Name: the use of the patch-clamp technique to study the thermogenic capacity of mitochondria
Uploaded: 2021-05-03T15:00:00
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我感谢Yuriy Kirichok博士在他的实验室中参与的伟大科学，并感谢Kirichok实验室的成员进行了有益的讨论。我还要感谢Douglas C. Wallace博士提供 AAC1 敲除小鼠。 资助：A.M.B.由美国心脏协会职业发展奖19CDA34630062支持。

所有进行的动物实验程序都符合美国国立卫生研究院的指导方针，并已获得加州大学洛杉矶分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
注意：线粒体分离程序基于差异离心，并且因组织而异。例如，由于棕色脂肪组织含有极其丰富的脂质，因此在收获线粒体之前，需要额外的步骤才能将细胞碎片和细胞器从脂质相中分离出来。为避免混淆，下面详细介绍了两种线粒体分...

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	<li>Divakaruni, A. S., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+and+physiology+of+mitochondrial+proton+leak.">The regulation and physiology of mitochondrial proton leak.</a> Physiology (Bethesda). 26 (3), 192-205 (2011).</li><li>Chouchani, E. T., Kazak, L., Spiegelman, B. 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该方法文章旨在介绍最近应用于线粒体的膜片钳技术，这是一种通过负责线粒体产热的IMM直接研究H + 泄漏的新方法5，6，7，15。该技术不仅限于组织，还可用于分析不同标准人体和细胞模型（如HAP1，COS7，C2C12和MEF细胞）中IMM的H + 泄漏和其他电导。然而，每个线粒体分离都需要针对每?...

