Name: the use of the patch-clamp technique to study the thermogenic capacity of mitochondria
Uploaded: 2021-05-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria at JoVE.com

أشكر الدكتور يوري كيريشوك على العلم العظيم الذي كنت جزءا منه في مختبره وأعضاء مختبر كيريشوك على المناقشات المفيدة. كما أشكر الدكتور دوغلاس سي والاس على توفير الفئران AAC1 بالضربة القاضية. التمويل: تم دعم A.M.B من قبل جائزة التطوير الوظيفي لجمعية القلب الأمريكية 19CDA34630062.

تتوافق جميع الإجراءات التجريبية على الحيوانات التي تم تنفيذها مع المبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس (IACUC).
ملاحظة: يعتمد إجراء عزل الميتوكوندريا على الطرد المركزي التفا...

<ol>
	<li>Divakaruni, A. S., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+and+physiology+of+mitochondrial+proton+leak.">The regulation and physiology of mitochondrial proton leak.</a> Physiology (Bethesda). 26 (3), 192-205 (2011).</li><li>Chouchani, E. T., Kazak, L., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+advances+in+adaptive+thermogenesis:+UCP1+and+beyond.">New advances in adaptive thermogenesis: UCP1 and beyond.</a> Cell Metabolism. 29 (1), 27-37 (2019).</li><li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue:+function+and+physiological+significance.">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).</li><li>Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hunt+for+the+molecular+mechanism+of+brown+fat+thermogenesis.">The hunt for the molecular mechanism of brown fat thermogenesis.</a> Biochimie. 134, 9-18 (2017).</li><li>Bertholet, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H(+)+transport+is+an+integral+function+of+the+mitochondrial+ADP/ATP+carrier.">H(+) transport is an integral function of the mitochondrial ADP/ATP carrier.</a> Nature. 571 (7766), 515-520 (2019).</li><li>Fedorenko, A., Lishko, P. V., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+fatty-acid-dependent+UCP1+uncoupling+in+brown+fat+mitochondria.">Mechanism of fatty-acid-dependent UCP1 uncoupling in brown fat mitochondria.</a> Cell. 151 (2), 400-413 (2012).</li><li>Bertholet, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+patch+clamp+of+beige+adipocytes+reveals+UCP1-positive+and+UCP1-negative+cells+both+exhibiting+futile+creatine+cycling.">Mitochondrial patch clamp of beige adipocytes reveals UCP1-positive and UCP1-negative cells both exhibiting futile creatine cycling.</a> Cell Metabolism. 25 (4), 811-822 (2017).</li><li>Kirichok, Y., Krapivinsky, G., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+calcium+uniporter+is+a+highly+selective+ion+channel.">The mitochondrial calcium uniporter is a highly selective ion channel.</a> Nature. 427 (6972), 360-364 (2004).</li><li>Fieni, F., Lee, S. B., Jan, Y. N., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter+varies+greatly+between+tissues.">Activity of the mitochondrial calcium uniporter varies greatly between tissues.</a> Nature Communications. 3, 1317 (2012).</li><li>Chaudhuri, D., Sancak, Y., Mootha, V. K., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCU+encodes+the+pore+conducting+mitochondrial+calcium+currents.">MCU encodes the pore conducting mitochondrial calcium currents.</a> eLife. 2, 00704 (2013).</li><li>Vais, H., Payne, R., Paudel, U., Li, C., Foskett, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+transmembrane+mechanisms+control+MCU-mediated+mitochondrial+Ca(2+)+uptake.">Coupled transmembrane mechanisms control MCU-mediated mitochondrial Ca(2+) uptake.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21731-21739 (2020).</li><li>Vais, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMRE+is+a+matrix+Ca(2+)+sensor+that+governs+gatekeeping+of+the+mitochondrial+Ca(2+)+uniporter.">EMRE is a matrix Ca(2+) sensor that governs gatekeeping of the mitochondrial Ca(2+) uniporter.</a> Cell Reports. 14 (3), 403-410 (2016).</li><li>Vais, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCUR1,+CCDC90A,+is+a+regulator+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">MCUR1, CCDC90A, is a regulator of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Cell Metabolism. 22 (4), 533-535 (2015).</li><li>Kamer, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MICU1+imparts+the+mitochondrial+uniporter+with+the+ability+to+discriminate+between+Ca(2+)+and+Mn(2+).">MICU1 imparts the mitochondrial uniporter with the ability to discriminate between Ca(2+) and Mn(2+).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 7960-7969 (2018).</li><li>Bertholet, A. M., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+analysis+of+the+mitochondrial+H(+)+leak+in+brown+and+beige+fat.">Patch-clamp analysis of the mitochondrial H(+) leak in brown and beige fat.</a> Frontiers in Physiology. 11, 326 (2020).</li><li>Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization,+identification,+and+excision+of+murine+adipose+depots.">Localization, identification, and excision of murine adipose depots.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52174 (2014).</li><li>Garg, V., Kirichok, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+analysis+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">Patch-clamp analysis of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Methods in Molecular Biology. 1925, 75-86 (2019).</li><li>Decker, G. L., Greenawalt, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+and+biochemical+studies+of+mitoplasts+and+outer+membranes+derived+from+French-pressed+mitochondria.+Advances+in+mitochondrial+subfractionation.">Ultrastructural and biochemical studies of mitoplasts and outer membranes derived from French-pressed mitochondria. Advances in mitochondrial subfractionation.</a> Journal of Ultrastructure Research. 59 (1), 44-56 (1977).</li><li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+electrical+currents+across+the+plasma+membrane+of+mammalian+sperm+cells.">Recording electrical currents across the plasma membrane of mammalian sperm cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), (2021).</li><li>Flaming, D. G., Brown, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropipette+puller+design:+form+of+the+heating+filament+and+effects+of+filament+width+on+tip+length+and+diameter.">Micropipette puller design: form of the heating filament and effects of filament width on tip length and diameter.</a> Journal of Neuroscience Methods. 6 (1-2), 91-102 (1982).</li><li>Klingenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ADP+and+ATP+transport+in+mitochondria+and+its+carrier.">The ADP and ATP transport in mitochondria and its carrier.</a> Biochimica and Biophysica Acta. 1778 (10), 1978-2021 (2008).</li></ol>

