Name: the use of the patch-clamp technique to study the thermogenic capacity of mitochondria
Uploaded: 2021-05-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria at JoVE.com

Jeg takker Dr. Yuriy Kirichok for den store videnskab, jeg var en del af i hans laboratorium og medlemmerne af Kirichok-laboratoriet for de nyttige diskussioner. Jeg takker også Dr. Douglas C. Wallace for at levere AAC1 knockout-mus. Finansiering: A.M.B blev støttet af en American Heart Association Career Development Award 19CDA34630062.

Alle dyreforsøgsprocedurer, der blev udført, er i overensstemmelse med National Institutes of Health-retningslinjerne og blev godkendt af University of California Los Angeles Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
BEMÆRK: Den mitokondrielle isolationsprocedure er baseret på differentiel centrifugering og varierer lidt fra væv til væv. For eksempel, da brunt fedtvæv er ekstremt rig på lipider, kræver det et ekstra trin at adskille celleaffald og organeller fra lipidfasen,...

<ol>
	<li>Divakaruni, A. S., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+and+physiology+of+mitochondrial+proton+leak.">The regulation and physiology of mitochondrial proton leak.</a> Physiology (Bethesda). 26 (3), 192-205 (2011).</li><li>Chouchani, E. T., Kazak, L., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+advances+in+adaptive+thermogenesis:+UCP1+and+beyond.">New advances in adaptive thermogenesis: UCP1 and beyond.</a> Cell Metabolism. 29 (1), 27-37 (2019).</li><li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue:+function+and+physiological+significance.">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).</li><li>Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hunt+for+the+molecular+mechanism+of+brown+fat+thermogenesis.">The hunt for the molecular mechanism of brown fat thermogenesis.</a> Biochimie. 134, 9-18 (2017).</li><li>Bertholet, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H(+)+transport+is+an+integral+function+of+the+mitochondrial+ADP/ATP+carrier.">H(+) transport is an integral function of the mitochondrial ADP/ATP carrier.</a> Nature. 571 (7766), 515-520 (2019).</li><li>Fedorenko, A., Lishko, P. V., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+fatty-acid-dependent+UCP1+uncoupling+in+brown+fat+mitochondria.">Mechanism of fatty-acid-dependent UCP1 uncoupling in brown fat mitochondria.</a> Cell. 151 (2), 400-413 (2012).</li><li>Bertholet, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+patch+clamp+of+beige+adipocytes+reveals+UCP1-positive+and+UCP1-negative+cells+both+exhibiting+futile+creatine+cycling.">Mitochondrial patch clamp of beige adipocytes reveals UCP1-positive and UCP1-negative cells both exhibiting futile creatine cycling.</a> Cell Metabolism. 25 (4), 811-822 (2017).</li><li>Kirichok, Y., Krapivinsky, G., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+calcium+uniporter+is+a+highly+selective+ion+channel.">The mitochondrial calcium uniporter is a highly selective ion channel.</a> Nature. 427 (6972), 360-364 (2004).</li><li>Fieni, F., Lee, S. B., Jan, Y. N., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter+varies+greatly+between+tissues.">Activity of the mitochondrial calcium uniporter varies greatly between tissues.</a> Nature Communications. 3, 1317 (2012).</li><li>Chaudhuri, D., Sancak, Y., Mootha, V. K., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCU+encodes+the+pore+conducting+mitochondrial+calcium+currents.">MCU encodes the pore conducting mitochondrial calcium currents.</a> eLife. 2, 00704 (2013).</li><li>Vais, H., Payne, R., Paudel, U., Li, C., Foskett, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+transmembrane+mechanisms+control+MCU-mediated+mitochondrial+Ca(2+)+uptake.">Coupled transmembrane mechanisms control MCU-mediated mitochondrial Ca(2+) uptake.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21731-21739 (2020).</li><li>Vais, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMRE+is+a+matrix+Ca(2+)+sensor+that+governs+gatekeeping+of+the+mitochondrial+Ca(2+)+uniporter.">EMRE is a matrix Ca(2+) sensor that governs gatekeeping of the mitochondrial Ca(2+) uniporter.</a> Cell Reports. 14 (3), 403-410 (2016).</li><li>Vais, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCUR1,+CCDC90A,+is+a+regulator+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">MCUR1, CCDC90A, is a regulator of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Cell Metabolism. 22 (4), 533-535 (2015).</li><li>Kamer, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MICU1+imparts+the+mitochondrial+uniporter+with+the+ability+to+discriminate+between+Ca(2+)+and+Mn(2+).">MICU1 imparts the mitochondrial uniporter with the ability to discriminate between Ca(2+) and Mn(2+).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 7960-7969 (2018).</li><li>Bertholet, A. M., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+analysis+of+the+mitochondrial+H(+)+leak+in+brown+and+beige+fat.">Patch-clamp analysis of the mitochondrial H(+) leak in brown and beige fat.</a> Frontiers in Physiology. 11, 326 (2020).</li><li>Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization,+identification,+and+excision+of+murine+adipose+depots.">Localization, identification, and excision of murine adipose depots.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52174 (2014).</li><li>Garg, V., Kirichok, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+analysis+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">Patch-clamp analysis of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Methods in Molecular Biology. 1925, 75-86 (2019).</li><li>Decker, G. L., Greenawalt, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+and+biochemical+studies+of+mitoplasts+and+outer+membranes+derived+from+French-pressed+mitochondria.+Advances+in+mitochondrial+subfractionation.">Ultrastructural and biochemical studies of mitoplasts and outer membranes derived from French-pressed mitochondria. Advances in mitochondrial subfractionation.</a> Journal of Ultrastructure Research. 59 (1), 44-56 (1977).</li><li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+electrical+currents+across+the+plasma+membrane+of+mammalian+sperm+cells.">Recording electrical currents across the plasma membrane of mammalian sperm cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), (2021).</li><li>Flaming, D. G., Brown, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropipette+puller+design:+form+of+the+heating+filament+and+effects+of+filament+width+on+tip+length+and+diameter.">Micropipette puller design: form of the heating filament and effects of filament width on tip length and diameter.</a> Journal of Neuroscience Methods. 6 (1-2), 91-102 (1982).</li><li>Klingenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ADP+and+ATP+transport+in+mitochondria+and+its+carrier.">The ADP and ATP transport in mitochondria and its carrier.</a> Biochimica and Biophysica Acta. 1778 (10), 1978-2021 (2008).</li></ol>

