Name: basophil activation test for allergy diagnosis
Uploaded: 2021-05-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis at JoVE.com

Claudia Corazza'ya paha biçilmez İngilizce dil desteği için teşekkür ederiz. Bu çalışma, MINECO Sağlık Enstitüsü "Carlos III" (ISCIII) tarafından desteklenmiştir (ERDF tarafından ortaklaşa finanse edilen hibe: "Una manera de hacer Europa"; Hibe No. PI20/01715; PI18/00095; PI17/01410; PI17/01318; PI17/01237 ve RETIC ARADYAL RD16/0006/0001; Endülüs Bölge Sağlık Bakanlığı (Hibe No. PI-0127-2020, PIO-0176-2018; PE-0172-2018; PE-0039-2018; PC-0098-2017; PI-0075-2017; PI-0241-2016). ID, bir Klinik Araştırmacıdır (B-0001-2017) ve AA, her ikisi de Endülüs Bölge Sağlık Bakanlığı tarafından desteklenen bir Kıdemli Doktora Sonrası Sözleşmeye (RH-0099-2020) sahiptir (ESF tarafından ortaklaşa finanse edilmektedir: "Andalucía se mueve con Europa").

Protokol performansı Helsinki Deklarasyonu'na göre yürütülmüş ve yerel Etik Komitesi (Comité de Ética para la Investigación Provincial de Málaga, İspanya) tarafından onaylanmıştır. Tüm denekler araştırma çalışması hakkında sözlü olarak bilgilendirildi ve ilgili bilgilendirilmiş onam formunu imzaladılar.
NOT: Mevcut protokol, yazarların günlük olarak kullandıkları BAT prosedürünü detaylandırmaktadır. Bununla birlikte, bu standartlaştırılmış bi...

BAT, ilaçlar, yiyecekler veya inhalanlar gibi farklı tetikleyicilerin neden olduğu reaksiyonların yanı sıra bazı kronik ürtiker formlarında da yararlı olduğu gösterilen IgE aracılı alerjik reaksiyonların değerlendirilmesi için tamamlayıcı bir in vitro tanı testidir. Genel olarak, i) alerjen / ilaç ST'de yanlış pozitif sonuçlar üretiyorsa, BAT performansı dikkate alınmalıdır; ii) alerjen/ilacın ST veya sIgE ölçümü için kullanılamaması; iii) klinik öykü ile ST veya sIgE tayin...

