Name: the use of the patch-clamp technique to study the thermogenic capacity of mitochondria
Uploaded: 2021-05-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria at JoVE.com

Je remercie le Dr Yuriy Kirichok pour la grande science dont j’ai fait partie dans son laboratoire et les membres du laboratoire Kirichok pour les discussions utiles. Je remercie également le Dr Douglas C. Wallace d’avoir fourni des souris knockout AAC1 . Financement : A.M.B a reçu un prix de développement de carrière de l’American Heart Association 19CDA34630062.

Toutes les procédures expérimentales sur les animaux qui ont été effectuées sont conformes aux directives des National Institutes of Health et ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Californie à Los Angeles (IACUC).
REMARQUE: La procédure d’isolement mitochondrial est basée sur la centrifugation différentielle et varie légèrement d’un tissu à l’autre. Par exemple, comme le tissu adipeux brun est extrê...

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	<li>Divakaruni, A. S., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+and+physiology+of+mitochondrial+proton+leak.">The regulation and physiology of mitochondrial proton leak.</a> Physiology (Bethesda). 26 (3), 192-205 (2011).</li><li>Chouchani, E. T., Kazak, L., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+advances+in+adaptive+thermogenesis:+UCP1+and+beyond.">New advances in adaptive thermogenesis: UCP1 and beyond.</a> Cell Metabolism. 29 (1), 27-37 (2019).</li><li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue:+function+and+physiological+significance.">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).</li><li>Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hunt+for+the+molecular+mechanism+of+brown+fat+thermogenesis.">The hunt for the molecular mechanism of brown fat thermogenesis.</a> Biochimie. 134, 9-18 (2017).</li><li>Bertholet, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H(+)+transport+is+an+integral+function+of+the+mitochondrial+ADP/ATP+carrier.">H(+) transport is an integral function of the mitochondrial ADP/ATP carrier.</a> Nature. 571 (7766), 515-520 (2019).</li><li>Fedorenko, A., Lishko, P. V., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+fatty-acid-dependent+UCP1+uncoupling+in+brown+fat+mitochondria.">Mechanism of fatty-acid-dependent UCP1 uncoupling in brown fat mitochondria.</a> Cell. 151 (2), 400-413 (2012).</li><li>Bertholet, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+patch+clamp+of+beige+adipocytes+reveals+UCP1-positive+and+UCP1-negative+cells+both+exhibiting+futile+creatine+cycling.">Mitochondrial patch clamp of beige adipocytes reveals UCP1-positive and UCP1-negative cells both exhibiting futile creatine cycling.</a> Cell Metabolism. 25 (4), 811-822 (2017).</li><li>Kirichok, Y., Krapivinsky, G., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+calcium+uniporter+is+a+highly+selective+ion+channel.">The mitochondrial calcium uniporter is a highly selective ion channel.</a> Nature. 427 (6972), 360-364 (2004).</li><li>Fieni, F., Lee, S. B., Jan, Y. N., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter+varies+greatly+between+tissues.">Activity of the mitochondrial calcium uniporter varies greatly between tissues.</a> Nature Communications. 3, 1317 (2012).</li><li>Chaudhuri, D., Sancak, Y., Mootha, V. K., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCU+encodes+the+pore+conducting+mitochondrial+calcium+currents.">MCU encodes the pore conducting mitochondrial calcium currents.</a> eLife. 2, 00704 (2013).</li><li>Vais, H., Payne, R., Paudel, U., Li, C., Foskett, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+transmembrane+mechanisms+control+MCU-mediated+mitochondrial+Ca(2+)+uptake.">Coupled transmembrane mechanisms control MCU-mediated mitochondrial Ca(2+) uptake.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21731-21739 (2020).</li><li>Vais, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMRE+is+a+matrix+Ca(2+)+sensor+that+governs+gatekeeping+of+the+mitochondrial+Ca(2+)+uniporter.">EMRE is a matrix Ca(2+) sensor that governs gatekeeping of the mitochondrial Ca(2+) uniporter.</a> Cell Reports. 14 (3), 403-410 (2016).</li><li>Vais, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCUR1,+CCDC90A,+is+a+regulator+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">MCUR1, CCDC90A, is a regulator of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Cell Metabolism. 22 (4), 533-535 (2015).</li><li>Kamer, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MICU1+imparts+the+mitochondrial+uniporter+with+the+ability+to+discriminate+between+Ca(2+)+and+Mn(2+).">MICU1 imparts the mitochondrial uniporter with the ability to discriminate between Ca(2+) and Mn(2+).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 7960-7969 (2018).</li><li>Bertholet, A. M., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+analysis+of+the+mitochondrial+H(+)+leak+in+brown+and+beige+fat.">Patch-clamp analysis of the mitochondrial H(+) leak in brown and beige fat.</a> Frontiers in Physiology. 11, 326 (2020).</li><li>Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization,+identification,+and+excision+of+murine+adipose+depots.">Localization, identification, and excision of murine adipose depots.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52174 (2014).</li><li>Garg, V., Kirichok, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+analysis+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">Patch-clamp analysis of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Methods in Molecular Biology. 1925, 75-86 (2019).</li><li>Decker, G. L., Greenawalt, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+and+biochemical+studies+of+mitoplasts+and+outer+membranes+derived+from+French-pressed+mitochondria.+Advances+in+mitochondrial+subfractionation.">Ultrastructural and biochemical studies of mitoplasts and outer membranes derived from French-pressed mitochondria. Advances in mitochondrial subfractionation.</a> Journal of Ultrastructure Research. 59 (1), 44-56 (1977).</li><li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+electrical+currents+across+the+plasma+membrane+of+mammalian+sperm+cells.">Recording electrical currents across the plasma membrane of mammalian sperm cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), (2021).</li><li>Flaming, D. G., Brown, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropipette+puller+design:+form+of+the+heating+filament+and+effects+of+filament+width+on+tip+length+and+diameter.">Micropipette puller design: form of the heating filament and effects of filament width on tip length and diameter.</a> Journal of Neuroscience Methods. 6 (1-2), 91-102 (1982).</li><li>Klingenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ADP+and+ATP+transport+in+mitochondria+and+its+carrier.">The ADP and ATP transport in mitochondria and its carrier.</a> Biochimica and Biophysica Acta. 1778 (10), 1978-2021 (2008).</li></ol>

