Name: using baseplating and a miniscope preanchored with an objective lens for calcium transient research in mice
Uploaded: 2021-06-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Baseplating and a Miniscope Preanchored with an Objective Lens for Calcium Transient Research in Mice at JoVE.com

Detta arbete stöddes av ministeriet för vetenskap och teknik, Taiwan (108-2320-B-002 -074, 109-2320-B-002-023-MY2).

Alla procedurer som utfördes i denna studie godkändes av National Taiwan University Animal Care and Use Committee (godkännandenr: NTU-109-EL-00029 och NTU-108-EL-00158).
1. Bedömning av volymförändringen av dentalcement
OBS: Förändringar i volymen av tandcement inträffar under härdningsprocessen. Testa volymförändringarna av tandcement före implantation och basplätering. Forskare kan testa alla märken av tandcement ...

<ol>
	<li>Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+activity+with+genetically+encoded+calcium+indicators.">Imaging neuronal activity with genetically encoded calcium indicators.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), 647-656 (2012).</li><li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+in+neurons.">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li><li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments.">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li><li>Campos, P., Walker, J. J., Mollard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diving+into+the+brain:+deep-brain+imaging+techniques+in+conscious+animals.">Diving into the brain: deep-brain imaging techniques in conscious animals.</a> Journal of Endocrinology. 246 (2), 33-50 (2020).</li><li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope.">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li><li>de Groot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NINscope,+a+versatile+miniscope+for+multi-region+circuit+investigations.">NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations.</a> Elife. 9, 49987 (2020).</li><li>Aharoni, D., Hoogland, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circuit+investigations+with+open-source+miniaturized+microscopes:+past,+present+and+future.">Circuit investigations with open-source miniaturized microscopes: past, present and future.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 141 (2019).</li><li>Resendez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cortical,+subcortical+and+deep+brain+neural+circuit+dynamics+during+naturalistic+mammalian+behavior+with+head-mounted+microscopes+and+chronically+implanted+lenses.">Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses.</a> Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).</li><li>Aharoni, D., Khakh, B. S., Silva, A. J., Golshani, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+the+light+that+we+can+see:+a+new+era+in+miniaturized+microscopy.">All the light that we can see: a new era in miniaturized microscopy.</a> Nature Methods. 16 (1), 11-13 (2019).</li><li>Lee, H. S., Han, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+in+vivo+calcium+imaging+with+a+head-mount+miniaturized+microscope+in+the+amygdala+of+freely+behaving+mouse.">Successful in vivo calcium imaging with a head-mount miniaturized microscope in the amygdala of freely behaving mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (162), e61659 (2020).</li><li>Cai, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+shared+neural+ensemble+links+distinct+contextual+memories+encoded+close+in+time.">A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time.</a> Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).</li><li>Chen, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hypothalamic+switch+for+REM+and+Non-REM+sleep.">A hypothalamic switch for REM and Non-REM sleep.</a> Neuron. 97 (5), 1168-1176 (2018).</li><li>Shuman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakdown+of+spatial+coding+and+interneuron+synchronization+in+epileptic+mice.">Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice.</a> Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).</li><li>Jimenez, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anxiety+cells+in+a+hippocampal-hypothalamic+circuit.">Anxiety cells in a hippocampal-hypothalamic circuit.</a> Neuron. 97 (3), 670-683 (2018).</li><li>Hart, E. E., Blair, G. J., O'Dell, T. J., Blair, H. T., Izquierdo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenetic+modulation+and+single-photon+calcium+imaging+in+anterior+cingulate+cortex+reveal+a+mechanism+for+effort-based+decisions.">Chemogenetic modulation and single-photon calcium imaging in anterior cingulate cortex reveal a mechanism for effort-based decisions.</a> Journal of Neuroscience. , 2548 (2020).</li><li>Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-layer+cortical+Ca2++imaging+in+freely+moving+mice+with+prism+probes+and+miniaturized+fluorescence+microscopy.">Multi-layer cortical Ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55579 (2017).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniscope+GRIN+lens+system+for+calcium+imaging+of+neuronal+activity+from+deep+brain+structures+in+behaving+animals.">Miniscope GRIN lens system for calcium imaging of neuronal activity from deep brain structures in behaving animals.</a> Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).</li><li>Corder, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+amygdalar+neural+ensemble+that+encodes+the+unpleasantness+of+pain.">An amygdalar neural ensemble that encodes the unpleasantness of pain.</a> Science. 363 (6424), 276-281 (2019).</li><li>Liberti, W. A., Perkins, L. N., Leman, D. P., Gardner, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open+source,+wireless+capable+miniature+microscope+system.">An open source, wireless capable miniature microscope system.</a> Journal of Neural Engineering. 14 (4), 045001 (2017).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIN1PIPE:+A+miniscope+1-photon-based+calcium+imaging+signal+extraction+pipeline.">MIN1PIPE: A miniscope 1-photon-based calcium imaging signal extraction pipeline.</a> Cell Reports. 23 (12), 3673-3684 (2018).</li><li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaImAn+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis.">CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> Elife. 8, 38173 (2019).</li><li>Lee, A. K., Manns, I. D., Sakmann, B., Brecht, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+recordings+in+freely+moving+rats.">Whole-cell recordings in freely moving rats.</a> Neuron. 51 (4), 399-407 (2006).</li><li>Burger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+AAV+viral+vectors+pseudotyped+with+viral+capsids+from+serotypes+1,+2,+and+5+display+differential+efficiency+and+cell+tropism+after+delivery+to+different+regions+of+the+central+nervous+system.">Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system.</a> Molecular Therapy. 10 (2), 302-317 (2004).</li><li>Royo, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+AAV+serotypes+stably+transduce+primary+hippocampal+and+cortical+cultures+with+high+efficiency+and+low+toxicity.">Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity.</a> Brain Research. 1190, 15-22 (2008).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Ziv, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+dynamics+of+CA1+hippocampal+place+codes.">Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes.</a> Nature Neuroscience. 16 (3), 264-266 (2013).</li><li>Gargiulo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+anesthesia,+analgesia,+and+care,+Part+I:+anesthetic+considerations+in+preclinical+research.">Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research.</a> ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (1), 55-69 (2012).</li></ol>

