이돌부글란딘은 여러 질병, 특히 심혈관 질환과 관련이 있습니다. 이 프로토콜은 D11 알칼리성 포스파타제 융합 단백질 및 면역형광이 있는 조직에서 이돌부글란딘을 검출하기 위해 개발되었습니다. 현재의 검출 방법은 비용이 많이 들거나 E-tag에 대한 2차 항체가 필요합니다.
신뢰할 수 있는 2차 항체를 찾는 것은 어렵지만 이 프로토콜은 2차 항체 단계를 제거합니다. 마우스 및 인간 파라핀이 포매된 조직의 슬라이드를 자일렌에 5분 동안 3회 담가 조직을 탈파라핀화합니다. 조직을 재수화하기 위해 조직을 95 % 에탄올로 두 번 씻은 다음 70 % 에탄올로 두 번 씻은 다음 물에 준비된 50 % 에탄올로 두 번 씻습니다.
슬라이드 홀더에 TBST를 채워 0.1% Tween 20으로 트리스 완충 식염수로 슬라이드를 세 번 세척합니다. 그런 다음 TBST를 폐기하십시오. 예열된 구연산나트륨 완충액에 슬라이드를 넣고 고압에서 4분으로 설정된 압력솥에서 총 항원 회수 시간 20분 동안 배양합니다.
배양이 끝나면 압력솥에서 슬라이드를 꺼내 실온에서 20분 동안 식힙니다. 그림과 같이 TBST로 슬라이드를 세 번 빠르게 세척하십시오. TBST에 용해된 2%BSA를 첨가하여 슬라이드를 차단합니다.
슬라이드를 파라핀 테이프로 덮고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 배양 후 블로킹 버퍼를 버립니다. TBST에서 제조된 D11 알칼리성 포스파타제 200마이크로리터를 슬라이드에 추가하고 슬라이드를 파라핀 테이프로 덮습니다.
슬라이드를 실온에서 3시간 동안 가습 챔버에서 배양한 후, 슬라이드를 TBST로 3회 세척하였다. 면역조직화학을 위한 열량 측정 알칼리성 포스파타제 현상액 또는 면역형광을 위한 형광 알칼리성 포스파타제 현상액으로 슬라이드를 개발합니다. TBST로 슬라이드를 한 번 세척하여 과도한 현상액을 제거하고 추가 발색을 방지합니다.
면역형광을 위해 PBS에서 제조된 밀리리터당 1마이크로그램의 HEX 핵 염색으로 슬라이드를 대조염색합니다. 그런 다음 TBST로 슬라이드를 한 번 세척하여 과도한 카운터스테인을 제거합니다. 장착 매체를 사용하여 현상된 슬라이드에 커버 슬립을 놓습니다.
면역조직화학을 위한 도립광 현미경 또는 면역형광을 위한 컨포칼 형광 현미경으로 슬라이드를 관찰합니다. 이소레부글란딘에 대한 D11 AP 염색의 특이성을 확인하기 위해 4개의 음성 대조군 실험을 수행할 수 있습니다. 첫 번째 음성 대조군 실험에서 TBST 또는 TBST 단독으로 희석된 D11 AP로 조직을 배양합니다.
그런 다음 D11 AP 링커 없이 TBST에 희석된 D11 AP와 박테리아 파리플라스마 추출물로 조직을 배양합니다. 경쟁적 분석을 위해 마우스 혈청 알부민에 첨가된 isoLG와 isoLG를 8:1의 몰비로 준비합니다. D11 AP를 TBST에 1에서 10까지 희석합니다.
그런 다음 희석된 D11 AP를 밀리리터당 50마이크로그램의 이소레부글란딘 내전물 MSA 또는 비내전성 MSA와 함께 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 염색을 위해 이솔부글란딘 MSA가 있는 D11 AP 또는 내전되지 않은 MSA가 있는 D11 AP를 조직에 추가합니다. 관련 단일 사슬 단편 가변 항체 D20을 사용하여 최종 음성 대조군 세트에 대한 조직을 염색합니다.
고혈압 및 정상 혈압 마우스에서 대동맥의 면역형광은 이 프로토콜을 사용하여 연구되었습니다. D11 AP로 염색한 결과, 대조군 마우스에 비해 안지오텐신 II 유발 고혈압이 있는 마우스의 대동맥에서 isoLG의 농도가 증가한 것으로 나타났습니다. D11 AP는 고혈압 및 정상 혈압 인간 환자의 장 조직에 존재하는 이돌부글란딘을 검출하는 데 사용되었습니다.
고혈압 환자의 조직에서는 이소레부글란딘 농도가 높아졌습니다. 조직은 파리플라스마 추출물로 염색하고 D11 AP는 사용하지 않았습니다. 파리플라스마 추출물로 염색된 조직에 비해 D11 AP로 염색한 조직에서 더 밝은 염색이 관찰되었으며, 이는 파리플라스마 추출물에 존재하는 비접합 박테리아 알칼리성 포스파타제에 의한 염색이 아님을 확인하였다. 경쟁적 분석에서, isoLG 경쟁사와 함께 사전 배양된 D11 AP로 염색된 조직은 D11 AP를 사용한 조직에서 관찰된 염색과 유사하게 감소된 염색을 보였으며, 이는 이소레부글란딘에 대한 D11 AP에 대한 특이성을 보여줍니다.
음성 대조군에서 마우스 대동맥을 D11 AP로 염색하면 D20에 비해 강한 염색이 나타났으며, 이는 고혈압성 대동맥에서 이소레부글란딘에 대한 D11 AP의 특이성을 나타냅니다. 배경 염색을 제한하기 위해 조직에 존재하는 내인성 알칼리성 포스파타제를 비활성화하는 것이 중요합니다.