تهدف مقالة هذه الطريقة إلى تقديم تقنية المشبك التصحيحي التي تم تطبيقها مؤخرا على الميتوكوندريا ، وهو نهج جديد لدراسة تسرب H + مباشرة من خلال IMM المسؤول عن توليد الحرارة الميتوكوندريا5،6،7،15. لا تقتصر هذه التقنية عل?...

تشتهر الميتوكوندريا بكونها قوة الخلية. في الواقع ، هم المصدر الرئيسي للطاقة الكيميائية ، ATP. ما هو أقل شهرة هو أن الميتوكوندريا تولد الحرارة أيضا. في الواقع ، كل ميتوكوندريون يولد باستمرار نوعين من الطاقات (ATP والحرارة) والتوازن الدقيق بين شكلي الطاقة يحدد توازن الخلايا الأيضية (الشكل 1). كيف توزع الميتوكوندريا الطاقة بين ATP والحرارة هو بالتأكيد السؤال الأكثر جوهرية في مجال الطاقة الحيوية ، على الرغم من أنه لا يزال غير معروف إلى حد كبير. نحن نعلم أن زيادة إنتاج حرارة الميتوكوندريا (تسمى توليد الحرارة الميتوكوندريا) ، وبالتالي تقليل إنتاج ATP يزيد من إنفاق الطاقة وهذه واحدة من أفضل الطرق لمكافحة متلازمة التمثيل الغذائي1.
ينشأ توليد الحرارة للميتوكوندريا من تسرب H+ عبر غشاء الميتوكوندريا الداخلي (IMM) ، مما يؤدي إلى فصل أكسدة الركيزة وتخليق ATP مع ما يترتب على ذلك من إنتاج للحرارة ، ومن هنا جاء اسم "فك ارتباط الميتوكوندريا"1 (الشكل 1). يعتمد تسرب H+ هذا على ناقلات الميتوكوندريا التي تسمى البروتينات غير المقترنة (UCPs). كان UCP1 أول UCP يتم تحديده. يتم التعبير عنه فقط في الأنسجة الحرارية والدهون البنية والدهون البيج التي تتخصص فيها الميتوكوندريا لإنتاج الحرارة2،3،4. ظلت هوية UCP في الأنسجة غير الدهنية مثل العضلات الهيكلية والقلب والكبد مثيرة للجدل. يمكن أن تحتوي الميتوكوندريا في هذه الأنسجة على حوالي 25٪ من إجمالي طاقة الميتوكوندريا المحولة إلى حرارة ، مما قد يؤثر بشكل كبير على فسيولوجيا الجسم كله1. إلى جانب الحفاظ على درجة حرارة الجسم الأساسية ، يمنع توليد الحرارة الميتوكوندريا أيضا السمنة الناجمة عن النظام الغذائي عن طريق تقليل السعرات الحرارية. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يقلل من إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) بواسطة الميتوكوندريا لحماية الخلايا من الضرر التأكسدي1. وبالتالي ، فإن التوليد الحراري للميتوكوندريا يشارك في الشيخوخة الطبيعية ، والاضطرابات التنكسية المرتبطة بالعمر ، وغيرها من الحالات التي تنطوي على الإجهاد التأكسدي ، مثل نقص التروية - التروية. لذلك ، فإن توليد الحرارة الميتوكوندريا هو منظم قوي لعملية التمثيل الغذائي الخلوي ، والفهم الميكانيكي لهذه العملية الأساسية سيعزز تطوير استراتيجيات علاجية لمكافحة العديد من الأمراض المرتبطة بخلل الميتوكوندريا.
كان التنفس الميتوكوندريا أول تقنية تكشف عن الدور الحاسم للتوليد الحراري للميتوكوندريا في التمثيل الغذائي الخلوي ولا تزال الأكثر شعبية في المجتمع1. تعتمد هذه التقنية على قياس استهلاك الأكسجين بواسطة سلسلة نقل إلكترون الميتوكوندريا (ETC) التي تزداد عند تنشيط تسرب الميتوكوندريا H+. هذه التقنية ، على الرغم من أنها مفيدة ، لا يمكنها دراسة تسرب الميتوكوندريا H + مباشرة عبر IMM1 ، مما يجعل التحديد الدقيق وتوصيف البروتينات المسؤولة عنه أمرا صعبا ، خاصة في الأنسجة غير الدهنية التي يكون فيها إنتاج الحرارة ثانويا مقارنة بإنتاج ATP. في الآونة الأخيرة ، قدم تطوير تقنية المشبك التصحيحي المطبقة على الميتوكوندريا ، أول دراسة مباشرة لتسرب H + عبر IMM بأكمله في الأنسجة المختلفة 5,6,7.
تم إنشاء مشبك رقعة الميتوكوندريا لكامل IMM لأول مرة بطريقة قابلة للتكرار بواسطة Kirichok et al.8. ووصفوا أول قياس مباشر لتيارات الميتوكوندريا يونيبورتر الكالسيوم (MCU) في عام 2004 باستخدام mitoplasts من خطوط خلايا COS-78. في وقت لاحق ، أظهر مختبر Kirichok تيارات الكالسيوم من IMMs من أنسجة الفأر 9 وذبابة الفاكهة 9. تستخدم مختبرات أخرى الآن هذه التقنية بشكل روتيني لدراسة الخصائص الفيزيائية الحيوية ل MCU10،11،12،13،14. من الممكن أيضا إجراء تحليل كامل لمشبك التصحيح IMM لتوصيل البوتاسيوم والكلوريد وقد تم ذكره في العديد من الأوراق البحثية ولكنه لم يكن بعد الموضوع الرئيسي لمنشور 6,7,9. تم الإبلاغ عن أول قياس لتيارات H + عبر IMM في عام 2012 من الميتوكوندريا6 ذات الدهون البنية للفئران ، ومن الميتوكوندريا الدهنية البيج للفئران في عام 20177. ويرجع هذا التيار إلى البروتين المحدد غير المقترن للأنسجة الحرارية ، UCP1 6,7. وصف العمل الأخير المنشور في عام 2019 AAC بأنه البروتين الرئيسي المسؤول عن تسرب الميتوكوندريا H + في الأنسجة غير الدهنية مثل القلب والعضلات الهيكلية5.