IgE aracılı alerji tanısı klinik öykü, deri testleri (ST'ler), serum spesifik IgE'nin (sIgE) miktarının belirlenmesi ve eğer gerekli ve belirtilmişse kontrollü meydan okuma testlerine (SKK) dayanır 1,2,3,4,5,6. Bununla birlikte, klinik öykü güvenilmez olabilir, çünkü doğru bilgi eksikliği olabilir ve ST'ler ve SKH'ler, yaşamı tehdit eden ciddi reaksiyonlar yaşayan deneklerde kontrendike olabilecek risksiz prosedürler değildir 1,2,3,4,5,6 . Bu sorunlar, doğrulanmış ve ticari floro-enzim immünoassayları ile sIgE tayininin sadece birkaç alerjen ve ilaç için mevcut olduğu gerçeğiyle birlikte, bazofil aktivasyon testi (BAT) gibi diğer in vitro fonksiyonel testlerin önemli rolünü vurgulamıştır.
Bazofiller, alerjen / ilaç maruziyetinden sonra hücre yüzeyinde yüksek afiniteli reseptörlere (FcεRI) bağlı bitişik sIgE'nin çapraz bağlanması üzerine aktive olan IgE aracılı alerjik reaksiyonlarda rol oynayan anahtar efektör hücrelerdir. Bazofil aktivasyonu hücre degranülasyonunu ve intrasitoplazmatik sekresyon granüllerinde bulunan önceden oluşturulmuş ve yeni sentezlenmiş inflamatuar mediatörlerin salınımını tetikler 7,8,9. BAT, bir uyaran (alerjen veya ilaç) varlığında bazofil aktivasyonunu taklit etmeye çalışan ve akış sitometrisi 7,10 ile bazofil aktivasyon belirteçlerinin ekspresyonundaki değişiklikleri belirleyen in vitro bir yöntemdir. Bazofilleri (IgE +, CCR3 +, CRTH2 +, CD203c +) tanımlamak ve florokrom etiketli antikorların kombinasyonlarını kullanarak hücre aktivasyonunu ölçmek (esas olarak CD63 ve CD203c'nin yukarı regülasyonu) için farklı stratejiler vardır 7,10. CD63, klinik olarak doğrulanmış en iyi aktivasyon belirteci 11,12,13,14, histamin içeren salgı granüllerine tutturulmuş bir membran proteinidir ve hücre aktivasyonu ve granüllerin membranla füzyonundan sonra, bazofil yüzeyinde eksprese edilir 15,16,17,18,19,20,21 . CD203c, bazofiller üzerinde yapısal olarak eksprese edilen ve FcεRI stimülasyonundan sonra yukarı regüle edilen ve BAT 15,22,23,24,25'te güvenilir sonuçlar gösteren bir yüzey belirtecidir. Ayrıca, CD6326 ile birlikte ifade ediyor gibi görünüyor.
Son yıllarda, BAT'ın ilaçlar, yiyecekler veya inhalanlar gibi farklı tetikleyicilerin neden olduğu IgE aracılı alerjik reaksiyonların yanı sıra aşağıda açıklandığı gibi bazı kronik ürtiker formlarının teşhisinde yararlı olduğu gösterilmiştir. Bununla birlikte, bu tekniğin tanı algoritmalarındaki konumu oldukça değişkendir ve iyi belirlenmemiştir.
İlaç aşırı duyarlılığı BAT, seçilmiş ilaçlar ve hastalar için, özellikle de ST'nin tanısal değerinin çoğu ilaç için iyi belirlenmemesi nedeniyle ciddi reaksiyonlar yaşayanlar için, sınırlı sayıda ilaç için doğrulanmış ve standartlaştırılmış oldukları için tamamlayıcı bir test olarak yararlı olduğunu göstermiştir 27,28,29,30. Ek olarak, sIgE'nin nicelleştirilmesi, ST27,28,29,30,31,32'den daha düşük hassasiyete sahip sınırlı sayıda ilaç için kullanılabilir. Bu nedenle, ilaç aşırı duyarlılığının teşhisi genellikle hayatı tehdit eden ciddi reaksiyonlar yaşayan deneklerde kontrendike olabilen ilaç provokasyontestine dayanır 33.
Betalaktamlar (BL'ler) 20,34,35,36,37,38,39, nöromüsküler bloke edici ajanlar (NMBA'lar)19,22,40,41,42 gibi farklı ilaçlara anında aşırı duyarlılık reaksiyonları bildiren seçilmiş hastalarda BAT kullanımı için umut verici sonuçlar bildirilmiştir. 43,44,45, florokinolonlar (FQ'lar)46,47,48,49, pirazolonlar 50,51,52, radyokontrast madde (RCM)53,54,55,56 ve platin bileşikleri 57,58,59 . BAT'ın sırasıyla %51.7-66.9 ve %89.2-97.8 arasında bir duyarlılık ve özgüllüğe sahip olduğu bildirilmiştir; pozitif ve negatif prediktif değerlerin ise sırasıyla %93,4 ile %66,3 arasında değiştiğive 27,31 olarak tanımlandığı tanımlanmıştır. Ayrıca, platin bileşikleri ile duyarsızlaştırma sırasında çığır açan reaksiyonlar için öngörücü bir biyobelirteç olarak BAT önerilmiştir, çünkü CD203c ekspresyonu, ilaç duyarsızlaştırma sırasında advers reaksiyon riski yüksek olan hastalarda CD63'e kıyasla artmıştır57.
BAT'ın sadece reaksiyon bazofil degranülasyonunu içerdiğinde ilaç aşırı duyarlılığında yararlı olduğu unutulmamalıdır; bu nedenle, siklooksijenaz 142'nin enzimatik inhibisyonundan kaynaklanan reaksiyonlarda yararlı değildir.
Gıda alerjisi BAT, gıda alerjisi için potansiyel bir tanı aracı olarak ortaya çıkmıştır, çünkü tüm alerjen ekstraktına veya tek alerjenlere serum sIgE'nin belirlenmesi genellikle belirsizdir ve tanıyı doğrulamak için oral gıda zorluğu gerektirir, bu da ilaç aşırı duyarlılığına benzer şekilde, pahalı ve risksiz bir prosedürdür60. Birçok çalışma, sütü 61,62, yumurta61,63, buğday 64,65,66,67,68, yer fıstığı63,69,70,71,72, fındık 73,74,75,76 ile ilgili sonuçları göstermiştir. ,77, kabuklu deniz ürünleri78, şeftali 79,80,81, elma21, kereviz ve havuç82,83.
Gıda allerjisi tanısında BAT'ın serumdaki ST ve sIgE'ye göre temel katma değeri, daha yüksek özgüllük ve benzer duyarlılık göstermesidir. Bu nedenle, BAT, klinik olarak alerjik hastaları hem yüksek özgüllüğe (% 75-100) hem de duyarlılığa (% 77-98) 63,69,84 sahip hassas, ancak toleranslı deneklerden ayırt etmek için yararlı bir araçtır. Duyarlılık ve özgüllük değerleri alerjene ve fenotipler (örneğin, oral alerji sendromuna karşı anafilaksi), yaş ve coğrafya ile ilişkili duyarlılaşma paternleri gibi diğer faktörlere bağlıdır63,85.
Tek alerjen bileşenleri kullanan BAT, bazı gıda alerjenleri için tanısal doğruluğu potansiyel olarak artırabilir61,80. Tohum depolama proteinlerini kullanan çalışmalar vardır (örneğin, yer fıstığından Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3 ve Ara h 6)86; lipid transfer proteinleri (örneğin, şeftaliden Pru p 3 ve yer fıstığından Ara h 9)80,86; ve Bet v 1 homologları (örneğin, yer fıstığından Ara h 8)87. Diğer potansiyel faydalar, polen-gıda alerjisi sendromu21,87,88, kırmızı ete alerji 89 veya gıdaya bağımlı egzersize bağlı anafilaksi66 vakalarında suçlu alerjenin tanımlanması ile ilgilidir.