Denna rapport beskriver ett detaljerat experimentellt protokoll för forskare som använder UCLA Miniscope-systemet med två linser. Verktygen som är utformade i vårt protokoll är relativt överkomliga för alla laboratorier som vill prova kalciumavbildning in vivo. Vissa protokoll, såsom viral injektion, linsimplantation, dummy baseplating och baseplating, kan också användas för andra versioner av miniskopsystemet för att förbättra framgångsgraden för kalciumavbildning. Förutom allmänna problem me...

Fluorescerande aktivitetsreportrar är idealiska för avbildning av neuronaktiviteten eftersom de är känsliga och har stora dynamiska områden 1,2,3. Därför använder ett ökande antal experiment fluorescensmikroskopi för att direkt observera neuronal aktivitet 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16. Det första miniatyriserade enfotonfluorescensmikroskopet (miniskop) designades 2011 av Mark Schnitzer et al.5. Detta miniskop gör det möjligt för forskare att övervaka fluorescensdynamiken hos cerebellära celler i fritt betande djur5 (dvs utan fysisk fasthållning, nackstöd, sedering eller anestesi till djuren). För närvarande kan tekniken tillämpas för att övervaka ytliga hjärnområden som cortex 6,8,15,16; subkortikala områden såsom dorsal hippocampus 8,11,13,14 och striatum 6,17; och djupa hjärnområden som ventral hippocampus 14, amygdala 10,18 och hypotalamus 8,12.
Under de senaste åren har flera miniskop med öppen källkod utvecklats4,5,6,7,11,13,17,19. Miniskopet kan monteras ekonomiskt av forskare om de följer steg-för-steg-riktlinjerna från University of California, Los Angeles (UCLA) Miniscope-teamet4,7,11,13. Eftersom optisk övervakning av neural aktivitet begränsas av begränsningarna för ljusöverföring7 till och från den neuronala populationen av intresse utformades ett miniskop som kräver att en objektiv gradientbrytningsindex (GRIN) lins (eller objektivlins) förankras längst ner i miniskopet för att förstora synfältet som vidarebefordras från ett relä GRIN-objektiv (eller relälins)6,7,8,10,16,17. Denna relälins implanteras i målhjärnregionen så att fluorescensaktiviteten i målhjärnregionen vidarebefordras på ytan av relälinsen6,7,8,10,16,17. Ungefär 1/4 av en hel sinusformad ljusperiod färdas genom objektivet GRIN-linsen (~ 0,25 tonhöjd) (Figur 1A1), vilket resulterar i en förstorad fluorescensbild6,7. Objektivlinsen är inte alltid fixerad längst ner i miniskopet och det är inte heller nödvändigt att implantera relälinsen6,7,11,13,15. Specifikt finns det två konfigurationer: en med en fast objektivlins i miniskopet och en relälins implanterad i hjärnan8,10,12,14,16 (Figur 1B1) och en annan med bara en avtagbar objektivlins6,7,11,13,15 (Figur 1B2). I konstruktionen baserad på kombinationen fast objektiv och implanterad relälins förs fluorescenssignalerna från hjärnan till relälinsens övre yta (Figur 1A1)7,8,10,12,14,16. Därefter kan objektivlinsen förstora och överföra synfältet från relälinsens övre yta (Figur 1A2). Å andra sidan är den avtagbara objektiva GRIN-linsdesignen mer flexibel, vilket innebär att preimplantation av en relälins i hjärnan inte är obligatorisk (Figur 1B2)6,7,11,13,15. När man använder ett miniskop baserat på en avtagbar objektivlinsdesign behöver forskare fortfarande implantera en lins i målhjärnregionen men de kan antingen implantera en objektivlins6,7,11,13,15 eller en relälins i hjärnan6,7. Valet av ett objektiv eller ett relälins för implantation bestämmer miniskopkonfigurationen som forskaren måste använda. Till exempel är V3 UCLA Miniscope baserat på en avtagbar objektiv GRIN-linsdesign. Forskare kan välja att antingen direkt implantera en objektivlins i hjärnregionen av intresse och montera det "tomma" miniskopet på objektivlinsen6,7,11,13,15 (ett system med en lins; Figur 1B2) eller att implantera en relälins i hjärnan och montera ett miniskop som är förförankrat med en objektivlins6,7 (ett system med två linser; Figur 1B1). Miniskopet fungerar sedan som en fluorescenskamera för att fånga liveströmbilder av neuronal fluorescens producerad av en genetiskt kodad kalciumindikator1,2,3. När miniskopet är anslutet till en dator kan dessa fluorescensbilder överföras till datorn och sparas som videoklipp. Forskare kan studera neuronaktivitet genom att analysera de relativa förändringarna i fluorescens med vissa analyspaket20,21 eller skriva sina koder för framtida analys.