يسمح هذا النهج الفريد الآن بإجراء تحليل وظيفي مباشر عالي الدقة لقنوات أيون الميتوكوندريا والناقلات المسؤولة عن توليد الحرارة في الميتوكوندريا. لتسهيل توسيع الطريقة واستكمال الدراسات الأخرى مثل تنفس الميتوكوندريا ، يتم وصف بروتوكول مفصل أدناه لقياس تيارات H + التي تحملها UCP1 و AAC. يتم وصف ثلاث خطوات مهمة: 1) عزل الميتوكوندريا عن الدهون البنية للفأر لتحليل تيار H+ المعتمد على UCP1 والعزلة الميتوكوندريا من القلب لتحليل تيار H+ المعتمد على AAC ، 2) إعداد mitoplasts باستخدام مطبعة فرنسية للتمزق الميكانيكي لغشاء الميتوكوندريا الخارجي (OMM) ، 3) تسجيلات المشبك التصحيحي لتيارات H+ المعتمدة على UCP1 و AAC المعتمدة على H + عبر IMM بأكمله.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% gelatin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60X water immersion objective, numerical aperture 1.20</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO60XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF150-86-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1550B Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Press</td>
			<td>Glen Mills</td>
			<td>5500-000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inversed Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71 or IX73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Forge</td>
			<td>(Narishige)</td>
			<td>MF-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanupulator MPC-385</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>FG-MPC325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode holder for agar bridge</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH3F4515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>(Sutter Instruments)</td>
			<td>P97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Cell for French Press</td>
			<td>Glen Mills</td>
			<td>5500-FA-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIXER IKA 6-2000RPM</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-50705-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 100X magnification</td>
			<td>Nikon&#160; lens</td>
			<td>MPlan 100/0.80 ELWD 210/0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pClamp 10</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-24E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>358039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75 009 521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table</td>
			<td>Newport</td>
			<td>VIS3036-SG2-325A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-gluconic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>M4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>3777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>60128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>63068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>331635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisBase</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisCl</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of the patch-clamp technique to study the thermogenic capacity of mitochondria

