Name: the use of the patch-clamp technique to study the thermogenic capacity of mitochondria
Uploaded: 2021-05-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria at JoVE.com

Ik dank Dr. Yuriy Kirichok voor de grote wetenschap waar ik deel van uitmaakte in zijn lab en de leden van het Kirichok lab voor de nuttige discussies. Ik dank ook Dr. Douglas C. Wallace voor het verstrekken van AAC1 knock-out muizen. Financiering: A.M.B werd ondersteund door een American Heart Association Career Development Award 19CDA34630062.

Alle dierexperimentele procedures die werden uitgevoerd, voldoen aan de richtlijnen van de National Institutes of Health en zijn goedgekeurd door de University of California Los Angeles Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
OPMERKING: De mitochondriale isolatieprocedure is gebaseerd op differentiële centrifugatie en varieert enigszins van weefsel tot weefsel. Omdat bruin vetweefsel bijvoorbeeld extreem rijk is aan lipiden, vereist het een extra stap om celresten en organellen v...

<ol>
	<li>Divakaruni, A. S., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+and+physiology+of+mitochondrial+proton+leak.">The regulation and physiology of mitochondrial proton leak.</a> Physiology (Bethesda). 26 (3), 192-205 (2011).</li><li>Chouchani, E. T., Kazak, L., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+advances+in+adaptive+thermogenesis:+UCP1+and+beyond.">New advances in adaptive thermogenesis: UCP1 and beyond.</a> Cell Metabolism. 29 (1), 27-37 (2019).</li><li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue:+function+and+physiological+significance.">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).</li><li>Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hunt+for+the+molecular+mechanism+of+brown+fat+thermogenesis.">The hunt for the molecular mechanism of brown fat thermogenesis.</a> Biochimie. 134, 9-18 (2017).</li><li>Bertholet, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H(+)+transport+is+an+integral+function+of+the+mitochondrial+ADP/ATP+carrier.">H(+) transport is an integral function of the mitochondrial ADP/ATP carrier.</a> Nature. 571 (7766), 515-520 (2019).</li><li>Fedorenko, A., Lishko, P. V., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+fatty-acid-dependent+UCP1+uncoupling+in+brown+fat+mitochondria.">Mechanism of fatty-acid-dependent UCP1 uncoupling in brown fat mitochondria.</a> Cell. 151 (2), 400-413 (2012).</li><li>Bertholet, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+patch+clamp+of+beige+adipocytes+reveals+UCP1-positive+and+UCP1-negative+cells+both+exhibiting+futile+creatine+cycling.">Mitochondrial patch clamp of beige adipocytes reveals UCP1-positive and UCP1-negative cells both exhibiting futile creatine cycling.</a> Cell Metabolism. 25 (4), 811-822 (2017).</li><li>Kirichok, Y., Krapivinsky, G., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+calcium+uniporter+is+a+highly+selective+ion+channel.">The mitochondrial calcium uniporter is a highly selective ion channel.</a> Nature. 427 (6972), 360-364 (2004).</li><li>Fieni, F., Lee, S. B., Jan, Y. N., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter+varies+greatly+between+tissues.">Activity of the mitochondrial calcium uniporter varies greatly between tissues.</a> Nature Communications. 3, 1317 (2012).</li><li>Chaudhuri, D., Sancak, Y., Mootha, V. K., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCU+encodes+the+pore+conducting+mitochondrial+calcium+currents.">MCU encodes the pore conducting mitochondrial calcium currents.</a> eLife. 2, 00704 (2013).</li><li>Vais, H., Payne, R., Paudel, U., Li, C., Foskett, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+transmembrane+mechanisms+control+MCU-mediated+mitochondrial+Ca(2+)+uptake.">Coupled transmembrane mechanisms control MCU-mediated mitochondrial Ca(2+) uptake.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21731-21739 (2020).</li><li>Vais, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMRE+is+a+matrix+Ca(2+)+sensor+that+governs+gatekeeping+of+the+mitochondrial+Ca(2+)+uniporter.">EMRE is a matrix Ca(2+) sensor that governs gatekeeping of the mitochondrial Ca(2+) uniporter.</a> Cell Reports. 14 (3), 403-410 (2016).</li><li>Vais, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCUR1,+CCDC90A,+is+a+regulator+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">MCUR1, CCDC90A, is a regulator of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Cell Metabolism. 22 (4), 533-535 (2015).</li><li>Kamer, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MICU1+imparts+the+mitochondrial+uniporter+with+the+ability+to+discriminate+between+Ca(2+)+and+Mn(2+).">MICU1 imparts the mitochondrial uniporter with the ability to discriminate between Ca(2+) and Mn(2+).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 7960-7969 (2018).</li><li>Bertholet, A. M., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+analysis+of+the+mitochondrial+H(+)+leak+in+brown+and+beige+fat.">Patch-clamp analysis of the mitochondrial H(+) leak in brown and beige fat.</a> Frontiers in Physiology. 11, 326 (2020).</li><li>Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization,+identification,+and+excision+of+murine+adipose+depots.">Localization, identification, and excision of murine adipose depots.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52174 (2014).</li><li>Garg, V., Kirichok, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+analysis+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">Patch-clamp analysis of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Methods in Molecular Biology. 1925, 75-86 (2019).</li><li>Decker, G. L., Greenawalt, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+and+biochemical+studies+of+mitoplasts+and+outer+membranes+derived+from+French-pressed+mitochondria.+Advances+in+mitochondrial+subfractionation.">Ultrastructural and biochemical studies of mitoplasts and outer membranes derived from French-pressed mitochondria. Advances in mitochondrial subfractionation.</a> Journal of Ultrastructure Research. 59 (1), 44-56 (1977).</li><li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+electrical+currents+across+the+plasma+membrane+of+mammalian+sperm+cells.">Recording electrical currents across the plasma membrane of mammalian sperm cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), (2021).</li><li>Flaming, D. G., Brown, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropipette+puller+design:+form+of+the+heating+filament+and+effects+of+filament+width+on+tip+length+and+diameter.">Micropipette puller design: form of the heating filament and effects of filament width on tip length and diameter.</a> Journal of Neuroscience Methods. 6 (1-2), 91-102 (1982).</li><li>Klingenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ADP+and+ATP+transport+in+mitochondria+and+its+carrier.">The ADP and ATP transport in mitochondria and its carrier.</a> Biochimica and Biophysica Acta. 1778 (10), 1978-2021 (2008).</li></ol>