Denne metodeartikel har til formål at præsentere patch-clamp-teknikken, der for nylig blev anvendt på mitokondrier, en ny tilgang til direkte at studere H + lækage gennem IMM, der er ansvarlig for mitokondriel termogenese 5,6,7,15. Denne teknik er ikke begrænset til væv og kan også bruges til at analysere H + lækage og andre konduktanser af IMM i forskellige standa...

Mitokondrier er berømte for at være cellens kraftværk. Faktisk er de den største kilde til kemisk energi, ATP. Hvad der er mindre kendt er, at mitokondrier også genererer varme. Faktisk genererer hver mitokondrie konstant de to typer energier (ATP og varme), og en fin balance mellem de to energiformer definerer metabolisk cellehomeostase (figur 1). Hvordan mitokondrier fordeler energi mellem ATP og varme er bestemt det mest grundlæggende spørgsmål inden for bioenergetik, selvom det stadig er stort set ukendt. Vi ved, at øget mitokondriel varmeproduktion (kaldet mitokondriel termogenese) og dermed reduktion af ATP-produktionen øger energiforbruget, og dette er en af de bedste måder at bekæmpe metabolisk syndrom1 på.
Mitokondriel termogenese stammer fra H + lækage over den indre mitokondriemembran (IMM), hvilket fører til afkobling af substratoxidation og ATP-syntese med deraf følgende produktion af varme, deraf navnet "mitokondriel afkobling"1 (figur 1). Denne H + lækage afhænger af mitokondrielle transportører kaldet afkoblingsproteiner (UMP'er). UCP1 var den første UCP, der blev identificeret. Det udtrykkes kun i termogene væv, brunt fedt og beige fedt, hvor mitokondrier er specialiseret til varmeproduktion 2,3,4. Identiteten af UCP i ikke-fedtvæv som skeletmuskulatur, hjerte og lever er forblevet kontroversiel. Mitokondrier i disse væv kan have ca. 25% af den samlede mitokondrielle energi omdannet til varme, hvilket kan påvirke fysiologien i hele kroppen betydeligt1. Udover at opretholde kernekropstemperaturen forhindrer mitokondriel termogenese også diætinduceret fedme ved at reducere kalorierne. Derudover reducerer det produktionen af reaktive iltarter (ROS) af mitokondrier for at beskytte celler mod oxidativ skade1. Mitokondriel termogenese er således involveret i normal aldring, aldersrelaterede degenerative lidelser og andre tilstande, der involverer oxidativ stress, såsom iskæmi-reperfusion. Derfor er mitokondriel termogenese en stærk regulator af cellulær metabolisme, og en mekanistisk forståelse af denne grundlæggende proces vil fremme udviklingen af terapeutiske strategier til bekæmpelse af mange patologier forbundet med mitokondriel dysfunktion.
Mitokondriel respiration var den første teknik til at afsløre den afgørende rolle mitokondriel termogenese i cellulær metabolisme og er stadig den mest populære i samfundet1. Denne teknik er baseret på måling af iltforbrug af mitokondrieelektrontransportkæden (ETC), der stiger, når mitokondriel H + lækage aktiveres. Denne teknik, selvom den er instrumentel, kan ikke direkte studere mitokondriel H + -lækage på tværs af IMM1, hvilket gør den nøjagtige identifikation og karakterisering af de proteiner, der er ansvarlige for den, vanskelig, især i ikke-fedtvæv, hvor varmeproduktionen er sekundær sammenlignet med ATP-produktion. For nylig gav udviklingen af patch-clamp-teknikken anvendt på mitokondrier den første direkte undersøgelse af H + lækage over hele IMM i forskellige væv 5,6,7.