Cet article sur la méthode vise à présenter la technique patch-clamp récemment appliquée aux mitochondries, une nouvelle approche pour étudier directement la fuite H+ à travers l’IMM responsable de la thermogenèse mitochondriale 5,6,7,15. Cette technique ne se limite pas aux tissus et peut également être utilisée pour analyser les fuites H+ et d’autres condu...

Les mitochondries sont célèbres pour être la centrale électrique de la cellule. En effet, ils sont la principale source d’énergie chimique, l’ATP. Ce que l’on sait moins, c’est que les mitochondries génèrent également de la chaleur. En fait, chaque mitochondrie génère constamment les deux types d’énergies (ATP et chaleur) et un équilibre fin entre les deux formes d’énergie définit l’homéostasie cellulaire métabolique (Figure 1). Comment les mitochondries distribuent l’énergie entre l’ATP et la chaleur est certainement la question la plus fondamentale dans le domaine de la bioénergétique, bien qu’elle soit encore largement inconnue. Nous savons que l’augmentation de la production de chaleur mitochondriale (appelée thermogenèse mitochondriale) et, par conséquent, la réduction de la production d’ATP augmentent la dépense énergétique et c’est l’un des meilleurs moyens de lutter contre le syndrome métabolique1.
La thermogenèse mitochondriale provient d’une fuite de H+ à travers la membrane mitochondriale interne (IMM), conduisant au découplage de l’oxydation du substrat et de la synthèse de l’ATP avec la production conséquente de chaleur, d’où le nom de « découplage mitochondrial »1 (Figure 1). Cette fuite H+ dépend de transporteurs mitochondriaux appelés protéines de découplage (UCP). UCP1 a été le premier UCP identifié. Il n’est exprimé que dans les tissus thermogéniques, la graisse brune et la graisse beige dans lesquels les mitochondries sont spécialisées pour la production de chaleur 2,3,4. L’identité de l’UCP dans les tissus non adipeux tels que les muscles squelettiques, le cœur et le foie est restée controversée. Les mitochondries dans ces tissus peuvent avoir environ 25% de l’énergie mitochondriale totale convertie en chaleur, ce qui peut avoir un impact significatif sur la physiologie de tout le corps1. En plus de maintenir la température corporelle centrale, la thermogenèse mitochondriale prévient également l’obésité induite par l’alimentation en réduisant les calories. De plus, il réduit la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) par les mitochondries pour protéger les cellules des dommages oxydatifs1. Ainsi, la thermogenèse mitochondriale est impliquée dans le vieillissement normal, les troubles dégénératifs liés à l’âge et d’autres conditions impliquant un stress oxydatif, telles que l’ischémie-reperfusion. Par conséquent, la thermogenèse mitochondriale est un puissant régulateur du métabolisme cellulaire, et une compréhension mécaniste de ce processus fondamental favorisera le développement de stratégies thérapeutiques pour lutter contre de nombreuses pathologies associées au dysfonctionnement mitochondrial.
La respiration mitochondriale a été la première technique à révéler le rôle crucial de la thermogenèse mitochondriale dans le métabolisme cellulaire et reste la plus populaire dans la communauté1. Cette technique est basée sur la mesure de la consommation d’oxygène par la chaîne de transport d’électrons mitochondriaux (ETC) qui augmente lorsque la fuite mitochondriale H+ est activée. Cette technique, bien qu’instrumentale, ne peut pas étudier directement la fuite mitochondriale H+ à travers l’IMM1, ce qui rend difficile l’identification et la caractérisation précises des protéines qui en sont responsables, en particulier dans les tissus non adipeux dans lesquels la production de chaleur est secondaire par rapport à la production d’ATP. Récemment, le développement de la technique patch-clamp appliquée aux mitochondries a fourni la première étude directe de la fuite H+ sur l’ensemble de l’IMM dans divers tissus 5,6,7.