V3 UCLA Miniscope ger flexibilitet för användare att avgöra om de ska avbilda neuronal aktivitet med ett en- eller tvålinssystem7. Valet av inspelningssystem baseras på djupet och storleken på målhjärnområdet. Kort sagt, ett enlinssystem kan bara avbilda ett område som är ytligt (mindre än cirka 2,5 mm djupt) och relativt stort (större än cirka 1,8 x 1,8 mm2) eftersom tillverkarna bara producerar en viss storlek på objektivlinsen. Däremot kan ett tvålinssystem appliceras på vilket målhjärnområde som helst. Tandcementet för limning av basplattan tenderar dock att orsaka felinriktning med ett förändrat avstånd mellan objektiv- och relälinserna, vilket resulterar i en dålig bildkvalitet. Om systemet med två linser används måste två arbetsavstånd riktas exakt för att uppnå optimal bildkvalitet (figur 1A). Dessa två kritiska arbetsavstånd är mellan neuronerna och relälinsens bottenyta och mellan relälinsens övre yta och objektivlinsens nedre yta (figur 1A1). Varje felinriktning eller felplacering av linsen utanför arbetsavståndet resulterar i bildfel (figur 1C2). Däremot kräver enlinssystemet bara ett exakt arbetsavstånd. Objektivlinsens storlek begränsar dock dess tillämpning för övervakning av djupa hjärnregioner (objektivlinsen som passar miniskopet är ungefär 1,8 ~ 2,0 mm 6,11,13,15). Därför är implantation av en objektivlins begränsad för observation av ytan och relativt stora hjärnregioner, såsom cortex 6,15 och dorsal cornu ammonis 1 (CA1) hos möss11,13 . Dessutom måste ett stort område av cortex aspireras för att rikta in sig på dorsal CA111,13. På grund av begränsningen av enlinskonfigurationen som förhindrar avbildning av djupa hjärnregioner, erbjuder kommersiella miniskopsystem endast en kombinerad objektiv / relälins (två linser) design. Å andra sidan kan V3 UCLA-miniskopet modifieras till antingen ett enlins- eller tvålinssystem eftersom dess objektivlins är avtagbar 6,11,13,15. Med andra ord kan V3 UCLA-miniskopanvändare dra nytta av den avtagbara linsen genom att implantera den i hjärnan (skapa ett enlinssystem), när de utför experiment med ytliga hjärnobservationer (mindre än 2,5 mm djupa) eller genom att förförankra den i miniskopet och implantera en relälins i hjärnan (skapa ett tvålinssystem), när man utför experiment som involverar djupa hjärnobservationer. Tvålinssystemet kan också användas för att ytligt observera hjärnan, men forskaren måste känna till de exakta arbetsavstånden mellan objektivlinsen och relälinsen. Den största fördelen med enlinssystemet är att det finns en minskad chans att missa arbetsavstånden än med ett tvålinssystem, med tanke på att det finns två arbetsavstånd som måste riktas exakt för att uppnå optimal bildkvalitet i tvålinssystemet (figur 1A). Därför rekommenderar vi att du använder ett enlinssystem för ytliga hjärnobservationer. Men om experimentet kräver avbildning i det djupa hjärnområdet måste forskaren lära sig att undvika felinriktning av de två linserna.
Det grundläggande protokollet för konfiguration med två linser av miniskop för experiment inkluderar linsimplantation och basplätering 8,10,16,17. Baseplating är limning av en basplatta på ett djurs huvud så att miniskopet så småningom kan monteras ovanpå djuret och videoband fluorescenssignalerna från neuroner (figur 1B). Denna procedur innebär att man använder tandcement för att limma basplattan på skallen (figur 1C), men krympning av tandcement kan orsaka oacceptabla förändringar i avståndet mellan den implanterade relälinsen och objektivlinsen 8,17. Om det förskjutna avståndet mellan de två linserna är för stort kan cellerna inte sättas i fokus.
