Ce protocole fournit un débit élevé et une composition fiable pour l’analyse NHEJ qui peut déterminer la prévalence et la quantité relative de mutations Indel dans les populations de moustiques génétiquement modifiés. Par rapport à la prochaine génération, ou séquençage de Sanger, la ddPCR a un délai d’exécution plus rapide pour les résultats, ce qui permet une analyse rapide et complète de la variation génétique sur le terrain pour les organismes génétiquement modifiés. Cette méthode devrait être généralement applicable à tous les systèmes expérimentaux.
Thai Pham, un associé de recherche du laboratoire de Yang, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer, préparez 25 microlitres de la PCR numérique par gouttelettes, ou mélange d’échantillons ddPCR en ajoutant un super mélange ddPCR, des amorces avant et arrière, des sondes HEX ou FAM, de l’ADN et de l’eau dans les proportions décrites dans le texte. Ensuite, mélangez soigneusement la réaction par vortex.
À l’aide d’une pipette multicanal de 50 microlitres, chargez 20 microlitres du mélange d’échantillon ddPCR dans la rangée centrale de la cartouche. Utilisez ensuite une pipette multicanal de 200 microlitres pour charger 70 microlitres d’huile dans la rangée inférieure sans générer de bulles tout au long de la pipette. Placez le joint en ne touchant que les bords, en évitant le centre, la zone concavée, puis placez la plaque solidement dans le générateur de gouttelettes et fermez le couvercle pour commencer la course.
Pour transférer le mélange d’immersion de la rangée supérieure de la cartouche dans la plaque de 96 puits, utilisez une pipette multicanal et déposez 40 microlitres d’échantillon liquide pendant trois à cinq secondes à un angle de 30 à 45 degrés. Ensuite, expulsez le mélange dans le puits lentement pendant plus de trois secondes à un angle de 45 degrés, ce qui lui permet de tomber sur le côté, puis allez au deuxième arrêt de la pipette pour expulser complètement le liquide. À l’aide de joints thermiques en aluminium, scellez les plaques pendant cinq secondes à 180 degrés Celsius.
Placez la plaque scellée dans le thermocycleur et définissez les conditions pcR pour les directives de dépôt NHEJ en réglant la dénaturation initiale à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, réglez 40 cycles de 94 degrés Celsius pendant 30 secondes pour dénaturer, 55 degrés Celsius d’une minute à recuit et 60 degrés Celsius pendant deux minutes pour prolonger. Après 40 cycles, maintenez le maintien à 98 degrés Celsius pendant 10 minutes et le maintien final à quatre degrés Celsius.
Utilisez un taux de rampe de deux degrés Celsius par seconde pour toutes les étapes. La température de recuit variera en fonction des sondes ou de l’apprêt utilisé. Placez la plaque solidement dans le lecteur de gouttelettes avec le A1 bien étiqueté en haut à gauche.
Ouvrez le programme et configurez la plaque en désignant FAM comme canal de référence connu et HEX comme canal inconnu pour chaque puits. Ensuite, modifiez le nom de chaque échantillon. Exécutez l’expérience de lecture de gouttelettes en tant que quantification directe lors de l’enregistrement du modèle.
Désignez les paramètres expérimentaux corrects pour l’analyse logicielle, à savoir les informations d’échantillon, le super mélange, le nom de la cible, le type de cible, le canal de signal un et le canal deux. Ensuite, définissez le seuil de nombre de gouttelettes au-dessus de 10 000 pour des résultats fiables. Ensuite, vérifiez le nombre de gouttelettes pour chaque puits dans l’onglet des gouttelettes, en vous assurant que tous sont supérieurs à 10 000.
Enfin, vérifiez l’amplitude 1D pour une séparation efficace du signal des négatifs. Dans l’éditeur de plaques, mettez en surbrillance la plaque entière et définissez le type d’expérience pour qu’il tombe. Définissez la cible WT comme référence, en désignant le canal un pour FAM et le canal deux pour HEX.
Définissez la cible NHEJ comme inconnue, en désignant le canal un pour FAM et le canal deux comme aucun. Dans l’onglet Amplitude 2D, définissez les seuils de cluster avec les outils graphiques pour chaque échantillon. La queue est normalement associée au groupe WT pour les tests NHEJ.
Sous l’onglet ratio, cliquez sur l’icône d’engrenage en haut à droite du graphique et sélectionnez l’abondance fractionnaire pour tracer un point correspondant au pourcentage d’événements NHEJ. 15 échantillons prélevés différents de 10 moustiques contenaient chacun divers allèles NHEJ, ont été analysés et identifiés à l’aide du test de chute, et les résultats ont montré que les 15 échantillons portaient tous des allèles Indel à 100%. Dans une autre expérience, 11 échantillons prélevés de moustiques de type sauvage et de moustiques NHEJ avec différents pourcentages nhEJ ont été examinés avec ce protocole ddPCR.
Les résultats ont montré que le pourcentage identifié était relativement proche de la détection d’Indel par la technique d’analyse amplicon. Pipettez lentement pour éviter les bulles et laissez toutes les gouttelettes émulsifiées s’égoutter le long de la paroi des puits.
