イソレブグランジンは、いくつかの疾患、特に心血管疾患に関与しています。このプロトコルは、D11アルカリホスファターゼ融合タンパク質および免疫蛍光を有する組織中のイソレブグランジンを検出するために開発されました。現在の検出方法は高価であるか、Eタグ用の二次抗体が必要です。
信頼性の高い二次抗体を見つけることは困難ですが、このプロトコルは二次抗体ステップを排除します。マウスおよびヒトパラフィン包埋組織のスライドをキシレンに3回5分間浸して、組織を脱パラフィン化します。組織を再水和するには、組織を95%エタノールで2回洗浄し、続いて70%エタノールで2回洗浄し、次に水中で調製した50%エタノールで2回洗浄します。
スライドホルダーにTBSTを満たして、0.1%Tween 20を含むトリス緩衝生理食塩水でスライドを3回洗浄します。次に、TBSTを破棄します。スライドを予熱したクエン酸ナトリウムバッファーに入れ、高圧で4分間に設定した圧力鍋でインキュベートし、合計抗原回収時間は20分です。
インキュベーションの終わりに、圧力鍋からスライドを取り出し、室温で20分間冷却します。示されているように、TBSTでスライドを3回すばやく洗浄します。TBSTに溶解した2%BSAを加えてスライドをブロックします。
スライドをパラフィンテープで覆い、室温で15分間インキュベートする。インキュベーション後、ブロッキングバッファーを廃棄します。TBSTで調製した200マイクロリットルのD11アルカリホスファターゼをスライドに加え、スライドをパラフィンテープで覆います。
スライドを加湿チャンバー内で室温で3時間インキュベートした後、スライドをTBSTで3回洗浄します。免疫組織化学用の熱量測定アルカリホスファターゼ現像液、または免疫蛍光用の蛍光アルカリホスファターゼ現像液を使用してスライドを開発します。スライドをTBSTで一度洗浄して余分な現像液を取り除き、それ以上の発色を防ぎます。
免疫蛍光のためにPBSで調製した1ミリリットルあたり1マイクログラムのHEX核染色剤でスライドを対比染色します。次に、スライドをTBSTで一度洗浄して、余分な対比汚れを取り除きます。封入剤を使用して、現像したスライドにカバースリップを置きます。
免疫組織化学用の倒立光学顕微鏡、または免疫蛍光用の共焦点蛍光顕微鏡でスライドを観察します。イソレブグランジンに対するD11 AP染色の特異性を確認するために、4つの陰性対照実験を行うことができる。最初の陰性対照実験では、TBSTで希釈したD11 APまたはTBSTのみで組織をインキュベートします。
次に、希釈したD11 APと、D11 APリンカーなしでTBSTで希釈した細菌パリプラス体抽出物で組織をインキュベートします。競合アッセイのために、マウス血清アルブミンに付加されたisoLGおよびisoLGを8対1のモル比で調製します。D11 APをTBSTで1から10に希釈します。
次に、希釈したD11 APを50マイクログラム/ミリリットルのイソレブグランジン付加MSA、または非付加MSAとともに室温で1時間インキュベートします。イソレブグランジンMSAを含むD11 APまたは非付加MSAを含むD11 APを染色のために組織に追加します。関連する一本鎖フラグメント可変抗体D20を使用して、最終的な陰性対照セットの組織を染色します。
高血圧および正常血圧マウスにおける大動脈の免疫蛍光を、このプロトコルを用いて研究した。D11 APによる染色は、対照マウスと比較して、アンジオテンシンII誘発性高血圧症のマウスの大動脈におけるisoLGの濃度の増加を示した。D11 APは、高血圧および正常血圧のヒト患者の腸組織に存在するイソレブグランジンを検出するために使用されました。
高血圧患者の組織はイソレブグランジンの濃度が上昇していた。組織は、パリプラスコード抽出物およびD11 APなしで染色した。D11 APで染色した組織では、パリプラスミック抽出物染色組織と比較して明るい染色が観察され、染色がパリプラス体抽出物に存在する非結合細菌アルカリホスファターゼによるものではないことが確認されました。競合アッセイでは、isoLG競合製品とプレインキュベートしたD11 APで染色された組織は、イソレブグランジンに対するD11 APに対する特異性を示すD11 APで観察された染色と同様に、染色の減少を示しました。
陰性対照では、マウス大動脈をD11 APで染色すると、D20と比較して強い染色が得られ、高血圧大動脈のイソレブグランジンに対するD11 APの特異性を示しました。バックグラウンド染色を制限するには、組織に存在する内因性アルカリホスファターゼを不活性化することが重要です。