İlginçtir ki, BAT, alerjik reaksiyonların şiddeti ve eşiği hakkında bilgi sağlayabilir, çünkü daha şiddetli reaksiyonları olan hastalar, yer fıstığı ve sütü alerjisi olan hastalar üzerinde yapılan çalışmalarda gözlemlendiği gibi, daha büyük oranda aktif bazofil gösterir 84,90,91; ve eser miktarda alerjene tepki gösteren hastalar daha büyük bir bazofil duyarlılığı gösterir 84,90,92. Bu veriler, BAT'ın daha yakın takip ve daha yoğunlaştırılmış eğitim gerektiren yüksek riskli alerjik hastaları tanımlamak için yararlı olabileceğini düşündürmektedir93. Ayrıca, BAT'ın, gıdanın ne zaman güvenli bir şekilde (yeniden) tanıtılabileceğini belirlemeye yardımcı olmak için gıda zorluğu tepkileri 70,91,92,94 ve reaktivite eşikleri 90,95'i tahmin edebileceği bildirilmiştir 84. Bununla birlikte, bu bulgular bazı çalışmalarda63,96 tartışmalı ve daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.
Öte yandan, BAT, doğal olarak veya immünomodülatör tedaviler altında, gıda alerjisinin zaman içinde çözünürlüğünü izlemek için kullanılmıştır; bu, şimdiye kadar sadece oral gıda mücadelesi ile değerlendirilmiştir, ilişkili riskler ve maliyetler 84,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106 ,107,108. Ayrıca, omalizumab ile tedavi sırasında bazofil aktivasyonu azaldığından omalizumab'ın gıda alerjisindeki etkisini izlemek için de kullanılmıştır, ancak tedavinin kesilmesinden sonra artar109.
İnhalan alerji BAT, inhalan alerjide nadiren faydalıdır, çünkü tanı rutin olarak sIgE nicelleştirmesi ve ST ile belirlenebilir. Bununla birlikte, lokal alerjik rinit vakalarında (pozitif burun provokasyon testleri ile saptanamayan sIgE seviyeleri ve negatif ST'ler), BAT vakaların% 50'sinde tanıya izin vermiştir110. Ayrıca, bazofil duyarlılığı ile nazal/bronşiyal provokasyon testlerine yanıt ile astım şiddeti ve omalizumab111,112 ile tedavinin etkinliği arasında bir korelasyon olduğu bildirilmiştir.
BAT ayrıca, ev tozu akarı ve polenler için alerjen immünoterapisini izlemek için de kullanılmıştır, çünkü bazofil duyarlılığı immünoterapi sırasında azalır, muhtemelen bloke edici IgG antikorlarının 113,114,115,116,117 paraziti nedeniyle.
Hymenopterazehir alerjisi Hymenoptera venom alerjisinin tanısı rutin olarak ST ve serum sIgE'ye dayanmaktadır. BAT, yüksek duyarlılık (%85-100) ve özgüllük (%83-100) göstermiş olup, belirsiz sonuçlar veren olgularda veya düşündürücü klinik venom alerjisi öyküsü olan ancak saptanamayan sIgE ve negatif ST118,119 olan hastalarda yararlı olduğu bildirilmiştir. Bununla birlikte, BAT'ın bu reaksiyonlar için şiddeti öngörmediği görülmektedir120,121.
Hastaların% 60'ına kadarı hem yaban arısı hem de arı zehirine sIgE sergiler ve baskın alerjenin tanımlanması yeterli immünoterapi tedavisi için çok önemlidir. Bu vakalarda, BAT'ın baskın alerjen119,122,123,124'ün tanımlanmasında yararlı olduğu bildirilmiştir. Arı ve yaban arısı zehirlerinin majör alerjenlerine karşı sIgE, çift pozitifliği olan hastalarda BAT'ın her iki zehire de faydasını azaltabilse de, sIgE tayinlerinde123 esas olarak olumsuz sonuçları olan kişilerde yararlı bilgiler sağlar.
Bazı çalışmalar, BAT'ın zehir immünoterapisinin birikme aşamasında yan etkiler için prediktif bir biyobelirteç olarak yararlı olabileceğini düşündürmektedir, çünkü bu tedavi seçeneğinin bazofil duyarlılığını azalttığı bildirilmiştir. Bununla birlikte, reaktivite azalmaz ve bu BAT faydası günümüzde tartışmalı 13,120,125,126,127,128,129,130'dur.
Ürtiker ve anjiyoödem Kronik ürtiker hastalarının bir alt kümesi, otoalerjenlere karşı IgE otoantikorları ve mast hücre yüzeyinde bulunan FcεRI veya IgE-FcεRI komplekslerini hedef alan IgG otoantikorları nedeniyle otoinmüsen patofizyolojisine sahiptir131.132. Klinik pratikte, bu tip kronik ürtikerin tanısı, kazara enfeksiyon riski taşıyan pozitif otolog serum ST'ye dayanmaktadır. BAT, kronik ürtiker şüphesi olan hastaların tanı ve izlenmesi için in vitro bir test olarak önerilmiştir. Bazofillerin yüzeyindeki CD63 ve CD203c ekspresyonunun, kronik ürtiker hastalarından serumlarla stimülasyonu takiben arttığı ve aktif otoantikorların 133.134.135.136.137 olduğunu gösterdiği bildirilmiştir. Son zamanlarda, BAT pozitif hastaların sıklıkla ürtiker aktivite skoru ile değerlendirilen en aktif hastalık durumunu yaşadıkları ve BAT138 negatif olanlara kıyasla üçüncü basamak tedavilerle (siklosporin A veya omalizumab) birlikte daha yüksek dozlarda antihistaminikler gerektirdikleri bildirilmiştir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, without Cap, Nonsterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD193 (CCR3) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>310708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCalibur Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD63 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>353006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Solution 10x concentrated</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Formyl-Met-Leu-Phe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD203c (E-NPP3) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>324606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse Anti-Human IgE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-3</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>203-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheath Fluid</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>342003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUBE 9 mL LH Lithium Heparin</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>455084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