线粒体以细胞的动力而闻名。事实上，它们是化学能ATP的主要来源。鲜为人知的是，线粒体也会产生热量。事实上，每个线粒体不断产生两种类型的能量（ATP和热量），并且两种能量形式之间的良好平衡定义了代谢细胞稳态（图1）。线粒体如何在ATP和热量之间分配能量当然是生物能量学领域最基本的问题，尽管它在很大程度上仍然是未知的。我们确实知道，增加线粒体产热（称为线粒体产热），从而减少ATP的产生会增加能量消耗，这是对抗代谢综合征的最佳方法之一1。
线粒体产热起源于穿过线粒体内膜（IMM）的H + 泄漏，导致底物氧化和ATP合成的解耦，从而产生热量，因此称为“线粒体解耦”1 （图1）。这种H + 泄漏取决于称为解偶联蛋白（UCP）的线粒体转运蛋白。UCP1是第一个被识别的UCP。它仅以产热组织，棕色脂肪和米色脂肪表达，其中线粒体专门用于产热2，3，4。UCP在骨骼肌，心脏和肝脏等非脂肪组织中的身份仍然存在争议。这些组织中的线粒体可使约25%的总线粒体能量转化为热量，这可以显着影响整个身体的生理机能1.除了保持核心体温外，线粒体产热还通过减少卡路里来预防饮食引起的肥胖。此外，它通过线粒体减少活性氧（ROS）的产生，以保护细胞免受氧化损伤1。因此，线粒体产热参与正常衰老，年龄相关的退行性疾病和其他涉及氧化应激的疾病，例如缺血再灌注。因此，线粒体产热是细胞代谢的强大调节剂，对这一基本过程的机制理解将促进治疗策略的发展，以对抗与线粒体功能障碍相关的许多病理。
线粒体呼吸是第一个揭示线粒体产热在细胞代谢中的关键作用的技术，并且仍然是社区中最受欢迎的技术1。该技术基于线粒体电子传递链（ETC）对氧消耗量的测量，当线粒体H +泄漏被激活时，线粒体电子传递链（ETC）会增加。这种技术虽然是工具性的，但不能直接研究IMM1上的线粒体H +泄漏，因此很难精确识别和表征负责它的蛋白质，特别是在非脂肪组织中，与ATP产生相比，热量产生是次要的。最近，应用于线粒体的膜片钳技术的发展，首次直接研究了各种组织中整个IMM的H +泄漏5，6，7。
整个IMM的线粒体膜片钳首先由Kirichok等人以可重复的方式建立。他们描述了2004年使用来自COS-7细胞系8的斜面体首次直接测量线粒体钙单递质细胞（MCU）电流。后来，Kirichok实验室显示来自小鼠9和果蝇组织9的IMM的钙电流。其他实验室现在经常使用这种技术来研究MCU10，11，12，13，14的生物物理特性。对钾和氯化物电导率进行全IMM膜片钳分析也是可能的，并且已经在几篇论文中提到过，但尚未成为出版物6，7，9的主题。2012年报道了对IMM上H +电流的首次测量，来自小鼠棕色脂肪线粒体6，以及2017年小鼠米色脂肪线粒体7。该电流是由于产热组织的特异性解偶联蛋白UCP16，7。2019年发表的最新研究将AAC描述为负责心脏和骨骼肌等非脂肪组织中线粒体H +泄漏的主要蛋白质5。
这种独特的方法现在允许对负责线粒体产热的线粒体离子通道和转运蛋白进行直接的高分辨率功能分析。为了促进该方法的扩展并补充其他研究，例如线粒体呼吸，下面描述了测量UCP1和AAC携带的H + 电流的详细方案。描述了三个重要步骤：1）从小鼠棕色脂肪中分离线粒体以分析UCP1依赖性H + 电流和从心脏中分离线粒体以分析AAC依赖性H + 电流，2）用法国压榨机制备斜面体以机械破裂外线粒体膜（OMM），3）整个IMM上UCP1和AAC依赖性H + 电流的膜片钳记录。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% gelatin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60X water immersion objective, numerical aperture 1.20</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO60XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF150-86-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1550B Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Press</td>
			<td>Glen Mills</td>
			<td>5500-000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inversed Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71 or IX73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Forge</td>
			<td>(Narishige)</td>
			<td>MF-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanupulator MPC-385</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>FG-MPC325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode holder for agar bridge</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH3F4515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>(Sutter Instruments)</td>
			<td>P97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Cell for French Press</td>
			<td>Glen Mills</td>
			<td>5500-FA-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIXER IKA 6-2000RPM</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-50705-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 100X magnification</td>
			<td>Nikon&#160; lens</td>
			<td>MPlan 100/0.80 ELWD 210/0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pClamp 10</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-24E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>358039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75 009 521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table</td>
			<td>Newport</td>
			<td>VIS3036-SG2-325A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-gluconic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>M4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>3777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>60128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>63068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>331635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisBase</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisCl</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of the patch-clamp technique to study the thermogenic capacity of mitochondria

线粒体产热（也称为线粒体解耦）是增加能量消耗以对抗代谢综合征的最有希望的目标之一。产热组织，如棕色和米色脂肪，发展出高度专业化的线粒体用于产热。主要产生ATP的其他组织的线粒体也将高达25%的总线粒体能量产生转化为热量，因此可以对整个身体的生理学产生相当大的影响。线粒体产热不仅对维持体温至关重要，而且可以防止饮食引起的肥胖并减少活性氧（ROS）的产生，以保护细胞免受氧化损伤。由于线粒体产热是细胞代谢的关键调节剂，因此对这一基本过程的机械理解将有助于开发治疗策略，以对抗与线粒体功能障碍相关的许多病理。重要的是，控制线粒体中产热急性激活的精确分子机制定义不清。这种信息的缺乏主要是由于缺乏直接测量解偶联蛋白的方法。最近应用于线粒体的膜片钳方法的发展首次使在线粒体产热起源的现象，通过IMM泄漏H + 以及负责它的线粒体转运蛋白的第一次生物物理表征，解偶蛋白1（UCP1），棕色和米色脂肪的特异性以及所有其他组织的ADP / ATP转运蛋白（AAC）的直接研究。这种独特的方法将为控制H + 泄漏和线粒体产热的机制以及如何靶向对抗代谢综合征提供新的见解。本文描述了应用于线粒体的膜片钳方法，通过直接测量通过IMM的H + 电流来研究其产热能力。