Le patch-clamp mitochondrial de l’ensemble de l’IMM a été établi pour la première fois de manière reproductible par Kirichok et al.8. Ils ont décrit la première mesure directe des courants mitochondriaux d’uniporteur de calcium (MCU) en 2004 à l’aide de mitoplastes des lignées cellulaires COS-78. Plus tard, le laboratoire Kirichok a montré les courants de calcium des IMM de souris9 et des tissus de la drosophile 9. D’autres laboratoires utilisent maintenant régulièrement cette technique pour étudier les propriétés biophysiques du MICROCONTRÔLEUR 10,11,12,13,14. L’analyse complète de la conductance du potassium et du chlorure par patch-clamp IMM est également possible et a été mentionnée dans plusieurs articles, mais n’a pas encore fait l’objet principal d’une publication 6,7,9. La première mesure des courants H+ à travers l’IMM a été rapportée en 2012 à partir de mitochondries de graisse brunede souris 6, et de mitochondries de graisse beige de souris en 20177. Ce courant est dû à la protéine de découplage spécifique des tissus thermogéniques, UCP1 6,7. Des travaux récents publiés en 2019 ont caractérisé la CAA comme la principale protéine responsable de la fuite mitochondriale de H+ dans les tissus non adipeux tels que le cœur et le muscle squelettique5.
Cette approche unique permet maintenant l’analyse fonctionnelle directe à haute résolution des canaux ioniques mitochondriaux et des transporteurs responsables de la thermogenèse mitochondriale. Pour faciliter l’expansion de la méthode et compléter d’autres études telles que la respiration mitochondriale, un protocole détaillé est décrit ci-dessous pour mesurer les courants H+ transportés par UCP1 et AAC. Trois étapes importantes sont décrites : 1) isolement mitochondrial de la graisse brune de souris pour analyser le courant H+ dépendant de l’UCP1 et isolement mitochondrial du cœur pour analyser le courant H+ dépendant de l’AAC, 2) préparation des mitoplastes avec une Français Pression pour la rupture mécanique de la membrane mitochondriale externe (OMM), 3) enregistrements patch-clamp des courants UCP1 et AAC-dépendants H+ sur l’ensemble de l’IMM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% gelatin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60X water immersion objective, numerical aperture 1.20</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO60XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF150-86-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1550B Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Press</td>
			<td>Glen Mills</td>
			<td>5500-000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inversed Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71 or IX73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Forge</td>
			<td>(Narishige)</td>
			<td>MF-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanupulator MPC-385</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>FG-MPC325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode holder for agar bridge</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH3F4515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>(Sutter Instruments)</td>
			<td>P97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Cell for French Press</td>
			<td>Glen Mills</td>
			<td>5500-FA-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIXER IKA 6-2000RPM</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-50705-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 100X magnification</td>
			<td>Nikon&#160; lens</td>
			<td>MPlan 100/0.80 ELWD 210/0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pClamp 10</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-24E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>358039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75 009 521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table</td>
			<td>Newport</td>
			<td>VIS3036-SG2-325A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-gluconic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>M4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>3777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>60128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>63068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>331635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisBase</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisCl</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of the patch-clamp technique to study the thermogenic capacity of mitochondria