Den mitokondrielle patchklemme af hele IMM blev først etableret på en reproducerbar måde af Kirichok et al.8. De beskrev den første direkte måling af mitokondrie calcium uniporter (MCU) strømme i 2004 ved hjælp af mitoplaster fra COS-7 cellelinjer8. Senere viste Kirichok-laboratoriet calciumstrømme fra IMM'er af mus9 og Drosophila væv9. Andre laboratorier bruger nu rutinemæssigt denne teknik til at studere de biofysiske egenskaber ved MCU 10,11,12,13,14. Hele IMM-plasterklemmeanalyse af kalium- og kloridkonduktans er også mulig og er blevet nævnt i flere artikler, men har endnu ikke været hovedemnet for en publikation 6,7,9. Den første måling af H+-strømme på tværs af IMM blev rapporteret i 2012 fra musebrune fedtmitokondrier6 og fra muse-beige fedtmitokondrier i 20177. Denne strøm skyldes det specifikke afkoblingsprotein af termogene væv, UCP1 6,7. Nyligt arbejde offentliggjort i 2019 karakteriserede AAC som det vigtigste protein, der er ansvarligt for mitokondriel H + -lækage i ikke-fedtvæv som hjerte- og skeletmuskulatur5.
Denne unikke tilgang giver nu mulighed for direkte højopløselig funktionel analyse af mitokondrielle ionkanaler og transportører, der er ansvarlige for mitokondriel termogenese. For at lette udvidelsen af metoden og supplere andre undersøgelser såsom mitokondriel respiration er der beskrevet en detaljeret protokol nedenfor til måling af H + - strømme, der bæres af UCP1 og AAC. Tre vigtige trin er beskrevet: 1) mitokondriel isolering fra musebrunt fedt for at analysere UCP1-afhængig H + -strøm og mitokondriel isolering fra hjertet for at analysere AAC-afhængig H + -strøm, 2) forberedelse af mitoplaster med en fransk presse til mekanisk brud på den ydre mitokondriemembran (OMM), 3) patch-clamp optagelser af UCP1 og AAC-afhængige H + strømme på tværs af hele IMM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% gelatin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60X water immersion objective, numerical aperture 1.20</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO60XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF150-86-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1550B Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Press</td>
			<td>Glen Mills</td>
			<td>5500-000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inversed Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71 or IX73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Forge</td>
			<td>(Narishige)</td>
			<td>MF-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanupulator MPC-385</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>FG-MPC325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode holder for agar bridge</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH3F4515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>(Sutter Instruments)</td>
			<td>P97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Cell for French Press</td>
			<td>Glen Mills</td>
			<td>5500-FA-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIXER IKA 6-2000RPM</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-50705-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 100X magnification</td>
			<td>Nikon&#160; lens</td>
			<td>MPlan 100/0.80 ELWD 210/0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pClamp 10</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-24E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>358039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75 009 521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table</td>
			<td>Newport</td>
			<td>VIS3036-SG2-325A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-gluconic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>M4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>3777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>60128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>63068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>331635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisBase</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisCl</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of the patch-clamp technique to study the thermogenic capacity of mitochondria