Dit methodeartikel heeft tot doel de patch-clamp-techniek te presenteren die onlangs is toegepast op mitochondriën, een nieuwe benadering om H + -lek rechtstreeks te bestuderen via de IMM die verantwoordelijk is voor mitochondriale thermogenese 5,6,7,15. Deze techniek is niet beperkt tot weefsels en kan ook worden gebruikt om H + -lekken en andere geleidingen van de IMM t...

Mitochondriën staan bekend als de krachtpatser van de cel. Inderdaad, ze zijn de belangrijkste bron van chemische energie, ATP. Wat minder bekend is, is dat mitochondriën ook warmte genereren. In feite genereert elk mitochondrion constant de twee soorten energieën (ATP en warmte) en een fijne balans tussen de twee energievormen definieert metabole celhomeostase (figuur 1). Hoe mitochondriën energie verdelen tussen ATP en warmte is zeker de meest fundamentele vraag op het gebied van bio-energetica, hoewel het nog grotendeels onbekend is. We weten wel dat het verhogen van de mitochondriale warmteproductie (mitochondriale thermogenese genoemd) en bijgevolg het verminderen van de ATP-productie het energieverbruik verhoogt en dit is een van de beste manieren om het metabool syndroom te bestrijden1.
Mitochondriale thermogenese is afkomstig van H+ lek over het binnenste mitochondriale membraan (IMM), wat leidt tot ontkoppeling van substraatoxidatie en ATP-synthese met daaruit voortvloeiende productie van warmte, vandaar de naam "mitochondriale ontkoppeling"1 (figuur 1). Dit H+ lek is afhankelijk van mitochondriale transporters die ontkoppelende eiwitten (UCP's) worden genoemd. UCP1 was het eerste UCP dat werd geïdentificeerd. Het wordt alleen uitgedrukt in thermogene weefsels, bruin vet en beige vet waarin mitochondriën gespecialiseerd zijn voor warmteproductie 2,3,4. De identiteit van UCP in niet-vetweefsels zoals skeletspieren, hart en lever is controversieel gebleven. Mitochondriën in deze weefsels kunnen ongeveer 25% van de totale mitochondriale energie omzetten in warmte, wat de fysiologie van het hele lichaam aanzienlijk kan beïnvloeden1. Naast het handhaven van de kerntemperatuur van het lichaam, voorkomt mitochondriale thermogenese ook door voeding veroorzaakte obesitas door calorieën te verminderen. Bovendien vermindert het de productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) door mitochondriën om cellen te beschermen tegen oxidatieve schade1. Mitochondriale thermogenese is dus betrokken bij normale veroudering, leeftijdsgebonden degeneratieve aandoeningen en andere aandoeningen met oxidatieve stress, zoals ischemie-reperfusie. Daarom is mitochondriale thermogenese een krachtige regulator van cellulair metabolisme, en een mechanistisch begrip van dit fundamentele proces zal de ontwikkeling van therapeutische strategieën bevorderen om vele pathologieën geassocieerd met mitochondriale disfunctie te bestrijden.
Mitochondriale ademhaling was de eerste techniek die de cruciale rol van mitochondriale thermogenese in het cellulaire metabolisme onthulde en is nog steeds de meest populaire in de gemeenschap1. Deze techniek is gebaseerd op het meten van het zuurstofverbruik door de mitochondriale elektronentransportketen (ETC) die toeneemt wanneer mitochondriaal H+ lek wordt geactiveerd. Deze techniek, hoewel instrumenteel, kan mitochondriaal H + -lek over de IMM1 niet rechtstreeks bestuderen, waardoor de precieze identificatie en karakterisering van de eiwitten die ervoor verantwoordelijk zijn moeilijk wordt, met name in niet-vetweefsels waarin warmteproductie secundair is in vergelijking met ATP-productie. Onlangs leverde de ontwikkeling van de patch-clamp-techniek toegepast op mitochondriën de eerste directe studie van H + -lek over het hele IMM in verschillende weefsels 5,6,7.