basophil activation test for allergy diagnosis

Bazofil aktivasyon testi (BAT), gıdaya, böcek zehirine, ilaçlara ve bazı kronik ürtiker formlarına karşı IgE aracılı alerjik reaksiyonların değerlendirilmesinde klinik öykü, deri testi (ST) ve spesifik IgE (sIgE) tayinine ek olarak kullanılabilen tamamlayıcı bir in vitro tanı testidir. Bununla birlikte, bu tekniğin tanı algoritmalarındaki rolü oldukça değişkendir ve iyi belirlenmemiştir.
BAT, aktivasyon belirteçlerinin (CD63, CD203c gibi) akış sitometrisi ile ölçülmesi yoluyla alerjen/ilaç çapraz bağlanan IgE aktivasyonuna bazofil yanıtının belirlenmesine dayanır. Bu test, özellikle hayatı tehdit eden ciddi reaksiyonlar yaşayan deneklerde, alerji tanısını doğrulamak için kontrollü meydan okuma testlerinden kaçınmak için yararlı ve tamamlayıcı bir araç olabilir. Genel olarak, i) alerjen / ilaç ST'de yanlış pozitif sonuçlar üretiyorsa; ii) ST veya sIgE tayini için kullanılacak herhangi bir alerjen/ilaç kaynağının bulunmaması; iii) hasta öyküsü ile ST veya sIgE tayini arasında uyumsuzluk olması; iv) semptomlar ST'nin sistemik yanıtla sonuçlanabileceğini düşündürmektedir; v) Suçlu alerjeni / ilacı doğrulamak için bir CCT'yi düşünmeden önce. Testin ana sınırlamaları, özellikle ilaç alerjisinde optimal olmayan duyarlılık, numune ekstraksiyonundan sonra testin 24 saatten fazla yapılmaması ve laboratuvarlar arasında prosedürler, konsantrasyonlar ve hücre belirteçleri açısından standardizasyon eksikliği ile ilgilidir.

Alerjenler veya ilaçlarla yapılan BAT, IgE'ye bağımlı aşırı duyarlılık reaksiyonlarının araştırılmasına izin verir. En iyi sonuçları elde etmek için bazofil reaktivitesi en az iki optimal konsantrasyonda ölçülmelidir34 ve aktivasyon, CD63'ün hücre yüzeyinde yukarı regülasyonu ile görselleştirilir. Alerjenler söz konusu olduğunda, ayrıca, bazofil reaktivitesini doğrulamak için, bazofil duyarlılığı, çoklu azalan alerjen konsantrasyonlarında reaktivite ölçül...

Watch this Scientific Journal Video about Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis at JoVE.com

Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis

Bazofil aktivasyon testi, akım sitometrisi ile aktivasyon belirteçlerinin ölçülmesi yoluyla spesifik bir uyaran varlığında bazofil aktivasyonunun saptanmasına dayanan IgE aracılı alerjik reaksiyonların değerlendirilmesi için tamamlayıcı bir in vitro tanı testidir.

Alerji Tanısı için Bazofil Aktivasyon Testi

The basophil activation test (BAT) is a complementary in vitro diagnostic test that can be used in addition to clinical history, skin test (ST), and ...