Mitokondriel termogenese (også kendt som mitokondriel afkobling) er et af de mest lovende mål for at øge energiforbruget til bekæmpelse af metabolisk syndrom. Termogene væv som brune og beige fedtstoffer udvikler højt specialiserede mitokondrier til varmeproduktion. Mitokondrier af andre væv, der primært producerer ATP, omdanner også op til 25% af den samlede mitokondrielle energiproduktion til varme og kan derfor have en betydelig indvirkning på hele kroppens fysiologi. Mitokondriel termogenese er ikke kun afgørende for at opretholde kropstemperaturen, men forhindrer også diætinduceret fedme og reducerer produktionen af reaktive iltarter (ROS) for at beskytte celler mod oxidativ skade. Da mitokondriel termogenese er en vigtig regulator for cellulær metabolisme, vil en mekanistisk forståelse af denne grundlæggende proces hjælpe med udviklingen af terapeutiske strategier til bekæmpelse af mange patologier forbundet med mitokondriel dysfunktion. Det er vigtigt, at de præcise molekylære mekanismer, der styrer akut aktivering af termogenese i mitokondrier, er dårligt defineret. Denne mangel på information skyldes i høj grad mangel på metoder til direkte måling af afkoblingsproteiner. Den nylige udvikling af patch-clamp-metoden anvendt på mitokondrier muliggjorde for første gang den direkte undersøgelse af fænomenet ved oprindelsen af mitokondriel termogenese, H + lækage gennem IMM og den første biofysiske karakterisering af mitokondrielle transportører, der er ansvarlige for det, afkoblingsproteinet 1 (UCP1), der er specifikt for brune og beige fedtstoffer, og ADP / ATP-transportøren (AAC) for alle andre væv. Denne unikke tilgang vil give ny indsigt i de mekanismer, der styrer H + lækage og mitokondriel termogenese, og hvordan de kan målrettes til bekæmpelse af metabolisk syndrom. Dette papir beskriver den patch-clamp-metode, der anvendes på mitokondrier til at studere deres termogene kapacitet ved direkte at måle H + -strømme gennem IMM.

Udviklingen af patch-clamp-metoden anvendt på mitokondrier gav den første direkte undersøgelse af H + - lækage gennem IMM og mitokondrietransportørerne, UCP1 og AAC, som er ansvarlige for den. Den elektrofysiologiske analyse af UCP1- og AAC-afhængige H + lækager kan give et første blik på mitokondriernes termogene kapacitet. Resultatafsnittet beskriver standardprocedurerne til måling af H + lækage via UCP1 og AAC.
UCP1-afhængig H+-</sup...

Watch this Scientific Journal Video about The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria at JoVE.com

The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria

Denne metodeartikel beskriver de vigtigste trin i måling af H + lækage over den indre mitokondriemembran med patch-clamp teknikken, en ny tilgang til at studere mitokondriernes termogene kapacitet.

Anvendelsen af plasterklemmeteknikken til at studere mitokondriernes termogene kapacitet

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat ...