يعد تكوين الحرارة في الميتوكوندريا (المعروف أيضا باسم فك ارتباط الميتوكوندريا) أحد أكثر الأهداف الواعدة لزيادة إنفاق الطاقة لمكافحة متلازمة التمثيل الغذائي. الأنسجة الحرارية مثل الدهون البنية والبيج تطور الميتوكوندريا عالية التخصص لإنتاج الحرارة. الميتوكوندريا من الأنسجة الأخرى ، التي تنتج في المقام الأول ATP ، تحول أيضا ما يصل إلى 25 ٪ من إجمالي إنتاج طاقة الميتوكوندريا إلى حرارة ، وبالتالي ، يمكن أن يكون لها تأثير كبير على فسيولوجيا الجسم كله. لا يعد توليد الحرارة للميتوكوندريا ضروريا للحفاظ على درجة حرارة الجسم فحسب ، بل يمنع أيضا السمنة الناجمة عن النظام الغذائي ويقلل من إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) لحماية الخلايا من التلف التأكسدي. نظرا لأن توليد الحرارة في الميتوكوندريا هو منظم رئيسي لعملية التمثيل الغذائي الخلوي ، فإن الفهم الميكانيكي لهذه العملية الأساسية سيساعد في تطوير استراتيجيات علاجية لمكافحة العديد من الأمراض المرتبطة بخلل الميتوكوندريا. الأهم من ذلك ، أن الآليات الجزيئية الدقيقة التي تتحكم في التنشيط الحاد للتوليد الحراري في الميتوكوندريا غير محددة بشكل جيد. ويرجع هذا النقص في المعلومات إلى حد كبير إلى ندرة طرق القياس المباشر للبروتينات غير المقترنة. وقد مكن التطور الأخير لمنهجية المشبك الرقعة المطبقة على الميتوكوندريا، لأول مرة، من إجراء دراسة مباشرة للظاهرة في أصل توليد الحرارة للميتوكوندريا، وتسرب H+ من خلال IMM، وأول توصيف فيزيائي حيوي لناقلات الميتوكوندريا المسؤولة عنها، والبروتين غير المقترن 1 (UCP1)، المحدد للدهون البنية والبيج، وناقل ADP/ATP (AAC) لجميع الأنسجة الأخرى. سيوفر هذا النهج الفريد رؤى جديدة حول الآليات التي تتحكم في تسرب H + وتوليد الحرارة الميتوكوندريا وكيف يمكن استهدافها لمكافحة متلازمة التمثيل الغذائي. تصف هذه الورقة منهجية المشبك التصحيحي المطبقة على الميتوكوندريا لدراسة قدرتها الحرارية عن طريق قياس تيارات H+ مباشرة من خلال IMM.