Bazofil aktivasyon testi, ilaçlar, yiyecekler veya inhalanlar tarafından indüklenen reaksiyonlar için ve bazı kronik ürtiker formlarında yararlı olduğu gösterilen IgE aracılı alerjik reaksiyonların değerlendirilmesi için ücretsiz bir in vitro tanı testidir. Bu test, akım sitometrisi ile aktivasyon belirteçlerinin ölçülmesi yoluyla bir alerjene veya ilaç çapraz bağlanan IgE aktivasyonuna bazofil yanıtının belirlenmesine dayanmaktadır. Bazofil aktivasyon testi, özellikle ciddi yaşamı tehdit eden reaksiyonlar yaşayan deneklerde, alerji tanısını doğrulamak için kontrollü meydan okuma testlerinden kaçınmak için yararlı ve ücretsiz bir araç olabilir.Dahası, bu test, sadece birkaç ilaç ve alerjen için mevcut olan diğer in vitro yöntemlere kıyasla herhangi bir ilaca veya alerjene karşı yanıtı analiz edebilme avantajına sahiptir. Testin ana sınırlamaları, özellikle ilaç alerjisinde, optimal olmayan duyarlılıkla ilgilidir. Testin numune ekstraksiyonundan en fazla 24 saat sonra yapılması gerekliliği ve laboratuvarlar ile teşhis algoritmaları arasında standardizasyon eksikliği.Dokuz mililitrelik heparinize tüplerde periferik kan toplayarak başlayın ve numuneleri deneysel protokol için gerekli olana kadar oda sıcaklığında tutmak için bir rotora yerleştirin. Negatif kontrol ve pozitif kontrol için her biri beş mililitrelik sitometre tüplerini etiketleyin. Ayrıca, test edilen farklı alerjen veya ilaç konsantrasyonları için her birini bir tüp olarak etiketleyin.Daha sonra tüpleri bir rafa yerleştirin, böylece tüpler kaymadan mükemmel şekilde oturur. İlk pozitif kontrol için,% 0.05 PBS-T'de dört mikromolar N-Formilmetiyonil-lösil-fenilalanin veya fMLP çözeltisi hazırlayın Bazofillerin kalitesini doğrulamak için. İkinci pozitif kontrol için, PBS-T kullanarak mililitre başına 0.05 miligram anti-IgE çözeltisi hazırlayın.Stimülasyon tamponunun 20 mikrolitresi başına CCR3-APC, CD203c-PE ve CD63-FITC antikorlarının her birine bir mikrolitre ekleyerek boyama karışımını hazırlayın. Daha sonra her tüpe bu boyama karışımından 23 mikrolitre ekleyin. Negatif kontrol tüplerine 100 mikrolitre PBS-T ekleyin.Pozitif kontrol tüplerinden birine 100 mikrolitre fMLP ekleyin ve tüplerin geri kalanına diğerine 100 mikrolitre anti-IgE E ekleyin. Farklı alerjen veya ilaç konsantrasyonlarından 100 mikrolitre ekleyin ve 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçkadan sonra, hemolizi önlemek için her tüpe nazikçe 100 mikrolitre kan ekleyin.Daha sonra tüpleri yavaşça vorteksleyin ve termostatik banyoda orta ajitasyonla 37 santigrat derecede 25 dakika boyunca inkübe edin. Degranülasyonu durdurmak için tüpleri en az beş dakika boyunca dört santigrat derecede tutun. Her tüpe, eritrositleri lize etmek için iki mililitre lize tamponu ekleyin.Her tüpü vorteks edin ve daha sonra tüpleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. Tüpleri beş dakika boyunca dört santigrat derecede 300 g'da santrifüj yapın. Ardından, hücreler tüplerin dibinde kalırken süpernatantı boşaltmak için rafı lavaboya çevirin.Hücreleri yıkamak ve tüpleri vortekse etmek için her tüpe üç mililitre PBS-T ekleyin. Aynı parametre kümesini kullanarak ikinci bir santrifüjleme turu gerçekleştirin ve rafı lavaboya ters çevirerek süpernatantı boşaltın. Daha sonra numuneleri akış sitometrisine kadar ışıktan korunan dört santigrat derecede tutun.Akış sitometresini bilgisayar yazılımına bağlayın ve sitometre hazır olana kadar bekleyin. Şablon ve enstrüman ayarlarını metin makalesinde açıklandığı şekilde yükleyin. Örnek alma işlemini başlatın.Aktif bazofilleri seçmek için, önce lenfositleri Yan Saçılma-İleri Saçılma grafiğinden kapılayın. Daha sonra lenfosit popülasyonundan bazofilleri CCR3 + CD203c + hücreleri olarak kapılar ve tüp başına en az 500 bazofil elde edin. CD63 eşiğini negatif kontrol tüplerini kullanarak yaklaşık% 2,5'e ayarlayın ve örnekleri analiz edin.IgE'ye bağımlı aşırı duyarlılık reaksiyonları, alerjenler ve ilaçlar kullanılarak bazofil aktivasyon testi veya BAT yapılarak araştırıldı. Bazofil duyarlılığı,% 50 bazofil veya EC50'nin yanıtını indükleyen alerjik konsantrasyonun belirlenmesine yardımcı olan çoklu azalan alerjen konsantrasyonlarındaki reaktivitenin ölçülmesiyle analiz edildi. İlk olarak, lenfositler yan saçılma-ileri saçılma grafiğinden kapılandırıldı.Daha sonra bazofiller lenfosit popülasyonundan CCR3 + CD203c + hücreleri olarak kapatıldı. Daha sonra, CD63'ü iki ilaç ve bir alerjenin farklı konsantrasyonları için bir aktivasyon belirteci olarak kullanarak bazofil aktivasyonunu analiz etmek için bir CCR3-CD63 grafiği kullanıldı. Test taze tam kan ile yapılır ve kan alımından en fazla 24 saat sonra yapılmalıdır.Testte kullanılan uyaran herhangi bir yardımcı madde içermemeli ve ilaçların kimyasal özellikleri göz önünde bulundurulmalıdır. IgE aracılı alerjik reaksiyonların teşhisi için diğer ek in vitro yöntemler veya sIgE tayini veya histamin salınım testi.

basophil-activation-test-for-allergy-diagnosis

Research

JoVE Journal

Medicine

FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis

Pre-implantation genetic diagnosis (PGD) is an established alternative to pre-natal diagnosis, and involves selecting pre-implantation embryos from a cohort generated by assisted reproduction technology (ART). This selection may be required because of familial monogenic disease (e.g. cystic fibrosis), or because one partner carries a chromosome rearrangement (e.g. a two-way reciprocal translocation). PGD is available for couples who have had previous affected children, and/or in the case of chromosome rearrangements, recurrent miscarriages, or infertility. Oocytes aspirated following ovarian stimulation are fertilized by in vitro immersion in semen (IVF) or by intracytoplasmic injection of an individual spermatozoon (ICSI). Pre-implantation cleavage-stage embryos are biopsied, usually by the removal of a single cell on day 3 post-fertilization, and the biopsied cell is tested to establish the genetic status of the embryo. Fluorescence in situ hybridization (FISH) on the fixed nuclei of biopsied cells with target-specific DNA probes is the technique of choice to detect chromosome imbalance associated with chromosome rearrangements, and to select female embryos in families with X-linked disease for which there is no mutation-specific test. FISH has also been used to screen embryos for spontaneous chromosome aneuploidy (also known as PGS or PGD-AS) in order to try and improve the efficiency of assisted reproduction; however, the predictive value of this test using the spreading and FISH technique described here is likely to be unacceptably low in most people's hands and it is not recommended for routine clinical use. We describe the selection of suitable probes for single-cell FISH, spreading techniques for blastomere nuclei, and in situ hybridization and signal scoring, applied to PGD in a clinical setting.

This article describes the selection of suitable probes for single-cell FISH, spreading techniques for blastomere nuclei, and in situ hybridization and signal scoring, applied to pre-implantation genetic diagnosis (PGD) in a clinical setting.

Pre-implantasyon Genetik Tanı için FISH

Pre-implantation genetic diagnosis (PGD) is an established alternative to pre-natal diagnosis, and involves selecting pre-implantation embryos from a ...