应用于线粒体的膜片钳方法的发展首次直接研究了通过IMM和线粒体转运蛋白UCP1和AAC的H + 泄漏。对UCP1和AAC依赖性H+ 泄漏的电生理学分析可以提供线粒体产热能力的第一眼。结果部分描述了通过UCP1和AAC测量H + 泄漏的标准程序。
与 UCP1 相关的 H+ 电流测量（图 4）6，...

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The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria

该方法文章详细介绍了使用膜片钳技术测量穿过线粒体内膜的H + 泄漏的主要步骤，这是一种研究线粒体产热能力的新方法。

使用膜片钳技术研究线粒体的产热能力

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat ...

该协议描述了如何通过直接测量线粒体内膜上的线粒体质子泄漏来使用膜膜膜的膜闭来研究线粒体的产热能力。直接测量通过线粒体内膜的质子电流有助于识别和精确表征负责线粒体产热的分子机制。该技术不仅可以测量穿过线粒体内膜的质子电流，还可以研究对线粒体功能很重要的其他电导，例如钙或腺嘌呤核苷酸等代谢物。将安乐死的鼠标放在背部并喷洒酒精以清洁和弄湿头发。然后，在胸部做一个两厘米的切口。用镊子抓住皮肤后，从动物胸部切开心脏并冲洗干净，将所有血液除去，放入装有5毫升冷隔离溶液的10毫升烧杯中。一旦心脏清除了血液的痕迹，将其转移到另一个含有五毫升冷隔离缓冲液的10毫升烧杯中，并将其切成薄片。然后，将其转移到冰冷的10毫升玻璃均质机中。使用顶置搅拌器以每分钟275转的受控速度在冰上以六次轻柔的行程将预切组织均质化。将匀浆转移到15毫升冰冷的锥形管中，并在4摄氏度下以700倍G离心10分钟，以沉淀细胞核和未破碎的细胞。将上清液收集在新鲜的15毫升管中，并将其放在冰上。将上清液以8， 500倍G在4摄氏度下离心10分钟，以获得含有线粒体的沉淀。将线粒体沉淀重悬于3.8毫升冰冷的高渗甘露醇缓冲液中，并将线粒体悬浮液在冰上孵育10至15分钟。将线粒体高渗甘露醇悬浮液填充到法国压榨机的冷藏迷你压力池中。然后，将单元格放在法式印刷机上。然后，选择法国压榨机的低模式，并通过微型压力池将悬浮液压缩在棕色脂肪线粒体的刻度盘上110，对于心脏线粒体，在140处压缩悬浮液，确保悬浮液以每秒约一滴的速度从迷你压力池中出来。将滴剂收集在15毫升冰冷的锥形管中。将悬浮液以10， 500倍G在4摄氏度下离心10分钟。将mitoplasts沉淀重悬于0.5至2毫升冰冷的高渗氯化钾缓冲液中，并将悬浮液储存在冰上。在记录当天使用微量移液器拉动硼硅酸盐玻璃丝，在用于生成具有高度再现性的移液器的拉拔器上设置程序。在拉拔器内插入一根玻璃丝并拉动，从一根硼硅酸盐丝中获得几乎两个相同的贴片移液器。当移液器在拉动周期之间由于拉拔器的加热盒灯丝老化而变得不一致时，调整程序。将移液器放在移液器抛光机内，并将吸头放在100X放大倍率下靠近灯丝附近以进行火抛光。按压脚踏板几次以加热灯丝，而不会堵塞或损坏尖端曲线。抛光直到移液器在填充基于TMA的移液器溶液时具有25至35兆欧姆的阻力。用0.1%明胶预孵育覆盖物滑动以减少丝粒体粘附，并在沉积丝胶悬浮液之前用氯化钾浴溶液冲洗它们。通过将约35微升浓缩的mitoplast悬浮液与500微升的氯化钾浴溶液混合来制备原始稀释液，并将其放在先前放置在四孔板孔中的盖玻片上。在冰上孵育15至20分钟，让斜面体沉淀到盖玻片上。用大约50微升的氯化钾浴溶液完全填充浴腔，并使用带有弯曲尖端的薄微解剖镊子在腔内转移带有斜面体的盖玻片。将盖玻片排列在腔室底部而不灌注腔室，以保持膜塑性塑料在盖玻片上的稳定。通过在显微镜下用60X物镜扫描盖玻片来选择单个非粘性丝状体。