Detaljerade protokoll för kalciumavbildningsexperiment i djupa hjärnor med miniskop har redan publicerats8,10,16,17. Författarna till dessa protokoll har använt Inscopix-systemet8,10,16 eller andra anpassade mönster17 och har beskrivit de experimentella procedurerna för virusselektion, kirurgi och basplattfästning. Deras protokoll kan dock inte exakt tillämpas på andra system med öppen källkod, såsom V3 UCLA Miniscope-systemet, NINscope6och Finchscope19. Feljustering av de två linserna kan uppstå under inspelningen i en konfiguration med två linser med ett UCLA Miniscope på grund av den typ av tandcement som används för att cementera basplattan till skallen8,17 (Figur 1C). Det nuvarande protokollet behövs eftersom avståndet mellan den implanterade relälinsen och objektivlinsen är benägen att förskjutas på grund av oönskad krympning av tandcement under baspläteringsproceduren. Under baspläteringen måste det optimala arbetsavståndet mellan den implanterade relälinsen och objektivlinsen hittas genom att justera avståndet mellan miniskopet och toppen av relälinsen, och basplattan ska sedan limmas på denna idealiska plats. När det korrekta avståndet mellan objektivlinsen och den implanterade relälinsen har ställts in kan longitudinella mätningar erhållas med cellulär upplösning (Figur 1B; in vivo inspelning). Eftersom det optimala arbetsavståndet för ett reläobjektiv är litet (50 - 350 μm)4,8kan överdriven cementkrympning under härdning göra det svårt att hålla objektivlinsen och den implanterade relälinsen inom lämpligt intervall. Det övergripande målet med denna rapport är att tillhandahålla ett protokoll för att minska krympningsproblemen8,17 som inträffar under baspläteringsproceduren och för att öka framgångsgraden för miniskopinspelningar av fluorescenssignaler i en konfiguration med två linser. Framgångsrik miniskopinspelning definieras som inspelning av en liveström av märkbara relativa förändringar i fluorescensen hos enskilda neuroner i ett fritt uppträdande djur. Även om olika märken av tandcement har olika krympningshastigheter kan forskare välja ett märke som tidigare har testats6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22. Men inte alla märken är lätta att få i vissa länder / regioner på grund av importreglerna för medicinska material. Därför har vi utvecklat metoder för att testa krympningshastigheten för tillgängliga dentala cement och, viktigare, tillhandahålla ett alternativt protokoll som minimerar krympningsproblemet. Fördelen jämfört med det nuvarande baspläteringsprotokollet är en ökning av framgångsgraden för kalciumavbildning med verktyg och cement som lätt kan erhållas i laboratorier. UCLA-miniskopet används som ett exempel, men protokollet är också tillämpligt på andra miniskop. I denna rapport beskriver vi en optimerad baspläteringsprocedur och rekommenderar också några strategier för montering av UCLA-miniskopsystemet med två linser (Figur 2A). Både exempel på lyckad implantation (n = 3 möss) och exempel på misslyckad implantation (n = 2 möss) för tvålinskonfigurationen med UCLA-miniskopet presenteras tillsammans med diskussionerna om orsakerna till framgångar och misslyckanden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.7-mm drill bit</td>
			<td>&#160;#19008-07</td>
			<td>Fine Science Tools; USA</td>
			<td>for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1&#8211;10 &#956;l pipette tips</td>
			<td>104-Q; QSP</td>
			<td>Fisher Scientific; Singapore</td>
			<td>for testing dental cement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 G IV cathater</td>
			<td>#SR-OX2032CA</td>
			<td>Terumo Corporation; Tokyo, Japan</td>
			<td>for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 G needle</td>
			<td>AGANI, AN*2713R</td>
			<td>Terumo Corporation; Tokyo, Japan</td>
			<td>for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE</td>
			<td>#104487-AAV9; 1.5*10^13</td>
			<td>Addgene viral prep; MA, USA</td>
			<td>for viral injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atropine sulfate</td>
			<td></td>
			<td>Astart; Hsinchu, Taiwan</td>
			<td>for surgery/dummy baseplating/baseplating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baseplate</td>
			<td>V3</td>
			<td>http://miniscope.org</td>
			<td>for dummy baseplating/baseplating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLU TACK</td>
			<td>#30840350</td>
			<td>Bostik; Chelsea, Massachusetts, USA</td>
			<td>Reusable adhesive clay; for surgery/dummy baseplating/baseplating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Rongeur Friedman</td>
			<td>13 cm</td>
			<td>Diener; Tuttlingen, Germany</td>
			<td>for baseplating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td></td>
			<td>INDIVIOR; UK</td>
			<td>for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Rimadyl</td>