Tıp

The Trier Social Stress Test Protocol for Inducing Psychological Stress

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting. Protocols that allow researchers to study the biological pathways of the stress response in health and disease are fundamental to the progress of research in stress and anxiety.1 Although numerous protocols exist for inducing stress response in the laboratory, many neglect to provide a naturalistic context or to incorporate aspects of social and psychological stress. Of psychological stress protocols, meta-analysis suggests that the Trier Social Stress Test (TSST) is the most useful and appropriate standardized protocol for studies of stress hormone reactivity.2 In the original description of the TSST, researchers sought to design and evaluate a procedure capable of inducing a reliable stress response in the majority of healthy volunteers.3 These researchers found elevations in heart rate, blood pressure and several endocrine stress markers in response to the TSST (a psychological stressor) compared to a saline injection (a physical stressor).3 Although the TSST has been modified to meet the needs of various research groups, it generally consists of a waiting period upon arrival, anticipatory speech preparation, speech performance, and verbal arithmetic performance periods, followed by one or more recovery periods. The TSST requires participants to prepare and deliver a speech, and verbally respond to a challenging arithmetic problem in the presence of a socially evaluative audience.3 Social evaluation and uncontrollability have been identified as key components of stress induction by the TSST.4 In use for over a decade, the goal of the TSST is to systematically induce a stress response in order to measure differences in reactivity, anxiety and activation of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) or sympathetic-adrenal-medullary (SAM) axis during the task.1 Researchers generally assess changes in self-reported anxiety, physiological measures (e.g. heart rate), and/or neuroendocrine indices (e.g. the stress hormone cortisol) in response to the TSST. Many investigators have adopted salivary sampling for stress markers such as cortisol and alpha-amylase (a marker of autonomic nervous system activation) as an alternative to blood sampling to reduce the confounding stress of blood-collection techniques. In addition to changes experienced by an individual completing the TSST, researchers can compare changes between different treatment groups (e.g. clinical versus healthy control samples) or the effectiveness of stress-reducing interventions.1

This article describes a protocol for inducing psychological stress in participants, which enables researchers to measure psychological, physiological and neuroendocrine responses to stress within single participants or between groups.

Psikolojik Stres Başlatmaya Trier Sosyal Stres Testi Protokolü

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting.  Protocols that allow researchers to study the biological ...

Transabdominal Ultrasound for Pregnancy Diagnosis in Reeves' Muntjac Deer

Reeves' muntjac deer (Muntiacus reevesi) are a small cervid species native to southeast Asia, and are currently being investigated as a potential model of prion disease transmission and pathogenesis. Vertical transmission is an area of interest among researchers studying infectious diseases, including prion disease, and these investigations require efficient methods for evaluating the effects of maternal infection on reproductive performance. Ultrasonographic examination is a well-established tool for diagnosing pregnancy and assessing fetal health in many animal species1-7, including several species of farmed cervids8-19, however this technique has not been described in Reeves' muntjac deer. Here we describe the application of transabdominal ultrasound to detect pregnancy in muntjac does and to evaluate fetal growth and development throughout the gestational period. Using this procedure, pregnant animals were identified as early as 35 days following doe-buck pairing and this was an effective means to safely monitor the pregnancy at regular intervals. Future goals of this work will include establishing normal fetal measurement references for estimation of gestational age, determining sensitivity and specificity of the technique for diagnosing pregnancy at various stages of gestation, and identifying variations in fetal growth and development under different experimental conditions.

Transabdominal Ultrasound for Pregnancy Diagnosis in Reeves&#039; Muntjac Deer

Transabdominal ultrasound is described as an effective, noninvasive means for assessing reproductive status in Reeves' muntjac deer. These methods can be used to achieve early pregnancy diagnosis and to evaluate fetal viability. Future applications of this technique include estimation of gestational age and effects of maternal disease on fetal development.

Reeves'in Muntjac Geyisinde Gebelik Tanısı için Transabdominal Ultrason

Reeves' muntjac deer (Muntiacus reevesi) are a small cervid species native to southeast Asia, and are currently being investigated as a potential model of ...

Diagnosis of Musculus Gastrocnemius Tightness - Key Factors for the Clinical Examination

Common foot and ankle pathologies have been linked to isolated Musculus gastrocnemius tightness (MGT). Various examination techniques have been described to assess MGT. Still, a standardized examination procedure is missing. Literature argues for weightbearing examination but the degree of knee flexion needed to eliminate the restraining effect of the M. gastrocnemius on ankle dorsiflexion (ADF) is unknown. This manuscript investigates the effect of knee flexion on ankle dorsiflexion and provides a detailed description of a standardized examination protocol. Examination on 20 healthy individuals revealed, that 20&#176; of knee flexion is sufficient to fully eliminate the influence of the M. gastrocnemius on ADF. This builds the prerequisite for a standardized examination for MGT. Non-weightbearing and weightbearing examination of ADF has to be conducted with the knee fully extended and at least 20&#176; flexed. Two investigators should conduct non-weightbearing testing with the subject in supine position. In order to obtain reliable results, the axis of the fibula should be marked. One examiner can conduct weightbearing examination with the subject in lunge stance. Isolated MGT is present if ADF is impaired with the knee fully extended and knee flexion results in a significant ADF increase. The herein presented standardized examination is the prerequisite for future studies aiming at establishing norm values.

Diagnosis of Musculus Gastrocnemius Tightness - Key Factors for the Clinical Examination

Isolated Musculus gastrocnemius tightness is a common cause for foot and ankle pathologies. Currently no standardized examination procedure exists. This manuscript demonstrates that 20 degree of knee flexion eliminates the restraining effect of the M. gastrocnemius on ankle dorsiflexion and presents a video description of a standardized examination protocol.

teşhisi<em&gt; Musculus Gastrocnemius</em&gt; Sızdırmazlık - Klinik Sınav Anahtar Faktörler

Common foot and ankle pathologies have been linked to isolated Musculus gastrocnemius tightness (MGT). Various examination techniques have been described ...

