their clinical practice. In addition to cardiovascular (CV) risk stratification, ambulatory blood pressure monitoring (ABPM) also provides relevant information for diagnostic and treatment purposes. This work presents a list of protocols based on the Hydra platform, a web-based system for clinical decision support which incorporates a set of functionalities and services that are required for complete cardiovascular analysis, risk assessment, early diagnosis, treatment and monitoring of patients over time. The program includes tools for inputting and managing comprehensive patient data, organized into different checkups to track the evolution over time. It also has a risk stratification tool to compute a CV risk factor based upon several risk stratification tables of reference. Additionally, the program includes a tool that incorporates ABPM analysis and allows the extraction of valuable information by monitoring blood pressure over a specific period of time. Finally, the reporting service summarizes the most relevant information in a set of reports that aid clinicians in their clinical decision-making process.

This article presents a protocol based on Hydra &#8212; a web-based system for clinical decision support that integrates a full and detailed set of functionalities and services required by physicians for complete cardiovascular analysis, risk assessment, early diagnosis, treatment, and monitoring over time.

Hydra, en dator-baserad plattform för medhjälp kliniker i hjärt-analys och diagnos

Cardiovascular diseases (CVDs) are the leading cause of death throughout the world. The total risk of developing CVD is determined by the combined effect ...

International Expert Consensus and Recommendations for Neonatal Pneumothorax Ultrasound Diagnosis and Ultrasound-guided Thoracentesis Procedure

Pneumothorax (PTX) represents accumulation of the air in the pleural space. A large or tension pneumothorax can collapse the lung and cause hemodynamic compromise, a life-threatening disorder. Traditionally, neonatal pneumothorax diagnosis has been based on clinical images, auscultation, transillumination, and chest X-ray findings. This approach may potentially lead to a delay in both diagnosis and treatment. The use of lung US in diagnosis of PTX together with US-guided thoracentesis results in earlier and more precise management. The recommendations presented in this publication are aimed at improving the application of lung US in guiding neonatal PTX diagnosis and management.

Pneumothorax is a common emergency and critical disease in newborn infants that needs rapid, clear diagnosis and timely treatment. Diagnosis and treatment based on chest X-rays are associated with delayed management and radiation damage. Lung ultrasound (US) provides useful guidance for rapid, accurate diagnosis and the precise thoracentesis of pneumothorax.

Internationell expert konsensus och rekommendationer för neonatal pneumothorax ultraljuddiagnos och ultraljud-guidad thoracentes förfarande

Pneumothorax (PTX) represents accumulation of the air in the pleural space. A large or tension pneumothorax can collapse the lung and cause hemodynamic ...

Diagnosis and Surgical Treatment of Human Brucellar Spondylodiscitis

Brucellar spondylodiscitis (BS) is the most prevalent and significant osteoarticular presentation of human Brucellosis, which is commonly manifested in pastoral communities. It is difficult to differentially diagnose and usually leads to irreversible neurologic deficits and spinal deformities. The initial diagnosis of BS is based on clinical findings and radiographic assessments, and the confirmed diagnosis should be established by the isolation of Brucella species from the blood and/or the standard tube agglutination test. Differential diagnosis of multifocal BS from either degenerative disc diseases or tuberculosis is especially highlighted. The surgical approach, either endoscopic or open, is demonstrated in detail, accompanied by radiographic evidence of structural compression or severe instability. Further, the crucial surgical steps, including single-stage transforaminal decompression, debridement, interbody fusion, and internal fixation, are explained. Moreover, perioperative care and postoperative rehabilitation are also addressed. Taken together, this clinical algorithm presents a practical guide that has yielded substantially satisfactory outcomes in the past decades, which can also be introduced for large-scale application to manage human BS, especially in endemic regions.

We describe a clinical algorithm, based on decades of front-line experience of diagnosis and surgical treatment of human Brucellar spondylodiscitis in the largest medical center of the China's Xinjiang Pastoral Area.

Diagnos och kirurgisk behandling av human brucellar spondylodiscitis

Brucellar spondylodiscitis (BS) is the most prevalent and significant osteoarticular presentation of human Brucellosis, which is commonly manifested in ...

Testing Acetylcholine Followed by Adenosine for Invasive Diagnosis of Coronary Vasomotor Disorders

More than 50% of patients with signs and symptoms of myocardial ischemia undergoing coronary angiography have unobstructed coronary arteries. Coronary vasomotor disorders (impaired vasodilatation and/or enhanced vasoconstriction/spasm) represent important functional causes for such a clinical presentation. Although impaired vasodilatation may be assessed with non-invasive techniques such as positron emission tomography or cardiac magnetic resonance imaging, there is currently no reliable non-invasive technique for the diagnosis of coronary spasm available. Thus, invasive diagnostic procedures (IDP) have been developed for the diagnosis of coronary vasomotor disorders including spasm testing as well as assessment of coronary vasodilatation. The identification of the underlying type of disorder (so called endotype) allows the initiation of targeted pharmacological treatments. Despite the fact that such an approach is recommended by the current European Society of Cardiology guidelines for the management of chronic coronary syndromes based on the CorMicA study, comparability of results as well as multicenter trials are currently hampered by major differences in institutional protocols for coronary functional testing. This article describes a comprehensive IDP protocol including intracoronary acetylcholine provocation testing for diagnosis of epicardial/microvascular spasm, followed by Doppler wire-based assessment of coronary flow reserve (CFR) and hyperemic microvascular resistance (HMR) in search of coronary vasodilatory impairment.