			<td>Zoetis; Exton, PA</td>
			<td>analgesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceftazidime</td>
			<td></td>
			<td>Taiwan Biotech; Taiwan</td>
			<td>prevent infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquisition PCB for UCLA Miniscope</td>
			<td>purchased on https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq</td>
			<td></td>
			<td>for baseplating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement set</td>
			<td>Tempron</td>
			<td>GC Corp; Tokyo, Japan</td>
			<td>for testing dental cement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement set</td>
			<td>Tokuso Curefast</td>
			<td>Tokuyama Dental Corp.; Tokyo, Japan</td>
			<td>for testing dental cement/surgery/dummy baseplating/baseplating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Lab Standard with Mouse and Rat Adaptors</td>
			<td>#51673</td>
			<td>Stoelting Co; Illinois, USA</td>
			<td>for surgery/dummy baseplating/baseplating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duratear ointment</td>
			<td></td>
			<td>Alcon; Geneva, Switzerland</td>
			<td>for surgery/dummy baseplating/baseplating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibuprofen</td>
			<td></td>
			<td>YungShin; Taiwan</td>
			<td>analgesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td></td>
			<td>Panion &#38; BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwan</td>
			<td>for surgery/dummy baseplating/baseplating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inscopix</td>
			<td>nVista System</td>
			<td>Inscopix; Palo Alto, CA</td>
			<td>for comparison with V3 UCLA Miniscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td></td>
			<td>Pfizer; NY, NY</td>
			<td>for euthanasia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro bulldog clamps</td>
			<td>#12.102.04</td>
			<td>Dimedo; Tuttlingen, Germany</td>
			<td>for lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter Microsyringes, 2.0 &#181;L, 25 gauge</td>
			<td>#88400</td>
			<td>Hamilton; Bonaduz, Switzerland</td>
			<td>for viral injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molding silicone rubber</td>
			<td>ZA22 Thixo</td>
			<td>Zhermack; Badia Polesine, Italy</td>
			<td>for dummy baseplating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective Gradient index (GRIN) lens</td>
			<td>#64519</td>
			<td>Edmund Optics; NJ, USA</td>
			<td>for dummy baseplating/baseplating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>#PM996</td>
			<td>Bemis; Neenah, USA</td>
			<td>for dummy baseplating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Suction</td>
			<td>#DF-750</td>
			<td>Doctor&#39;s Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwan</td>
			<td>for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relay GRIN lens</td>
			<td>#1050-002177</td>
			<td>Inscopix; Palo Alto, CA, USA</td>
			<td>for dummy baseplating/baseplating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel anchor screws</td>
			<td>1.00 mm diameter, total length 3.00 mm</td>
			<td></td>
			<td>for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>#SL720</td>
			<td>Sage Vison; New Taipei City, Taiwan</td>
			<td>for surgery/dummy baseplating/baseplating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic apparatus</td>
			<td>#51673</td>
			<td>Stoelting; IL, USA</td>
			<td>for surgery/dummy baseplating/baseplating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Cure Adhesive</td>
			<td>#3321</td>
			<td>Loctite; D&#252;sseldorf, Germany</td>
			<td>for testing dental cement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V3 UCLA Miniscope</td>
			<td>purchased on https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components</td>
			<td></td>
			<td>for surgery/dummy baseplating/baseplating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>X1126</td>
			<td>Sigma-Aldrich; St. Louis, MO</td>
			<td>for euthanasia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylocaine pump spray 10%</td>
			<td></td>
			<td>AstraZeneca; S&#246;dert&#228;lje, Sweden</td>
			<td>for surgery</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using baseplating and a miniscope preanchored with an objective lens for calcium transient research in mice