قدم تطوير منهجية المشبك الرقعة المطبقة على الميتوكوندريا أول دراسة مباشرة لتسرب H + من خلال IMM وناقلات الميتوكوندريا ، UCP1 و AAC ، المسؤولة عن ذلك. يمكن أن يوفر التحليل الكهروفسيولوجي لتسريبات H+ المعتمدة على UCP1 و AAC نظرة أولى على القدرة الحرارية للميتوكوندريا. يصف قسم النتائج الإج?...

Watch this Scientific Journal Video about The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria at JoVE.com

The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria

تفصل مقالة هذه الطريقة الخطوات الرئيسية في قياس تسرب H + عبر غشاء الميتوكوندريا الداخلي باستخدام تقنية المشبك التصحيحي ، وهو نهج جديد لدراسة القدرة الحرارية للميتوكوندريا.

استخدام تقنية المشبك التصحيحي لدراسة القدرة الحرارية للميتوكوندريا

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat ...

يصف هذا البروتوكول كيف يمكن استخدام تقنية مشبك التصحيح لدراسة القدرة الحرارية للميتوكوندريا عن طريق قياس تسرب بروتون الميتوكوندريا مباشرة عبر غشاء الميتوكوندريا الداخلي. يساعد القياس المباشر لتيار البروتون من خلال غشاء الميتوكوندريا الداخلي على تحديد وتوصيف الآليات الجزيئية المسؤولة عن توليد الحرارة الميتوكوندريا بدقة. لا تسمح هذه التقنية فقط بقياس تيار البروتون عبر غشاء الميتوكوندريا الداخلي ، ولكن أيضا لدراسة الموصلات الأخرى المهمة لوظيفة الميتوكوندريا ، مثل الكالسيوم أو المستقلبات مثل نيوكليوتيدات الأدينين.ضع الفأر الرحيم على ظهره ورش الكحول لتنظيف الشعر وتبليله. ثم ، قم بعمل شق بطول سنتيمترين على الصدر. بعد الإمساك بالجلد باستخدام ملاقط ، قم بتشريح القلب من صدر الحيوان وشطفه لإزالة كل الدم إلى كوب 10 ملليلتر مع خمسة ملليلترات من محلول العزل البارد.بمجرد تطهير القلب من آثار الدم ، انقله إلى كوب آخر سعة 10 ملليلتر يحتوي على خمسة ملليلتر من عازل العزل البارد وقم بتقطيعه إلى قطع رقيقة. ثم انقله إلى مجانس زجاجي مبرد بالجليد سعة 10 ملليلتر. استخدم أداة تحريك علوية لتجانس الأنسجة المقطوعة مسبقا على الجليد بست ضربات لطيفة بسرعة يتم التحكم فيها تبلغ 275 دورة في الدقيقة.انقل المتجانس إلى أنبوب مخروطي بارد جليدي سعة 15 ملليلتر وقم بطرده مركزيا بسرعة 700 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية لتكسير النوى والخلايا غير المنقطعة. جمع supernatant في أنبوب جديد 15 ملليلتر ووضعه على الجليد. قم بطرد مركزي للغاز الفائق بسرعة 8،500 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية للحصول على حبيبة تحتوي على الميتوكوندريا.أعد تعليق حبيبة الميتوكوندريا في 3.8 ملليلتر من المانيتول العازل مفرط التوتر البارد واحتضن تعليق الميتوكوندريا على الجليد لمدة 10 إلى 15 دقيقة. املأ تعليق مانيتول الميتوكوندريا المفرط التوتر في خلية ضغط صغيرة مبردة من الصحافة الفرنسية. ثم ضع الزنزانة على الصحافة الفرنسية.بعد ذلك ، حدد الوضع المنخفض للضغط الفرنسي وضغط التعليق من خلال خلية الضغط الصغيرة عند 110 على القرص للميتوكوندريا ذات الدهون البنية ، وعند 140 للميتوكوندريا القلبية ، مما يضمن خروج التعليق من خلية الضغط الصغيرة بمعدل قطرة واحدة في الثانية. اجمع القطرات في أنبوب مخروطي مبرد بالثلج سعة 15 ملليلتر. الطرد المركزي التعليق في 10،500 مرات G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.