Hydra, a Computer-Based Platform for Aiding Clinicians in Cardiovascular Analysis and Diagnosis

Cardiovascular diseases (CVDs) are the leading cause of death throughout the world. The total risk of developing CVD is determined by the combined effect of different cardiovascular risk factors (e.g., diabetes, raised blood pressure, unhealthy diet, tobacco use, stress, etc.) that commonly coexist and act multiplicatively. Most CVDs can be prevented by an early identification of the highest risk factors and an appropriate treatment. The stratification of cardiovascular risk factors involves a wide range of parameters and tests that specialists use in their clinical practice. In addition to cardiovascular (CV) risk stratification, ambulatory blood pressure monitoring (ABPM) also provides relevant information for diagnostic and treatment purposes. This work presents a list of protocols based on the Hydra platform, a web-based system for clinical decision support which incorporates a set of functionalities and services that are required for complete cardiovascular analysis, risk assessment, early diagnosis, treatment and monitoring of patients over time. The program includes tools for inputting and managing comprehensive patient data, organized into different checkups to track the evolution over time. It also has a risk stratification tool to compute a CV risk factor based upon several risk stratification tables of reference. Additionally, the program includes a tool that incorporates ABPM analysis and allows the extraction of valuable information by monitoring blood pressure over a specific period of time. Finally, the reporting service summarizes the most relevant information in a set of reports that aid clinicians in their clinical decision-making process.

This article presents a protocol based on Hydra &#8212; a web-based system for clinical decision support that integrates a full and detailed set of functionalities and services required by physicians for complete cardiovascular analysis, risk assessment, early diagnosis, treatment, and monitoring over time.

Hydra, kardiyovasküler analiz ve tanı klinisyenler yardım için bir bilgisayar tabanlı Platform

Cardiovascular diseases (CVDs) are the leading cause of death throughout the world. The total risk of developing CVD is determined by the combined effect ...

International Expert Consensus and Recommendations for Neonatal Pneumothorax Ultrasound Diagnosis and Ultrasound-guided Thoracentesis Procedure

Pneumothorax (PTX) represents accumulation of the air in the pleural space. A large or tension pneumothorax can collapse the lung and cause hemodynamic compromise, a life-threatening disorder. Traditionally, neonatal pneumothorax diagnosis has been based on clinical images, auscultation, transillumination, and chest X-ray findings. This approach may potentially lead to a delay in both diagnosis and treatment. The use of lung US in diagnosis of PTX together with US-guided thoracentesis results in earlier and more precise management. The recommendations presented in this publication are aimed at improving the application of lung US in guiding neonatal PTX diagnosis and management.

Pneumothorax is a common emergency and critical disease in newborn infants that needs rapid, clear diagnosis and timely treatment. Diagnosis and treatment based on chest X-rays are associated with delayed management and radiation damage. Lung ultrasound (US) provides useful guidance for rapid, accurate diagnosis and the precise thoracentesis of pneumothorax.

Uluslararası Uzman Konsensus ve Neonatal Pnömotoraks Ultrason Tanısı ve Ultrason Eşliğinde Torasentez Önerileri

Pneumothorax (PTX) represents accumulation of the air in the pleural space. A large or tension pneumothorax can collapse the lung and cause hemodynamic ...

Diagnosis and Surgical Treatment of Human Brucellar Spondylodiscitis

Brucellar spondylodiscitis (BS) is the most prevalent and significant osteoarticular presentation of human Brucellosis, which is commonly manifested in pastoral communities. It is difficult to differentially diagnose and usually leads to irreversible neurologic deficits and spinal deformities. The initial diagnosis of BS is based on clinical findings and radiographic assessments, and the confirmed diagnosis should be established by the isolation of Brucella species from the blood and/or the standard tube agglutination test. Differential diagnosis of multifocal BS from either degenerative disc diseases or tuberculosis is especially highlighted. The surgical approach, either endoscopic or open, is demonstrated in detail, accompanied by radiographic evidence of structural compression or severe instability. Further, the crucial surgical steps, including single-stage transforaminal decompression, debridement, interbody fusion, and internal fixation, are explained. Moreover, perioperative care and postoperative rehabilitation are also addressed. Taken together, this clinical algorithm presents a practical guide that has yielded substantially satisfactory outcomes in the past decades, which can also be introduced for large-scale application to manage human BS, especially in endemic regions.

We describe a clinical algorithm, based on decades of front-line experience of diagnosis and surgical treatment of human Brucellar spondylodiscitis in the largest medical center of the China's Xinjiang Pastoral Area.

İnsan Brucellar Spondilodistis Tanı ve Cerrahi Tedavisi

Brucellar spondylodiscitis (BS) is the most prevalent and significant osteoarticular presentation of human Brucellosis, which is commonly manifested in ...