Denne protokol beskriver, hvordan plasterklemmeteknikken kan bruges til at studere mitokondriernes termogene kapacitet ved direkte at måle mitokondrieprotonlækage over den indre mitokondriemembran. Den direkte måling af protonstrømmen gennem den indre mitokondriemembran hjælper med at identificere og præcist karakterisere de molekylære mekanismer, der er ansvarlige for mitokondriel termogenese. Denne teknik tillader ikke kun at måle protonstrømmen over den indre mitokondriemembran, men også at studere andre konduktanser, der er vigtige for mitokondriefunktionen, såsom calcium eller metabolitter som adeninnukleotider.Placer den aflivede mus på ryggen og spray alkohol for at rense og våde håret. Lav derefter et snit på to centimeter på brystkassen. Efter at have grebet huden med pincet, skal du dissekere hjertet fra dyrets bryst og skylle det for at fjerne alt blodet i et 10 ml bægerglas med fem ml koldisoleringsopløsning.Når hjertet er blevet ryddet for spor af blod, overføres det til et andet 10 ml bægerglas indeholdende fem milliliter koldisoleringsbuffer og hugges op i tynde stykker. Overfør det derefter til en iskølet 10 ml glashomogenisator. Brug en overliggende omrører til at homogenisere det forskårne væv på is med seks blide slag med en kontrolleret hastighed på 275 rotationer pr. Minut.Overfør homogenatet til et 15 milliliter iskoldt konisk rør og centrifuger det ved 700 gange G i 10 minutter ved fire grader Celsius for at pelletere kernerne og ubrudte celler. Saml supernatanten i et frisk 15 ml rør og læg det på is. Centrifugering af supernatanten ved 8.500 gange G i 10 minutter ved fire grader Celsius for at opnå en pellet indeholdende mitokondrierne.Resuspend den mitokondrielle pellet i 3,8 ml iskold hypertonisk mannitolbuffer og inkuber mitokondrieophænget på is i 10 til 15 minutter. Fyld den mitokondrielle hypertoniske mannitolsuspension i en nedkølet minitrykcelle fra stempelkanden. Placer derefter cellen på stempelkansen.Vælg derefter stempelkandens lave tilstand og komprimer suspensionen gennem minitrykcellen ved 110 på urskiven til de brune fedtmitokondrier og ved 140 for hjertemitokondrierne, hvilket sikrer, at suspensionen kommer ud af minitrykcellen med en hastighed på ca. et fald pr. Sekund. Saml dråberne i et 15 ml iskølet konisk rør. Centrifugering suspensionen ved 10.500 gange G i 10 minutter ved fire grader Celsius.Resuspend mitoplasts pellet i 0,5 til 2 ml iskold hypertonisk kaliumchlorid buffer og opbevar suspensionen på is. Træk borosilikatglasfilamenterne på optagelsesdagen ved hjælp af en mikropipettetrækker, og sæt et program på aftrækkeren, der bruges til at generere pipetter med en høj grad af reproducerbarhed. Indsæt et glasfilament i aftrækkeren, og træk for at opnå næsten to identiske patchpipetter fra et borosilikatfilament.Juster programmet, når pipetter bliver inkonsekvente mellem trækcyklusser på grund af ældning af aftrækkerens varmeboksfilament. Placer pipetten inde i pipettepoleren, og placer spidsen nær glødetråden under 100X forstørrelse for at affyre polering af den. Tryk på fodpedalen flere gange for at opvarme glødetråden uden at tilstoppe eller beskadige spidskurven.Polsk, indtil pipetterne har en modstand mellem 25 og 35 megaokommer, opnås, når de fyldes med TMA-baseret pipetteopløsning. Forinkubationsdæksel glider med 0,1% gelatine for at reducere mitoplastadhæsionen og skyl dem med kaliumchloridbadopløsningen, inden mitoplastsuspensionen deponeres. Der forberedes en rå fortynding ved at blande ca. 35 mikroliter af den koncentrerede mitoplastsuspension med 500 mikroliter kaliumchloridbadopløsningen og anbringes på de dæksedler, der tidligere er anbragt i en brønd med fire brønde.Inkuber på is i 15 til 20 minutter for mitoplaster at sedimentere ned i dækslet. Fyld badekammeret helt med ca. 50 mikroliter kaliumchloridbadopløsningen og overfør en dækseddel med mitoplaster i kammeret ved hjælp af tynd mikrodissektionspincet med en bøjet spids. Arranger dækslet i bunden af kammeret