أعد تعليق حبيبات mitoplasts في 0.5 إلى 2 ملليلتر من العازلة لكلوريد البوتاسيوم مفرط التوتر المثلج وتخزين التعليق على الجليد. اسحب خيوط زجاج البورسليكات في يوم التسجيل باستخدام مجتذب ماصة دقيقة ، ووضع برنامج على المجتذب المستخدم لتوليد الماصات بدرجة عالية من القابلية للتكرار. أدخل خيطا زجاجيا واحدا داخل المجتذب واسحبه للحصول على ماصتين متطابقتين تقريبا من خيوط البورسليكات الواحدة.اضبط البرنامج عندما تصبح الماصات غير متناسقة بين دورات السحب بسبب شيخوخة خيوط صندوق التسخين الخاصة بالمسحوب. ضع الماصة داخل ملمع الماصة وضع الطرف بالقرب من الخيوط تحت تكبير 100X لإطلاق النار تلميعها. اضغط على دواسة القدم عدة مرات لتسخين الخيوط دون انسداد أو إتلاف منحنى الطرف.البولندية حتى الماصات لديها مقاومة بين 25 و 35 ميجا أوم يتم الحصول عليها عند ملئها بمحلول ماصة قائم على TMA. ينزلق غطاء ما قبل الحضانة بنسبة 0.1٪ من الجيلاتين لتقليل التصاق mitoplast وشطفه بمحلول حمام كلوريد البوتاسيوم قبل إيداع تعليق mitoplast. قم بإعداد تخفيف خام عن طريق خلط ما يقرب من 35 ميكرولتر من تعليق mitoplast المركز مع 500 ميكرولتر من محلول حمام كلوريد البوتاسيوم ووضعه على زلات الغطاء الموضوعة مسبقا في بئر من صفيحة من أربعة آبار.احتضن على الثلج لمدة 15 إلى 20 دقيقة حتى تنزل الكتل الارتسابية أسفل الغطاء . املأ غرفة الحمام بالكامل بحوالي 50 ميكرولتر من محلول حمام كلوريد البوتاسيوم وانقل زلة غطاء مع mitoplasts داخل الغرفة باستخدام ملاقط تشريح دقيقة رقيقة مع طرف عازم. رتب انزلاق الغطاء في الجزء السفلي من الغرفة دون اختراق الغرفة للحفاظ على استقرار mitoplasts على زلة الغطاء.اختر mitoplast غير لاصق فردي عن طريق مسح انزلاق الغطاء تحت المجهر بهدف 60X. قم بتحميل الماصة بمحلول الماصة وضعها في حامل الماصة. أحضر الماصة إلى محلول الحمام باستخدام جهاز مناور دقيق وحركها فوق mitoplast المحدد مباشرة للاقتراب من IMM.امسك جهد الغشاء عند صفر مللي فولت وطبق نبضات 10 مللي فولت باستخدام أمر اختبار الغشاء في برنامج مكبر الصوت. قم بتطبيق ضغط سلبي طفيف لإنشاء جيجاسيال بسرعة باستخدام IMM. ارفع الماصة مع تثبيت mitoplast لإبعادها عن انزلاق الغطاء لتجنب كسر الختم بسبب انحراف الماصة أثناء التجربة.قم بتعويض السعة الضالة العابرة بأمر اختبار الغشاء في برنامج مكبر الصوت قبل اختبار تكوين mitoplast الكامل للحصول على قياس السعة الصحيح لغشاء mitoplast بعد الاقتحام. قم بتطبيق نبضات الجهد قصيرة المدة مع برنامج مكبر الصوت لتمزيق رقعة الغشاء تحت ماصة الزجاج وتحقيق تكوين mitoplast الكامل. بعد الاقتحام ، قم بتركيب السعة العابرة مع خيار اختبار الغشاء لبرنامج مكبر الصوت لتقييم سعة الغشاء ومقاومة الوصول إليه.مباشرة بعد الاقتحام ، استبدل محلول حمام كلوريد البوتاسيوم بمحلول حمام HEPES عن طريق التروية. قم بتطبيق بروتوكول منحدر 850 مللي ثانية باستخدام برنامج مكبر الصوت. يؤدي تطبيق بروتوكول منحدر الجهد إلى تيار بروتون كبير السعة عبر IMM للدهون البنية دون إضافة الأحماض الدهنية الخارجية ، وهي المنشطات المطلوبة من UCPs.