La thermogenèse mitochondriale (également connue sous le nom de découplage mitochondrial) est l’une des cibles les plus prometteuses pour augmenter la dépense énergétique afin de lutter contre le syndrome métabolique. Les tissus thermogéniques tels que les graisses brunes et beiges développent des mitochondries hautement spécialisées pour la production de chaleur. Les mitochondries d’autres tissus, qui produisent principalement de l’ATP, convertissent également jusqu’à 25% de la production totale d’énergie mitochondriale en chaleur et peuvent donc avoir un impact considérable sur la physiologie de tout le corps. La thermogenèse mitochondriale est non seulement essentielle pour maintenir la température corporelle, mais prévient également l’obésité induite par l’alimentation et réduit la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) pour protéger les cellules des dommages oxydatifs. Étant donné que la thermogenèse mitochondriale est un régulateur clé du métabolisme cellulaire, une compréhension mécaniste de ce processus fondamental aidera au développement de stratégies thérapeutiques pour lutter contre de nombreuses pathologies associées au dysfonctionnement mitochondrial. Il est important de noter que les mécanismes moléculaires précis qui contrôlent l’activation aiguë de la thermogenèse dans les mitochondries sont mal définis. Ce manque d’information est en grande partie dû à une pénurie de méthodes pour la mesure directe des protéines de découplage. Le développement récent de la méthodologie patch-clamp appliquée aux mitochondries a permis, pour la première fois, l’étude directe du phénomène à l’origine de la thermogenèse mitochondriale, de la fuite H+ à travers l’IMM, et de la première caractérisation biophysique des transporteurs mitochondriaux qui en sont responsables, la protéine de découplage 1 (UCP1), spécifique des graisses brunes et beiges, et le transporteur ADP/ATP (AAC) pour tous les autres tissus. Cette approche unique fournira de nouvelles informations sur les mécanismes qui contrôlent les fuites H+ et la thermogenèse mitochondriale et sur la façon dont ils peuvent être ciblés pour lutter contre le syndrome métabolique. Cet article décrit la méthodologie patch-clamp appliquée aux mitochondries pour étudier leur capacité thermogénique en mesurant directement les courants H+ à travers l’IMM.

Le développement de la méthodologie patch-clamp appliquée aux mitochondries a fourni la première étude directe de la fuite H+ à travers l’IMM et les transporteurs mitochondriaux, UCP1 et AAC, qui en sont responsables. L’analyse électrophysiologique des fuites H+ dépendantes de l’UCP1 et de l’AAC peut fournir un premier aperçu de la capacité thermogénique des mitochondries. La section des résultats décrit les procédures standard pour mesurer les fuites H+ via UCP1 et ...

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The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria

Cet article sur la méthode détaille les principales étapes de la mesure de la fuite H+ à travers la membrane mitochondriale interne avec la technique patch-clamp, une nouvelle approche pour étudier la capacité thermogénique des mitochondries.

L’utilisation de la technique Patch-Clamp pour étudier la capacité thermogénique des mitochondries

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat ...