De mitochondriale patch-clamp van de hele IMM werd voor het eerst op een reproduceerbare manier vastgesteld door Kirichok et al.8. Ze beschreven de eerste directe meting van mitochondriale calcium uniporter (MCU) stromen in 2004 met behulp van mitoplasten uit COS-7 cellijnen8. Later toonde het Kirichok-lab calciumstromen van IMMS van muis9- en Drosophila-weefsels 9. Andere laboratoria gebruiken deze techniek nu routinematig om de biofysische eigenschappen van MCU 10,11,12,13,14 te bestuderen. Hele IMM patch-clamp analyse van kalium- en chloridegeleiding is ook mogelijk en is genoemd in verschillende artikelen, maar is nog niet het hoofdonderwerp geweest van een publicatie 6,7,9. De eerste meting van H + -stromen over de IMM werd gerapporteerd in 2012 van muisbruine vet mitochondriën6 en van muisbeige vet mitochondriën in 20177. Deze stroom is te wijten aan het specifieke ontkoppelingseiwit van thermogene weefsels, UCP1 6,7. Recent werk gepubliceerd in 2019 karakteriseerde OC als het belangrijkste eiwit dat verantwoordelijk is voor mitochondriaal H + -lek in niet-vetweefsels zoals het hart en de skeletspieren5.
Deze unieke aanpak maakt nu de directe hoge-resolutie functionele analyse mogelijk van de mitochondriale ionkanalen en transporters die verantwoordelijk zijn voor mitochondriale thermogenese. Om de uitbreiding van de methode te vergemakkelijken en andere studies zoals mitochondriale ademhaling aan te vullen, wordt hieronder een gedetailleerd protocol beschreven voor het meten van de H + -stromen die door UCP1 en AAC worden gedragen. Drie belangrijke stappen worden beschreven: 1) mitochondriale isolatie van muisbruin vet om UCP1-afhankelijke H + -stroom en mitochondriale isolatie van het hart te analyseren om AAC-afhankelijke H + -stroom te analyseren, 2) voorbereiding van mitoplasten met een Franse pers voor mechanische breuk van het buitenste mitochondriale membraan (OMM), 3) patch-clamp-opnames van UCP1- en AAC-afhankelijke H + -stromen over de hele IMM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% gelatin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60X water immersion objective, numerical aperture 1.20</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO60XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF150-86-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1550B Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Press</td>
			<td>Glen Mills</td>
			<td>5500-000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inversed Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71 or IX73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Forge</td>
			<td>(Narishige)</td>
			<td>MF-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanupulator MPC-385</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>FG-MPC325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode holder for agar bridge</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH3F4515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>(Sutter Instruments)</td>
			<td>P97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Cell for French Press</td>
			<td>Glen Mills</td>
			<td>5500-FA-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIXER IKA 6-2000RPM</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-50705-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 100X magnification</td>
			<td>Nikon&#160; lens</td>
			<td>MPlan 100/0.80 ELWD 210/0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pClamp 10</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-24E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>358039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75 009 521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table</td>
			<td>Newport</td>
			<td>VIS3036-SG2-325A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-gluconic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>M4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>3777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>60128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>63068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>331635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisBase</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisCl</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of the patch-clamp technique to study the thermogenic capacity of mitochondria

