यह प्रोटोकॉल एनएचईजे विश्लेषण के लिए एक उच्च थ्रूपुट और विश्वसनीय श्रृंगार प्रदान करता है जो जीन-संपादित मच्छर आबादी में इनडेल म्यूटेशन की व्यापकता और सापेक्ष मात्रा निर्धारित कर सकता है। अगली पीढ़ी, या Sanger अनुक्रमण की तुलना में, ddPCR परिणामों के लिए तेजी से बदलाव का समय है, जो आनुवंशिक रूप से संशोधित जीवों के लिए क्षेत्र के लिए आनुवंशिक भिन्नता के त्वरित और पूर्ण विश्लेषण की अनुमति देता है । यह विधि आम तौर पर सभी प्रयोगात्मक प्रणालियों पर लागू होनी चाहिए।
प्रक्रिया का प्रदर्शन थाई फाम, यांग प्रयोगशाला से एक स्टाफ अनुसंधान सहयोगी होगा । शुरू करने के लिए, पाठ में वर्णित अनुपात में डीडीपीसीआर सुपर मिक्स, फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर, एचईएक्स या एफएएम जांच, डीएनए और पानी जोड़कर डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर के 25 माइक्रोलीटर, या डीडीपीसीआर नमूना मिश्रण तैयार करें। इसके बाद भंवर से प्रतिक्रिया को अच्छी तरह मिला लें।
50 माइक्रोलीटर मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके, डीडीपीसीआर नमूना मिश्रण के 20 माइक्रोलीटर को कारतूस की मध्य पंक्ति में लोड करें। फिर पाइपटेिंग में बुलबुले पैदा किए बिना नीचे की पंक्ति में तेल के 70 माइक्रोलीटर लोड करने के लिए 200 माइक्रोलीटर मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें। गैसकेट रखें, केवल किनारों को छूते हुए, केंद्र से परहेज करें, क्षेत्र को कॉनक्लेव करें, और फिर प्लेट को बूंद जनरेटर में सुरक्षित रूप से रखें, और रन शुरू करने के लिए कवर को बंद करें।
कारतूस की शीर्ष पंक्ति से विसर्जन मिश्रण को 96-अच्छी प्लेट में स्थानांतरित करने के लिए, मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें, और 30 से 45 डिग्री के कोण पर तीन से पांच सेकंड के लिए तरल नमूने के 40 माइक्रोलीटर को छोड़ दें। फिर मिश्रण को 45 डिग्री कोण पर तीन सेकंड से अधिक समय तक अच्छी तरह से निष्कासित करें, जिससे यह पक्ष से नीचे गिर जाता है, और फिर तरल को पूरी तरह से निष्कासित करने के लिए पिपेट के दूसरे स्टॉप पर जाता है। पन्नी गर्मी जवानों का उपयोग करना, १८० डिग्री सेल्सियस पर पांच सेकंड के लिए प्लेटों सील ।
सील की गई प्लेट को थर्मोसाइकिलर में रखें, और एनएचईजे ड्रॉप ऑफ दिशा-निर्देशों के लिए पीसीआर शर्तों को 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर प्रारंभिक डेन्चरेशन सेट करके सेट करें। इसके बाद 30 सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के 40 चक्र निर्धारित करें, एक मिनट से एनील तक 55 डिग्री सेल्सियस और दो मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस का विस्तार करें। 40 चक्रों के बाद, 10 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर सेट, और अंतिम चार डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
सभी चरणों के लिए प्रति सेकंड दो डिग्री सेल्सियस की रैंप दर का उपयोग करें। इस्तेमाल की जाने वाली जांच या प्राइमर के अनुसार एनीलिंग तापमान अलग-अलग होगा। शीर्ष बाईं ओर अच्छी तरह से लेबल A1 के साथ बूंद पाठक में सुरक्षित रूप से थाली रखें ।
कार्यक्रम खोलें और प्रत्येक अच्छी तरह से अज्ञात के रूप में एफएएम को नामित करके प्लेट स्थापित करें, और हेक्स को अज्ञात के रूप में। इसके बाद हर सैंपल के लिए नाम बदल ें। टेम्पलेट को सहेजते समय बूंद पढ़ने के प्रयोग को प्रत्यक्ष मात्राकरण के रूप में चलाएं।
सॉफ्टवेयर विश्लेषण के लिए सही प्रयोगात्मक मापदंडों को नामित करें, अर्थात् नमूना जानकारी, सुपर मिक्स, लक्ष्य नाम, लक्ष्य प्रकार, सिग्नल चैनल एक और चैनल दो। फिर, विश्वसनीय परिणामों के लिए 10, 000 से ऊपर बूंद गिनती के लिए सीमा निर्धारित करें। इसके बाद, बूंद टैब में प्रत्येक अच्छी तरह से बूंद गिनती की जांच करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि सभी 10, 000 से ऊपर हैं।
अंत में, नकारात्मक से कुशल संकेत जुदाई के लिए 1D आयाम की जांच करें। प्लेट संपादक में, पूरी प्लेट को हाइलाइट करें, और प्रयोग प्रकार को छोड़ने के लिए सेट करें। एक संदर्भ के रूप में WT लक्ष्य निर्धारित करें, एफएएम के लिए चैनल एक और हेक्स के लिए चैनल दो नामित करें।
NHEJ लक्ष्य को अज्ञात के रूप में सेट करें, एफएएम के लिए चैनल एक को नामित करें और दो चैनल को किसी के रूप में न करें। 2D आयाम टैब में, प्रत्येक नमूने के लिए ग्राफ टूल के साथ क्लस्टर थ्रेसहोल्ड सेट करें। पूंछ आम तौर पर NHEJ परख के लिए डब्ल्यूटी क्लस्टर के साथ जुड़ा हुआ है।
अनुपात टैब के तहत, ग्राफ के शीर्ष दाईं ओर से गियर आइकन पर क्लिक करें, और NHEJ घटनाओं के प्रतिशत के अनुरूप एक बिंदु प्लॉट करने के लिए आंशिक बहुतायत का चयन करें । 10 मच्छरों के 15 अलग-अलग खींचे गए नमूनों में प्रत्येक में विभिन्न एनएचईजे एलील्स शामिल थे, उनका विश्लेषण किया गया और ड्रॉप ऑफ परख का उपयोग करके पहचाना गया, और परिणामों से पता चला कि सभी 15 नमूनों में 100% इंडेल एलील्स थे। एक अन्य प्रयोग में, इस डीडीपीसीआर प्रोटोकॉल के साथ विभिन्न एनएचईजे प्रतिशत वाले जंगली प्रकार के मच्छरों और एनएचईजे मच्छरों के 11 नमूनों की जांच की गई ।
परिणामों से पता चला कि पहचाना गया प्रतिशत अपेक्षाकृत एम्प्लिकॉन विश्लेषण तकनीक द्वारा इंडेल डिटेक्शन के करीब था । बुलबुले से बचने के लिए धीरे-धीरे पिपेट, और सभी पायस वाली बूंदों को कुओं की दीवार को ड्रिप करने की अनुमति दें।