uden at perfusere kammeret for at holde mitoplasterne stabile på dækslet.Vælg en individuel ikke-klæbende mitoplast ved at scanne dækslet under mikroskopet med et 60X mål. Læg pipetten med pipetteopløsningen, og læg den i pipetteholderen. Bring pipetten ind i badeopløsningen med en mikromanipulator, og flyt den lige over den valgte mitoplast for at komme tæt på IMM.Hold membranpotentialet ved nul millivolt, og påfør 10 millivolt impulser ved hjælp af membrantestkommandoen i forstærkerprogrammet. Påfør et let undertryk for hurtigt at skabe en gigaseal med IMM. Løft pipetten med mitoplasten fastgjort for at holde dem væk fra dækslet for at undgå tætningsbrud på grund af pipettedrift under forsøget.Kompenser de omstrejfende kapacitanstransienter med membrantestkommandoen i forstærkerprogrammet, før du tester hele mitoplastkonfigurationen for at opnå en korrekt kapacitansmåling for mitoplastmembranen efter indbruddet. Påfør kortvarige spændingsimpulser med forstærkerprogrammet for at sprænge membranplasteret under glaspipetten og opnå hele mitoplastkonfigurationen. Efter indbruddet skal du montere kapacitanstransienterne med forstærkerprogrammets membrantestmulighed for at vurdere membrankaacitansen og dens adgangsmodstand.Umiddelbart efter indbruddet udskiftes kaliumchloridbadopløsningen med en HEPES-badeopløsning via perfusion. Anvend en rampeprotokol på 850 millisekunder med forstærkerprogrammet. Anvendelse af spændingsrampeprotokollen inducerer en protonstrøm med stor amplitude over IMM af brunt fedt uden tilsætning af eksogene fedtsyrer, de krævede aktivatorer af UMP'er.Efter perfusion af enten UCP1-hæmmer guanosindiphosphat eller 10 millimolær methyl beta cyclodextrin til endogen membranfedtsyreekstraktion anvendes reststrømmen til at bestemme amplituden af UCP1-strømmene, som forsvinder fuldstændigt i IMM af UCP1-mangelfulde mus. I modsætning til brunt fedt udvikler IMM af ikke-fedtvæv, såsom skeletmuskulatur og hjerte, ikke en målbar protonstrøm umiddelbart efter indbruddet. For at inducere en målbar protonstrøm gennem AAC er det vigtigt at anvende HEPES-badeopløsningen indeholdende en til to mikromolær af eksogene fedtsyrer.For at bekræfte, at den målte protonstrøm bæres af AAC, er det vigtigt at anvende specifikke hæmmere, carboxyatractylosid, som næsten fuldstændigt hæmmer protonstrøm vist i IMM for AAC1-mangelfulde mus. En konstant, men aldrig fuldstændig hæmning af protonlækage opnås kun, når ADP er til stede på begge sider af membranen for at generere en aktiv nukleotidudveksling via AAC. Kvaliteten af mitoplastpræparatet vil påvirke succesraten for at opnå hele mitoplastkonfigurationen.Det er vigtigt at optimere det. Når den molekylære mekanisme for mitokondriel termogenese er dissekeret med plasterklemmeteknikken, vil måling af mitokondrie-iltforbrug demonstrere betydningen af protonstrøm og termogenese i intakte mitokondrier. Denne teknik åbner vejen for forskere til at udforske alle former for konduktanser, ioner og metabolitter, der er vigtige for mitokondriernes funktion.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

Multi-parameter Måling af permeabilitetsovergang pore åbning i isolerede Mouse Heart Mitokondrier

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Én-kanals Cell-attached Patch-clamp optagelse

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

Vurdering af Sekretorisk Kapacitet bugspytkirtlen acinusceller

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Isolering af mitokondrier fra minimale mængder af Mouse Skeletmuskel for High Throughput Microplate Respiratory Målinger

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Brugen af<em&gt; Ex vivo</em&gt; Hele-orgel Imaging og kvantitativ Tissue Histologi at Bestem Bio-distribution af fluorescens-mærkede molekyler

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Isolering af mus interstitielle ventilceller til undersøgelse af forkalkning af aortaklappen In Vitro

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) ...