Mitochondriale thermogenese (ook bekend als mitochondriale ontkoppeling) is een van de meest veelbelovende doelen voor het verhogen van het energieverbruik om het metabool syndroom te bestrijden. Thermogene weefsels zoals bruine en beige vetten ontwikkelen zeer gespecialiseerde mitochondriën voor warmteproductie. Mitochondriën van andere weefsels, die voornamelijk ATP produceren, zetten ook tot 25% van de totale mitochondriale energieproductie om in warmte en kunnen daarom een aanzienlijke invloed hebben op de fysiologie van het hele lichaam. Mitochondriale thermogenese is niet alleen essentieel voor het handhaven van de lichaamstemperatuur, maar voorkomt ook door voeding veroorzaakte obesitas en vermindert de productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) om cellen te beschermen tegen oxidatieve schade. Aangezien mitochondriale thermogenese een belangrijke regulator is van het cellulaire metabolisme, zal een mechanistisch begrip van dit fundamentele proces helpen bij de ontwikkeling van therapeutische strategieën om vele pathologieën geassocieerd met mitochondriale disfunctie te bestrijden. Belangrijk is dat de precieze moleculaire mechanismen die acute activering van thermogenese in mitochondriën regelen, slecht gedefinieerd zijn. Dit gebrek aan informatie is grotendeels te wijten aan een gebrek aan methoden voor de directe meting van ontkoppelende eiwitten. De recente ontwikkeling van patch-clamp methodologie toegepast op mitochondriën maakte voor het eerst de directe studie mogelijk van het fenomeen aan de oorsprong van mitochondriale thermogenese, H + lek door de IMM, en de eerste biofysische karakterisering van mitochondriale transporters die ervoor verantwoordelijk zijn, het ontkoppelende eiwit 1 (UCP1), specifiek van bruine en beige vetten, en de ADP / ATP-transporter (AAC) voor alle andere weefsels. Deze unieke aanpak zal nieuwe inzichten bieden in de mechanismen die H + -lekkage en mitochondriale thermogenese beheersen en hoe ze kunnen worden gericht op het bestrijden van het metabool syndroom. Dit artikel beschrijft de patch-clamp-methodologie die wordt toegepast op mitochondriën om hun thermogene capaciteit te bestuderen door H + - stromen rechtstreeks te meten via de IMM.

De ontwikkeling van de patch-clamp methodologie toegepast op mitochondriën leverde de eerste directe studie van H + lek door de IMM en de mitochondriale transporters, UCP1 en AAC, die ervoor verantwoordelijk zijn. De elektrofysiologische analyse van UCP1- en AAC-afhankelijke H+ -lekken kan een eerste blik werpen op de thermogene capaciteit van mitochondriën. De resultatensectie beschrijft de standaardprocedures voor het meten van H+ lekken via UCP1 en AAC.
<s...

Watch this Scientific Journal Video about The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria at JoVE.com

The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria

Dit methodeartikel beschrijft de belangrijkste stappen in het meten van H + -lek over het binnenste mitochondriale membraan met de patch-clamp-techniek, een nieuwe benadering om de thermogene capaciteit van mitochondriën te bestuderen.

Het gebruik van de patch-clamp-techniek om de thermogene capaciteit van mitochondriën te bestuderen

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat ...