将移液器溶液装入移液器，并将其放入移液器支架中。使用显微操作器将移液器带入浴槽溶液中，并将其移动到所选的mitoplast的正上方以接近IMM。将膜电位保持在零毫伏，并使用放大器程序中的膜测试命令施加10毫伏脉冲。施加轻微的负压，以使用IMM快速产生千兆级。在连接有丝状塑料的情况下提起移液器，使其远离盖玻片，以避免在实验过程中由于移液器漂移而导致的密封破损。在测试全斜方体配置之前，使用放大器程序中的膜测试命令补偿杂散电容瞬变，以便在磨合后获得正确的电容测量值。使用放大器程序施加短时间电压脉冲，使玻璃移液器下的膜贴片破裂，实现全膜塑料配置。磨合后，将电容瞬变与放大器程序的膜测试选项相匹配，以评估膜电容及其接入电阻。闯入后，立即通过灌注将氯化钾浴溶液替换为HEPES浴溶液。将 850 毫秒斜坡协议应用于放大器程序。电压斜坡协议的应用在棕色脂肪的IMM上诱导大振幅质子电流，而无需添加外源性脂肪酸，这是UCP所需的激活剂。通过UCP1抑制剂鸟苷二磷酸或10毫摩尔甲基β环糊精灌注用于内源性膜脂肪酸提取后，残余电流用于确定UCP1电流的振幅，该电流在UCP1缺陷小鼠的IMM中完全消失。与棕色脂肪不同，非脂肪组织的IMM（如骨骼肌和心脏）在磨合后不会立即产生可测量的质子电流。为了通过AAC诱导可测量的质子电流，必须应用含有一至两微摩尔外源性脂肪酸的HEPES浴溶液。为了确认测得的质子电流由AAC携带，重要的是应用特异性抑制剂羧基亚曲霉苷，其几乎完全抑制AAC1缺陷小鼠的IMM中显示的质子电流。只有当ADP存在于膜的两侧以通过AAC产生活性核苷酸交换时，才能实现对质子泄漏的持续但从未完全的抑制。mitoplast制剂的质量将影响实现全mitlast配置的成功率。优化它至关重要。一旦用膜片钳技术解剖线粒体产热的分子机制，线粒体耗氧量的测量将证明质子电流和产热在完整线粒体中的重要性。这项技术为研究人员探索对线粒体功能重要的各种电导，离子和代谢物开辟了道路。

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科研

生物学

Computer-Generated Animal Model Stimuli

计算机生成的动物模型的刺激

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

膜片钳从花萼电容录音方法

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

改进的膜片钳记录的压力抛光移液器

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

小鼠离体心肌线粒体通透性转换孔开放中的多参数测量。

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

单通道细胞贴附膜片钳记录

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

评估胰腺腺泡细胞的分泌能力

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

从小鼠骨骼肌高通量微孔板呼吸测量最低数量的隔离线粒体

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

指某东西的用途<em&gt;离体</em&gt;全器官成像和定量组织组织学确定荧光标记分子的生物分布

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

小鼠间质瓣细胞分离研究主动脉瓣体外钙化

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) ...