بعد التروية إما عن طريق مثبط UCP1 guanosine diphosphate أو 10-millimolar methyl beta cyclodextrin لاستخراج الأحماض الدهنية الغشائية الداخلية ، يتم استخدام التيار المتبقي لتحديد سعة تيارات UCP1 ، والتي تختفي تماما في IMM من الفئران UCP1 الناقصة. على عكس الدهون البنية ، فإن IMM للأنسجة غير الدهنية ، مثل العضلات الهيكلية والقلب ، لا يطور تيارا بروتونيا قابلا للقياس مباشرة بعد الاقتحام. للحث على تيار بروتون قابل للقياس من خلال AAC ، من الضروري تطبيق محلول حمام HEPES الذي يحتوي على واحد إلى اثنين من الميكرومولار من الأحماض الدهنية الخارجية.للتأكد من أن تيار البروتون المقاس تحمله AAC ، من المهم تطبيق مثبطات محددة ، carboxyatractyloside ، والتي تمنع تماما تقريبا تيار البروتون الموضح في IMM للفئران AAC1-defic. يتم تحقيق تثبيط ثابت ولكن غير كامل لتسرب البروتون إلا عندما يكون ADP موجودا على جانبي الغشاء لتوليد تبادل نيوكليوتيدات نشط عبر AAC. ستؤثر جودة إعداد mitoplast على معدل النجاح في تحقيق تكوين mitoplast الكامل.من الضروري تحسينه. بمجرد تشريح الآلية الجزيئية للتوليد الحراري للميتوكوندريا باستخدام تقنية المشبك الرقعة ، فإن قياس استهلاك أكسجين الميتوكوندريا سيوضح أهمية تيار البروتون والتوليد الحراري في الميتوكوندريا السليمة. تفتح هذه التقنية الطريق أمام الباحثين لاستكشاف جميع أنواع التوصيلات والأيونات والأيضات المهمة لعمل الميتوكوندريا.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

اختبار الحساسية البصرية للسرعة واتجاه الحركة في السحالي

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

الحاسوب خلق المحفزات الحيوان النموذجي

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

أساليب لتصحيح تسجيلات السعة المشبك من كاليكس

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

الضغط تلميع الماصات لتسجيل باتش تحسين المشبك

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

متعدد المعلمة قياس نفاذية المسام افتتاح المرحلة الانتقالية في القلب ماوس متفرقة الميتوكوندريا

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

قناة واحدة الخلية المرفقة تسجيل التصحيح، المشبك

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

تقييم القدرة الإفرازية للخلايا البنكرياس عنيبية

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

عزل الميتوكوندريا من كميات الحد الأدنى من الفأر العضلات الهيكلية للإنتاجية عالية صفيحة ميكروسكوبية الجهاز التنفسي القياسات

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

استخدام<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; التصوير الجامع بالأعضاء والأنسجة الكمي الأنسجة لتحديد بيو توزيع الجزيئات Fluorescently إعتبر

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

عزل خلايا الصمام الخلالي الماوس لدراسة تكلس الصمام الأبهري في المختبر

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) ...