Coronary vasomotion disorders represent frequent functional causes of angina in patients with unobstructed coronaries. The underlying mechanism of angina (endotype) in these patients can be determined by a comprehensive invasive diagnostic procedure based on acetylcholine provocation testing followed by Doppler-derived assessment of the coronary flow reserve and microvascular resistance.

Testa acetylkolin följt av adenosin för invasiv diagnos av koronar vasomotoriska störningar

More than 50% of patients with signs and symptoms of myocardial ischemia undergoing coronary angiography have unobstructed coronary arteries. Coronary ...

Measurement of Myocardial Lactate Production for Diagnosis of Coronary Microvascular Spasm

In about a quarter of patients with angina and non-obstructive coronary arteries, no epicardial spasm is noted on coronary arteriography during an angina attack. Since the pressure-rate product is almost identical at rest and the onset of attack in those patients, the decrease in coronary blood flow rather than increased myocardial oxygen consumption is likely to explain myocardial ischemia, indicating a substantial involvement with coronary microvascular spasm (MVS). Myocardial lactate production, which could be defined as a negative myocardial lactate extraction ratio (ratio of the coronary arterial-venous difference in lactate concentration to arterial concentration), is considered indicative of objective evidence to support the emerging myocardial ischemia. Thus, monitoring of the myocardial lactate production and the emergence of chest pain and ischemic electrocardiographic changes during acetylcholine (ACh) provocation testing is of significant value for detecting the entity of MVS. Practically, 1 min after incremental doses of ACh (20, 50, and 100 &#956;g) are administered into the left coronary artery (LCA), paired samples of 1 mL of blood are collected from the LCA ostium and coronary sinus for measurement of lactate concentration by a calibrated automatic lactate analyzer. Then, the development of MVS could be confirmed by negative myocardial lactate extraction ratio despite the absence of angiographically demonstrable epicardial coronary spasm or before its occurrence throughout ACh provocation testing. In conclusion, assessment of myocardial lactate production is essential and valuable for the diagnosis of MVS.

Myocardial lactate production (coronary arterial-venous difference in serum lactate level) during coronary spasm provocation testing is considered as a highly sensitive marker that reflects acetylcholine-induced myocardial ischemia due to microvascular spasm. This article presents the procedures to assess myocardial lactate production for the diagnosis of coronary microvascular spasm.

Mätning av myokardlaktatproduktion för diagnos av koronar mikrovaskulär spasm

In about a quarter of patients with angina and non-obstructive coronary arteries, no epicardial spasm is noted on coronary arteriography during an angina ...

High-speed Video Microscopy Analysis for First-line Diagnosis of Primary Ciliary Dyskinesia

Primary ciliary dyskinesia (PCD) is a congenital disorder predominantly inherited in an autosomal recessive trait. The disorder causes disturbance in the motion of cilia, leading to severe impairment of mucociliary clearance (MCC). If undiagnosed or diagnosed too late, the condition leads to the development of bronchiectasis and serious damage to the lungs in later life. Most of the methods for diagnosing PCD are time-consuming and demand extensive economic resources to establish them. High-speed video microscopy analysis (HSVMA) is the only diagnostic tool to visualize and analyze living respiratory cells with beating cilia in vitro. It is fast, cost-effective, and, in experienced hands, very reliable as a diagnostic tool for PCD. In addition, classical diagnostic measures such as transmission electron microscopy (TEM) are not applicable for some mutations as morphological changes are absent. 
This paper describes the process of collecting respiratory epithelial cells, the further preparation of the specimen, and the process of HSVMA. We also describe how brushed cells can be successfully kept unharmed and beating by keeping them in a nourishing medium for storage and transport to the investigation site in cases where a clinic does not possess the equipment to perform HSVMA. Also shown are videos with pathologic beating patterns from patients with a mutation in the dynein arm heavy chain 11 gene (DNAH11), which cannot be diagnosed with TEM; the result of an inconclusive HSVMA due to infection of the upper airways, as well as an unsuccessful brushing with superimposition of red blood cells. With this article, we would like to encourage every unit dealing with pulmonology patients and rare lung diseases to perform HSVMA as part of their daily routine diagnostics for PCD or send the specimens over to a center specializing in performing HSVMA.

High-speed video microscopy analysis is a relatively easy-to-perform, fast, cost-effective, and, in experienced hands, a considerably reliable tool for first-line diagnostics of primary ciliary dyskinesia, which should be available in every center involved in diagnostics and the treatment of severe lung diseases.

Höghastighetsvideomikroskopianalys för förstahandsdiagnos av primär ciliär dyskinesi

Primary ciliary dyskinesia (PCD) is a congenital disorder predominantly inherited in an autosomal recessive trait. The disorder causes disturbance in the ...