Testing Acetylcholine Followed by Adenosine for Invasive Diagnosis of Coronary Vasomotor Disorders

More than 50% of patients with signs and symptoms of myocardial ischemia undergoing coronary angiography have unobstructed coronary arteries. Coronary vasomotor disorders (impaired vasodilatation and/or enhanced vasoconstriction/spasm) represent important functional causes for such a clinical presentation. Although impaired vasodilatation may be assessed with non-invasive techniques such as positron emission tomography or cardiac magnetic resonance imaging, there is currently no reliable non-invasive technique for the diagnosis of coronary spasm available. Thus, invasive diagnostic procedures (IDP) have been developed for the diagnosis of coronary vasomotor disorders including spasm testing as well as assessment of coronary vasodilatation. The identification of the underlying type of disorder (so called endotype) allows the initiation of targeted pharmacological treatments. Despite the fact that such an approach is recommended by the current European Society of Cardiology guidelines for the management of chronic coronary syndromes based on the CorMicA study, comparability of results as well as multicenter trials are currently hampered by major differences in institutional protocols for coronary functional testing. This article describes a comprehensive IDP protocol including intracoronary acetylcholine provocation testing for diagnosis of epicardial/microvascular spasm, followed by Doppler wire-based assessment of coronary flow reserve (CFR) and hyperemic microvascular resistance (HMR) in search of coronary vasodilatory impairment.

Coronary vasomotion disorders represent frequent functional causes of angina in patients with unobstructed coronaries. The underlying mechanism of angina (endotype) in these patients can be determined by a comprehensive invasive diagnostic procedure based on acetylcholine provocation testing followed by Doppler-derived assessment of the coronary flow reserve and microvascular resistance.

Koroner Vazomotor Bozuklukların İnvaziv Tanısı için Asetilkolin ve Adenozin Testi

More than 50% of patients with signs and symptoms of myocardial ischemia undergoing coronary angiography have unobstructed coronary arteries. Coronary ...

Measurement of Myocardial Lactate Production for Diagnosis of Coronary Microvascular Spasm

In about a quarter of patients with angina and non-obstructive coronary arteries, no epicardial spasm is noted on coronary arteriography during an angina attack. Since the pressure-rate product is almost identical at rest and the onset of attack in those patients, the decrease in coronary blood flow rather than increased myocardial oxygen consumption is likely to explain myocardial ischemia, indicating a substantial involvement with coronary microvascular spasm (MVS). Myocardial lactate production, which could be defined as a negative myocardial lactate extraction ratio (ratio of the coronary arterial-venous difference in lactate concentration to arterial concentration), is considered indicative of objective evidence to support the emerging myocardial ischemia. Thus, monitoring of the myocardial lactate production and the emergence of chest pain and ischemic electrocardiographic changes during acetylcholine (ACh) provocation testing is of significant value for detecting the entity of MVS. Practically, 1 min after incremental doses of ACh (20, 50, and 100 &#956;g) are administered into the left coronary artery (LCA), paired samples of 1 mL of blood are collected from the LCA ostium and coronary sinus for measurement of lactate concentration by a calibrated automatic lactate analyzer. Then, the development of MVS could be confirmed by negative myocardial lactate extraction ratio despite the absence of angiographically demonstrable epicardial coronary spasm or before its occurrence throughout ACh provocation testing. In conclusion, assessment of myocardial lactate production is essential and valuable for the diagnosis of MVS.

Myocardial lactate production (coronary arterial-venous difference in serum lactate level) during coronary spasm provocation testing is considered as a highly sensitive marker that reflects acetylcholine-induced myocardial ischemia due to microvascular spasm. This article presents the procedures to assess myocardial lactate production for the diagnosis of coronary microvascular spasm.

Koroner mikrovasküler spazm tanısı için miyokardiyal laktat üretiminin ölçülmesi

In about a quarter of patients with angina and non-obstructive coronary arteries, no epicardial spasm is noted on coronary arteriography during an angina ...

High-speed Video Microscopy Analysis for First-line Diagnosis of Primary Ciliary Dyskinesia

Primary ciliary dyskinesia (PCD) is a congenital disorder predominantly inherited in an autosomal recessive trait. The disorder causes disturbance in the motion of cilia, leading to severe impairment of mucociliary clearance (MCC). If undiagnosed or diagnosed too late, the condition leads to the development of bronchiectasis and serious damage to the lungs in later life. Most of the methods for diagnosing PCD are time-consuming and demand extensive economic resources to establish them. High-speed video microscopy analysis (HSVMA) is the only diagnostic tool to visualize and analyze living respiratory cells with beating cilia in vitro. It is fast, cost-effective, and, in experienced hands, very reliable as a diagnostic tool for PCD. In addition, classical diagnostic measures such as transmission electron microscopy (TEM) are not applicable for some mutations as morphological changes are absent. 
This paper describes the process of collecting respiratory epithelial cells, the further preparation of the specimen, and the process of HSVMA. We also describe how brushed cells can be successfully kept unharmed and beating by keeping them in a nourishing medium for storage and transport to the investigation site in cases where a clinic does not possess the equipment to perform HSVMA. Also shown are videos with pathologic beating patterns from patients with a mutation in the dynein arm heavy chain 11 gene (DNAH11), which cannot be diagnosed with TEM; the result of an inconclusive HSVMA due to infection of the upper airways, as well as an unsuccessful brushing with superimposition of red blood cells. With this article, we would like to encourage every unit dealing with pulmonology patients and rare lung diseases to perform HSVMA as part of their daily routine diagnostics for PCD or send the specimens over to a center specializing in performing HSVMA.

High-speed video microscopy analysis is a relatively easy-to-perform, fast, cost-effective, and, in experienced hands, a considerably reliable tool for first-line diagnostics of primary ciliary dyskinesia, which should be available in every center involved in diagnostics and the treatment of severe lung diseases.

Primer Siliyer Diskinezinin Birinci Basamak Tanısı için Yüksek Hızlı Video Mikroskopi Analizi

Primary ciliary dyskinesia (PCD) is a congenital disorder predominantly inherited in an autosomal recessive trait. The disorder causes disturbance in the ...