Neuroforskare använder miniatyrmikroskop (miniskop) för att observera neuronal aktivitet hos fritt betande djur. University of California, Los Angeles (UCLA) Miniscope-teamet tillhandahåller öppna resurser för forskare att bygga miniskop själva. V3 UCLA Miniscope är ett av de mest populära miniskopen med öppen källkod som för närvarande används. Det tillåter avbildning av fluorescenstransienter som emitteras från genetiskt modifierade neuroner genom en objektivlins implanterad på ytliga cortex (ett enlinssystem) eller i djupa hjärnområden genom en kombination av en relälins implanterad i den djupa hjärnan och en objektivlins som är förförankrad i miniskopet för att observera den vidarebefordrade bilden (ett tvålinssystem). Även under optimala förhållanden (när neuroner uttrycker fluorescensindikatorer och relälinsen har implanterats ordentligt) kan en volymförändring av tandcementet mellan basplattan och dess fastsättning på skallen vid cementhärdning orsaka felinriktning med ett förändrat avstånd mellan objektiv- och relälinserna, vilket resulterar i dålig bildkvalitet. En basplatta är en platta som hjälper till att montera miniskopet på skallen och fixerar arbetsavståndet mellan objektiv- och relälinserna. Således förändrar förändringar i volymen av tandcement runt basplattan avståndet mellan linserna. Det nuvarande protokollet syftar till att minimera feljusteringsproblemet som orsakas av volymförändringar i dentalcementet. Protokollet minskar felinriktningen genom att bygga en första grund av tandcement under relälinsimplantation. Konvalescenstiden efter implantation är tillräcklig för att grunden av dentalcement ska härda basplattan helt, så basplattan kan cementeras på denna ställning med så lite ny cement som möjligt. I den här artikeln beskriver vi strategier för basplätering hos möss för att möjliggöra avbildning av neuronal aktivitet med en objektiv lins förankrad i miniskopet.