Dit protocol beschrijft hoe de patchklemtechniek kan worden gebruikt om de thermogene capaciteit van mitochondriën te bestuderen door mitochondriaal protonlek direct te meten over het binnenste mitochondriale membraan. De directe meting van de protonstroom door het binnenste mitochondriale membraan helpt bij het identificeren en nauwkeurig karakteriseren van de moleculaire mechanismen die verantwoordelijk zijn voor mitochondriale thermogenese. Deze techniek maakt het niet alleen mogelijk om de protonstroom over het binnenste mitochondriale membraan te meten, maar ook om andere geleidingen te bestuderen die belangrijk zijn voor de mitochondriale functie, zoals calcium of metabolieten zoals adeninenucleotiden.Plaats de geëuthanaseerde muis op zijn rug en spuit alcohol om het haar schoon te maken en nat te maken. Maak vervolgens een incisie van twee centimeter op de thorax. Nadat u de huid met een pincet hebt vastgepakt, ontleedt u het hart uit de borst van het dier en spoelt u het om al het bloed in een bekerglas van 10 milliliter te verwijderen met vijf milliliter koude isolatieoplossing.Zodra het hart is ontdaan van bloedsporen, breng het over naar een ander bekerglas van 10 milliliter met vijf milliliter koude isolatiebuffer en hak het in dunne stukjes. Breng het vervolgens over in een ijsgekoelde glazen homogenisator van 10 milliliter. Gebruik een bovengrondse roerder om het voorgesneden weefsel op ijs te homogeniseren met zes zachte slagen met een gecontroleerde snelheid van 275 rotaties per minuut.Breng het homogenaat over in een ijskoude conische buis van 15 milliliter en centrifugeer het gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius op 700 maal G om de kernen en ongebroken cellen te pelleteren. Verzamel het supernatant in een verse buis van 15 milliliter en leg het op ijs. Centrifugeer het supernatant op 8, 500 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius om een pellet te verkrijgen die de mitochondriën bevat.Resuspend de mitochondriale pellet in 3,8 milliliter ijskoude hypertone mannitolbuffer en incubeer de mitochondriale suspensie op ijs gedurende 10 tot 15 minuten. Vul de mitochondriale hypertone mannitolsuspensie in een gekoelde minidrukcel van de Franse pers. Plaats vervolgens de cel op de Franse pers.Selecteer vervolgens de lage modus van de Franse pers en comprimeer de suspensie door de minidrukcel op 110 op de wijzerplaat voor de bruinvette mitochondriën en op 140 voor de hart mitochondriën, zodat de suspensie uit de minidrukcel komt met een snelheid van ongeveer één druppel per seconde. Verzamel de druppels in een 15-milliliter ijsgekoelde conische buis. Centrifugeer de suspensie op 10, 500 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.Resuspend de mitoplastenkorrel in 0,5 tot 2 milliliter ijskoude hypertone kaliumchloridebuffer en sla de suspensie op ijs op. Trek de filamenten van borosilicaatglas op de dag van opname met behulp van een micropipette-trekker en stel een programma in op de trekker die wordt gebruikt voor het genereren van pipetten met een hoge mate van reproduceerbaarheid. Plaats een glazen gloeidraad in de trekker en trek om bijna twee identieke patchpipeten uit één borosilicaatfilament te verkrijgen.Pas het programma aan wanneer pipetten inconsistent worden tussen trekcycli als gevolg van veroudering van de gloeidraad van de verwarmingsdoos van de trekker. Plaats de pipet in de pipetpolijstmachine en plaats de punt in de buurt van de gloeidraad onder 100X vergroting om deze schoon te polijsten. Druk meerdere keren op het voetpedaal om de gloeidraad te verwarmen zonder de tipcurve te verstoppen of te beschadigen.Polijsten totdat de pipetten een weerstand tussen 25 en 35 megaohms hebben, worden verkregen wanneer ze worden gevuld met een pipetoplossing op basis van TMA. Pre-incubeer afdekslipjes met 0,1% gelatine om de adhesie van mitoplast te verminderen en spoel ze af met de kaliumchloride badoplossing voordat de mitoplast-suspensie wordt afgezet. Bereid een ruwe verdunning door ongeveer 35 microliter van de geconcentreerde mitoplastsuspensie te mengen met 500 microliter van de kaliumchloridebadoplossing en plaats deze op de afdekslipjes die eerder in een put van een vier-putplaat zijn geplaatst.Incubeer op ijs gedurende 15 tot 20 minuten voor mitoplasten om langs de afdekslip te bezinken. Vul de badkamer volledig met ongeveer 50 microliter van de kaliumchloride badoplossing en breng een afdekslip met mitoplasten in de kamer over met een dun microdissectiepincet met een gebogen punt. Plaats de afdekslip aan de onderkant van de kamer zonder de kamer te perfuseren om de mitoplasten stabiel op de afdekslip te houden.Kies een individuele