Ce protocole décrit comment la technique de la pince à patch peut être utilisée pour étudier la capacité thermogénique des mitochondries en mesurant directement la fuite de protons mitochondriaux à travers la membrane mitochondriale interne. La mesure directe du courant protonique à travers la membrane mitochondriale interne permet d’identifier et de caractériser avec précision les mécanismes moléculaires responsables de la thermogenèse mitochondriale. Cette technique permet non seulement de mesurer le courant protonique à travers la membrane mitochondriale interne, mais aussi d’étudier d’autres conductances importantes pour la fonction mitochondriale, telles que le calcium ou les métabolites comme les nucléotides d’adénine.Placez la souris euthanasiée sur le dos et vaporisez de l’alcool pour nettoyer et mouiller les cheveux. Ensuite, faites une incision de deux centimètres sur le thorax. Après avoir saisi la peau avec une pince à épiler, disséquez le cœur de la poitrine de l’animal et rincez-le pour enlever tout le sang dans un bécher de 10 millilitres avec cinq millilitres de solution d’isolation à froid.Une fois que le cœur a été débarrassé des traces de sang, transférez-le dans un autre bécher de 10 millilitres contenant cinq millilitres de tampon d’isolation à froid et coupez-le en morceaux minces. Ensuite, transférez-le dans un homogénéisateur en verre de 10 millilitres refroidi à la glace. Utilisez un agitateur aérien pour homogénéiser le tissu prédécoupé sur la glace en six coups doux à une vitesse contrôlée de 275 rotations par minute.Transférer l’homogénat dans un tube conique glacé de 15 millilitres et le centrifuger à 700 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius pour granuler les noyaux et les cellules ininterrompues. Recueillez le surnageant dans un tube frais de 15 millilitres et placez-le sur de la glace. Centrifuger le surnageant à 8 500 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius pour obtenir une pastille contenant les mitochondries.Remettre en suspension la pastille mitochondriale dans 3,8 millilitres de tampon de mannitol hypertonique glacé et incuber la suspension mitochondriale sur de la glace pendant 10 à 15 minutes. Remplissez la suspension de mannitol hypertonique mitochondriale dans une mini-cellule de pression réfrigérée de la presse Français. Ensuite, placez la cellule sur le Français appuyez.Ensuite, sélectionnez le mode bas de la Français appuyez et comprimez la suspension à travers la cellule de mini-pression à 110 sur le cadran pour les mitochondries de graisse brune et à 140 pour les mitochondries cardiaques, en veillant à ce que la suspension sorte de la cellule de mini-pression à un taux d’environ une goutte par seconde. Recueillez les gouttes dans un tube conique glacé de 15 millilitres. Centrifuger la suspension à 10 500 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.Remettre en suspension la pastille de mitoplastes dans 0,5 à 2 millilitres de tampon de chlorure de potassium hypertonique glacé et stocker la suspension sur de la glace. Tirez les filaments de verre borosilicate le jour de l’enregistrement à l’aide d’un extracteur de micropipette, en réglant un programme sur le extracteur utilisé pour générer des pipettes avec un haut degré de reproductibilité. Insérez un filament de verre dans l’extracteur et tirez pour obtenir presque deux pipettes de patch identiques à partir d’un filament borosilicate.Ajustez le programme lorsque les pipettes deviennent incohérentes entre les cycles de traction en raison du vieillissement du filament de la boîte chauffante de l’extracteur. Placez la pipette à l’intérieur de la polisseuse à pipette et placez la pointe près du filament sous un grossissement de 100X pour le polir au feu. Appuyez plusieurs fois sur la pédale pour chauffer le filament sans obstruer ou endommager la courbe de pointe.Le polissage jusqu’à ce que les pipettes aient une résistance comprise entre 25 et 35 mégaohms est obtenu lorsqu’il est rempli d’une solution de pipette à base de TMA. Pré-incuber les couvercles avec 0,1% de gélatine pour réduire l’adhérence du mitoplast et les rincer avec la solution de bain de chlorure de potassium avant de déposer la suspension de mitoplast. Préparer une dilution brute en mélangeant environ 35 microlitres de la suspension de mitoplast concentrée avec 500 microlitres de la solution