Bedömning av volymförändringen av dentalcement Eftersom volymen av dentalcement förändras under härdningsprocessen kan det påverka bildkvaliteten avsevärt, med tanke på att arbetsavståndet för en GRIN-lins är cirka 50 till 350 μm 4,8. Därför testades två kommersiellt tillgängliga dentala cement i detta fall, Tempron och Tokuso, före implantations- och baspläteringsproceduren (figur 5). Videor ut...

Watch this Scientific Journal Video about Using Baseplating and a Miniscope Preanchored with an Objective Lens for Calcium Transient Research in Mice at JoVE.com

Using Baseplating and a Miniscope Preanchored with an Objective Lens for Calcium Transient Research in Mice

Krympningen av tandcement under härdning förskjuter basplattan. Detta protokoll minimerar problemet genom att skapa en första grund av dentalcementet som lämnar utrymme för att cementera basplattan. Veckor senare kan basplattan cementeras på plats på denna ställning med lite ny cement, vilket minskar krympningen.

Använda basplätering och ett miniskop förförankrat med en objektivlins för kalciumövergående forskning på möss

Neuroscientists use miniature microscopes (miniscopes) to observe neuronal activity in freely behaving animals. The University of California, Los Angeles ...

Detta miniskop kan minska krympningsproblemet med tandcement under basplattans procedur och öka framgångsgraden för miniskopinspelningar av fluorescenssignaler i två längdkonfigurationer. Om fluorescenstransienten inte kan observeras under basplätering, kontrollera uttrycket av kalciumindikator och placeringen av en relälins på hjärnskivan. Börja med att montera innernålen på en 20 gauge intravenös kateter med en diameter på en millimeter på den stereotaktiska armen.Sänk katetern i ventral majsammonis 1 i målområdet. Sänk sedan mikroinjektionsnålen med en hastighet av 100 till 200 mikrometer per minut i ventral cornu ammonis 1 och infusera 200 nanoliter av virusvektorn i målområdet med en hastighet av 25 nanoliter per minut. Efter att ha låtit viruset diffundera i 10 minuter, dra upp mikroinjektionsnålen med en hastighet av 100 till 200 mikrometer per minut.Efter desinfektion av relälinsen, blötlägg linsen i kall pyrogenfri saltlösning tills implantation. Använd en mikrobulldoggklämma med värmekrympslang, håll relälinsen och placera den ovanpå målområdet med en hastighet av 100 till 200 mikrometer per minut. Stabilisera sedan linsen med tandcement.För att ställa in ett miniskop, fäst objektivlinsen på botten och montera basplattan på miniskopet. Linda 10 centimeter paraffinfilm runt basplattans utsida. Använd återanvändbar självhäftande lera och håll miniskopet med den stereotaxiska armsonden.Rikta objektivet ovanpå relälinsen med så lite utrymme mellan linserna som möjligt. Använd tandcement för att säkra basplattans placering, så att cementet endast berör paraffinfilmen. När tandcementet har torkat, ta bort paraffinfilmen, basplattan och miniskopet och håll tandcementbasen ihålig.Försegla relälinsen med gjutet silikongummi och täck silikongummit med ett tunt lager tandcement. Koppla bort musen från de stereotaxiska instrumenten och placera musen i en återhämtningskammare. För basplätering, skär det tunna lagret av tandcementtaket försiktigt med en benrongeur och ta bort silikongummit.Rengör relälinsens yta med 75% alkohol. Fäst den inställda skruven bredvid basplattan för att fästa den på miniskopets botten. Justera fokusbilden så att den är ungefär 2,7 till 3 millimeter från huvudhuset.När inställningen är klar ansluter du miniskopet till datainsamlingskortet och ansluter miniskopet till en USB 3.0-port på en dator. Kör datainsamlingsprogramvaran som utvecklats av UCLA-teamet. Justera exponeringen till 255, förstärkningen till 64x och excitationslampan till 5%För att ansluta miniskopet till datainsamlingsprogramvaran, klicka på anslutningsknappen och titta på liveströmmen för datainsamlingsprogramvaran med tanke på relälinsens marginal som ett landmärke.När relälinsen har hittats, rikta in miniskopobjektivet mot relälinsen för hand. Justera miniskopets olika vinklar och avstånd, börja söka efter fluorescenssignalerna. Håll miniskopet i optimalt läge, flytta den stereotaxiska armen mot miniskopet och fäst miniskopet på den stereotaxiska armen med återanvändbar självhäftande lera.Sök efter den bästa vyn genom att justera X-, Y- och Z-armarna något. Justera vinkeln mellan objektivlinsens yta och relälinsen genom att vrida öronstången, tandstången eller återanvändbar självhäftande lera på Z-axeln. Viralt uttryck och linsimplantation är framgångsrika när minst en cell förskjutit fluorescenstransienter under basplätering.Fäst bottenplattan ordentligt med minsta möjliga mängd tandcement samtidigt som du övervakar området av intresse för att säkerställa att den optimala positionen inte ändras. I den representativa studien visade sig förfarandet med basplätering av provdockor vara fördelaktigt eftersom det resulterade i en mindre förskjutning av basplattans placering än den ursprungliga proceduren. Basplattans förskjutning påverkades också av tandcementens höjd.Basplattan som var förankrad 0,5 centimeter ovanför skallen skiftade betydligt mindre än basplattan som var fixerad en centimeter ovanför skallen. I ett exempel på framgångsrik avbildning under baspläteringsproceduren noterades fluorescenstransienter tillsammans med blodkärl i det bedövade djuret. Fluorescenstransienter observerades fem dagar efter basplätering även när musen betedde sig fritt i sin hembur med endast en liten förskjutning i en position.Efterföljande kalciumavbildning av möss utfördes. I några få fall uppstod problem under baspläteringsproceduren, såsom frånvaron av något annat än en enhetlig bakgrund eller synlighet av vita cellmarginaler. utan fluorescenstransienter.Det är viktigt att fixera basplattan ordentligt på målområdet med minsta möjliga mängd tandcement. Med skifferteknik kan forskare longitudinellt observera neural aktivitet över detta. Med rätt licens kan denna procedur också gälla för att observera det neurala nätverket i synfältet.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