niet-klevende mitoplast door de afdekstrook onder de microscoop te scannen met een 60X objectief. Laad de pipet met de pipetoplossing en plaats deze in de pipethouder. Breng de pipet met een micromanipulator in de badoplossing en beweeg deze net boven de geselecteerde mitoplast om dicht bij de IMM te komen.Houd de membraanpotentiaal op nul millivolt en pas 10 millivolt-pulsen toe met behulp van het membraantestcommando in het versterkerprogramma. Oefen een lichte onderdruk uit om snel een gigaseal te maken met de IMM. Til de pipet op met de mitoplast eraan om ze uit de buurt van de afdekselslip te houden om te voorkomen dat de afdichting breekt als gevolg van pipetdrift tijdens het experiment.Compenseer de verdwaalde capaciteitstransiënten met het membraantestcommando in het versterkerprogramma voordat u de hele mitoplastconfiguratie test om een correcte capaciteitsmeting voor het mitoplastmembraan na de inbraak te verkrijgen. Pas kortdurende spanningspulsen toe met het versterkerprogramma om de membraanpleister onder de glazen pipet te scheuren en de whole-mitoplast-configuratie te bereiken. Pas na de inbraak de capaciteitstransiënten aan met de membraantestoptie van het versterkerprogramma om de membraancapaciteit en de toegangsweerstand te beoordelen.Vervang onmiddellijk na de inbraak de kaliumchloridebadoplossing door een HEPES-badoplossing via perfusie. Pas een rampprotocol van 850 milliseconden toe met het versterkerprogramma. Toepassing van het voltage ramp protocol induceert een grote amplitude protonstroom over de IMM van bruin vet zonder de toevoeging van exogene vetzuren, de vereiste activatoren van UCP's.Na perfusie door UCP1-remmer guanosinedifosfaat of 10-millimolair methyl bèta-cyclodextrine voor de endogene membraanvetzuurextractie, wordt de reststroom gebruikt om de amplitude van de UCP1-stromen te bepalen, die volledig verdwijnt in de IMM van UCP1-deficiënte muizen. In tegenstelling tot bruin vet ontwikkelt de IMM van niet-vetweefsels, zoals skeletspieren en hart, niet direct na de inbraak een meetbare protonstroom. Om een meetbare protonstroom via AAC te induceren, is het essentieel om de HEPES-badoplossing toe te passen die één tot twee micromolair exogene vetzuren bevat.Om te bevestigen dat de gemeten protonstroom wordt gedragen door AAC, is het belangrijk om specifieke remmers toe te passen, carboxyatractyloside, die de protonstroom die wordt getoond in de IMM van AAC1-deficiënte muizen bijna volledig remmen. Een constante maar nooit volledige remming van protonlekkage wordt alleen bereikt wanneer ADP aan beide zijden van het membraan aanwezig is om een actieve nucleotide-uitwisseling via AAC te genereren. De kwaliteit van het mitoplastpreparaat zal het slagingspercentage beïnvloeden bij het bereiken van de whole-mitoplast configuratie.Het is essentieel om het te optimaliseren. Zodra het moleculaire mechanisme van mitochondriale thermogenese is ontleed met de patchklemtechniek, zal meting van mitochondriaal zuurstofverbruik het belang van protonstroom en thermogenese in intacte mitochondriën aantonen. Deze techniek opent de weg voor onderzoekers om allerlei geleidingen, ionen en metabolieten te onderzoeken die belangrijk zijn voor het functioneren van mitochondriën.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Het testen van visuele gevoeligheid voor de snelheid en richting van de beweging in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Door de computer gegenereerde Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

Methoden voor Patch Clamp capaciteit Recordings uit de Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Druk polijsten pipetten voor verbeterde patch-clamp opnemen

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

Multi-parameter meting van de doorlatendheid Transitie Pore Openen in Geïsoleerde Muis Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Eenkanaals-Cell bevestigd Patch-clamp-opname

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

Het beoordelen van de Secretory Capaciteit van Pancreatic acinuscellen

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Isolatie van Mitochondriën uit Minimale hoeveelheden muis skeletspieren voor Metingen High Throughput Microplate Respiratory

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Het gebruik van<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Whole-orgel imaging en kwantitatieve Tissue histologie van de Bio-verdeling van fluorescent gelabelde moleculen te bepalen

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Isolatie van muis interstitiële klepcellen om de verkalking van de aortaklep in vitro te bestuderen

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) ...