de bain de chlorure de potassium et placez-la sur les glissières de couverture préalablement placées dans un puits d’une plaque à quatre puits.Incuber sur de la glace pendant 15 à 20 minutes pour que les mitoplastes sédimentent le long du glissement de couverture. Remplissez complètement la chambre de bain avec environ 50 microlitres de la solution de bain de chlorure de potassium et transférez un couvercle avec des mitoplastes à l’intérieur de la chambre à l’aide d’une pince à épiler à microdissection mince avec une pointe pliée. Disposez le couvercle au fond de la chambre sans infuser la chambre pour garder les mitoplastes stables sur le couvercle.Choisissez un mitoplaste non adhésif individuel en scannant le bordereau de couverture sous le microscope avec un objectif 60X. Chargez la pipette avec la solution de pipette et placez-la dans le porte-pipette. Apportez la pipette dans la solution de bain avec un micromanipulateur et déplacez-la juste au-dessus du mitoplast sélectionné pour vous rapprocher de l’IMM.Maintenez le potentiel de la membrane à zéro millivolts et appliquez des impulsions de 10 millivolts à l’aide de la commande de test de membrane dans le programme d’amplification. Appliquez une légère pression négative pour créer rapidement une gigaseal avec l’IMM. Soulevez la pipette avec le mitoplast attaché pour les tenir à l’écart du glissement du couvercle afin d’éviter la rupture du joint due à la dérive de la pipette pendant l’expérience.Compenser les transitoires de capacité parasites avec la commande de test de membrane dans le programme d’amplification avant de tester la configuration de l’ensemble du mitoplast pour obtenir une mesure de capacité correcte pour la membrane mitoplast après l’effraction. Appliquez des impulsions de tension de courte durée avec le programme d’amplification pour rompre le patch membranaire sous la pipette en verre et obtenir la configuration entière du mitoplaste. Après l’effraction, équipez les transitoires de capacité avec l’option de test de membrane du programme d’amplification pour évaluer la capacité de la membrane et sa résistance d’accès.Immédiatement après l’effraction, remplacez la solution de bain de chlorure de potassium par une solution de bain HEPES par perfusion. Appliquez un protocole de rampe de 850 millisecondes avec le programme d’amplification. L’application du protocole de rampe de tension induit un courant protonique de grande amplitude à travers l’IMM de graisse brune sans ajout d’acides gras exogènes, les activateurs requis des UCP.Après perfusion par guanosine diphosphate, inhibiteur de l’UCP1, soit par la méthyl bêta-cyclodextrine 10 millimolaires pour l’extraction endogène des acides gras de la membrane, le courant résiduel est utilisé pour déterminer l’amplitude des courants UCP1, qui disparaît complètement dans l’IMM des souris déficientes en UCP1. Contrairement à la graisse brune, l’IMM des tissus non adipeux, tels que le muscle squelettique et le cœur, ne développe pas de courant protonique mesurable immédiatement après l’effraction. Pour induire un courant protonique mesurable par la CAA, il est essentiel d’appliquer la solution de bain HEPES contenant un à deux micromolaires d’acides gras exogènes.Pour confirmer que le courant protonique mesuré est transporté par la CAA, il est important d’appliquer des inhibiteurs spécifiques, le carboxyatractyloside, qui inhibent presque complètement le courant protonique montré dans l’IMM des souris déficientes en AAC1. Une inhibition constante mais jamais complète de la fuite de protons n’est obtenue que lorsque l’ADP est présent des deux côtés de la membrane pour générer un échange actif de nucléotides via la CAA. La qualité de la préparation du mitoplast influencera le taux de réussite dans la réalisation de la configuration du mitoplast entier.Il est essentiel de l’optimiser. Une fois que le mécanisme moléculaire de la thermogenèse mitochondriale est disséqué avec la technique de la pince à patch, la mesure de la consommation d’oxygène mitochondrial démontrera l’importance du courant protonique et de la thermogenèse dans les mitochondries intactes. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs pour explorer toutes sortes de conductances, d’ions et de métabolites importants pour le fonctionnement des mitochondries.

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