En enkel och billig metod för bestämning Cold Känslighet och anpassning hos möss

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Denver Papillae Protocol for Objective Analysis of Fungiform Papillae

Denver Papiller Protokoll för objektiv analys av Fungiform Papiller

The goal of the Denver Papillae Protocol is to use a dichotomous key to define and prioritize the characteristics of fungiform papillae (FP) to ensure ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Extracellulär inspelning av nervaktiviteten Kombinerat med Microiontophoretic Tillämpning av neuroaktiva ämnen i Vakna möss

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

Loading a Calcium Dye into Frog Nerve Endings Through the Nerve Stump: Calcium Transient Registration in the Frog Neuromuscular Junction

Fylla på en kalciumfärg i fröens nervändamål via nervstubben: Kalciumtransientregistrering i Neuromuskulär Junction

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

En In Vivo blod - hjärnbarriären permeabilitet test på möss med Fluorescently märkt spårämnen

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

An Objective and Reproducible Test of Olfactory Learning and Discrimination in Mice

En objektiv och reproducerbara Test av lukt lärande och diskriminering i möss

Olfaction is the predominant sensory modality in mice and influences many important behaviors, including foraging, predator detection, mating, and ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

Ablation av neuronala invånare använder en två-photon Laser och sin bedömning med kalcium Imaging och beteendemässiga inspelning i zebrafiskar larver

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

En hög genomströmning kalcium-flux-analysen att studera NMDA-receptorer med känslighet för glycin/D-serine och glutamat

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...

Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse

Framgångsrik in vivo kalciumavbildning med ett huvudmonterat miniatyriserat mikroskop i Amygdala av fritt beter sig mus

In vivo real-time monitoring of neuronal activities in freely moving animals is one of key approaches to link neuronal activity to behavior. For this ...

Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice

Elektrokortatisk inspelning av hjärnbarkområden manipulerade med hjälp av ett Adeno-associerat virus som riktar sig mot cofilin hos möss

The use of electrocorticographic (ECoG) recordings in rodents is relevant to sleep research and to the study of a wide range of neurological conditions. ...