Name: the use of the patch-clamp technique to study the thermogenic capacity of mitochondria
Uploaded: 2021-05-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria at JoVE.com

Ich danke Dr. Yuriy Kirichok für die großartige Wissenschaft, an der ich in seinem Labor beteiligt war, und den Mitgliedern des Kirichok-Labors für die hilfreichen Diskussionen. Ich danke auch Dr. Douglas C. Wallace für die Bereitstellung von AAC1-Knockout-Mäusen . Finanzierung: A.M.B wurde durch einen American Heart Association Career Development Award 19CDA34630062 unterstützt.

Alle durchgeführten Tierversuchsverfahren entsprechen den Richtlinien der National Institutes of Health und wurden vom University of California Los Angeles Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt.
HINWEIS: Das mitochondriale Isolationsverfahren basiert auf differentieller Zentrifugation und variiert leicht von Gewebe zu Gewebe. Da beispielsweise braunes Fettgewebe extrem reich an Lipiden ist, ist ein zusätzlicher Schritt erforderlich, um Zelltrümmer und Organellen aus ...

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Dieser Methodenartikel zielt darauf ab, die Patch-Clamp-Technik vorzustellen, die kürzlich auf Mitochondrien angewendet wurde, einen neuen Ansatz zur direkten Untersuchung von H + -Leck durch das IMM, das für die mitochondriale Thermogenese verantwortlich ist 5,6,7,15. Diese Technik ist nicht auf Gewebe beschränkt und kann auch zur Analyse von H + -Lecks und anderen Leitwerten des...

Mitochondrien sind berühmt dafür, das Kraftwerk der Zelle zu sein. In der Tat sind sie die wichtigste Quelle chemischer Energie, ATP. Weniger bekannt ist, dass Mitochondrien auch Wärme erzeugen. Tatsächlich erzeugt jedes Mitochondrium ständig die beiden Arten von Energien (ATP und Wärme) und ein feines Gleichgewicht zwischen den beiden Energieformen definiert die metabolische Zellhomöostase (Abbildung 1). Wie Mitochondrien Energie zwischen ATP und Wärme verteilen, ist sicherlich die grundlegendste Frage auf dem Gebiet der Bioenergetik, obwohl sie noch weitgehend unbekannt ist. Wir wissen, dass die Erhöhung der mitochondrialen Wärmeproduktion (mitochondriale Thermogenese genannt) und folglich die Verringerung der ATP-Produktion den Energieverbrauch erhöht, und dies ist eine der besten Möglichkeiten, das metabolische Syndrom zu bekämpfen1.
Die mitochondriale Thermogenese entsteht durch H+-Leck über die innere mitochondriale Membran (IMM), was zu einer Entkopplung der Substratoxidation und der ATP-Synthese mit anschließender Wärmeerzeugung führt, daher der Name "mitochondriale Entkopplung"1 (Abbildung 1). Dieses H + -Leck hängt von mitochondrialen Transportern ab, die als Entkopplungsproteine (UCPs) bezeichnet werden. UCP1 war der erste identifizierte UCP. Es wird nur in thermogenen Geweben, braunem Fett und beigefarbenem Fett exprimiert, in denen Mitochondrien auf die Wärmeerzeugung spezialisiert sind 2,3,4. Die Identität von UCP in Nicht-Fettgeweben wie Skelettmuskulatur, Herz und Leber ist umstritten geblieben. Mitochondrien in diesen Geweben können etwa 25% der gesamten mitochondrialen Energie in Wärme umgewandelt werden, was die Physiologie des gesamten Körpers erheblich beeinflussen kann1. Neben der Aufrechterhaltung der Körperkerntemperatur verhindert die mitochondriale Thermogenese auch ernährungsbedingte Fettleibigkeit durch Reduzierung der Kalorien. Darüber hinaus reduziert es die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) durch Mitochondrien, um Zellen vor oxidativen Schädenzu schützen 1. So ist die mitochondriale Thermogenese an normalem Altern, altersbedingten degenerativen Erkrankungen und anderen Erkrankungen mit oxidativem Stress wie Ischämie-Reperfusion beteiligt. Daher ist die mitochondriale Thermogenese ein starker Regulator des Zellstoffwechsels, und ein mechanistisches Verständnis dieses grundlegenden Prozesses wird die Entwicklung therapeutischer Strategien zur Bekämpfung vieler Pathologien im Zusammenhang mit mitochondrialer Dysfunktion fördern.
Die mitochondriale Atmung war die erste Technik, die die entscheidende Rolle der mitochondrialen Thermogenese im Zellstoffwechsel aufdeckte und ist immer noch die beliebteste in der Gemeinschaft1. Diese Technik basiert auf der Messung des Sauerstoffverbrauchs durch die mitochondriale Elektronentransportkette (ETC), die zunimmt, wenn das mitochondriale H+-Leck aktiviert wird. Diese Technik, obwohl instrumentell, kann nicht direkt mitochondrialen H + -Lecks über das IMM1 untersuchen, wodurch die genaue Identifizierung und Charakterisierung der dafür verantwortlichen Proteine erschwert wird, insbesondere in Nicht-Fettgeweben, in denen die Wärmeproduktion im Vergleich zur ATP-Produktion sekundär ist. Vor kurzem lieferte die Entwicklung der Patch-Clamp-Technik, die auf Mitochondrien angewendet wurde, die erste direkte Studie des H + -Lecks über das gesamte IMM in verschiedenen Geweben 5,6,7.
Die mitochondriale Patch-Klemme des gesamten IMM wurde erstmals reproduzierbar von Kirichok et al.8 etabliert. Sie beschrieben die erste direkte Messung von mitochondrialen Calcium-Uniporter-Strömen (MCU) im Jahr 2004 mit Mitoplasten aus COS-7-Zelllinien8. Später zeigte das Kirichok-Labor Kalziumströme aus IMMs von Maus 9 und Drosophila Gewebe9. Andere Labore verwenden diese Technik nun routinemäßig, um die biophysikalischen Eigenschaften der MCU 10,11,12,13,14 zu untersuchen. Die gesamte IMM-Patch-Clamp-Analyse des Kalium- und Chloridleitwerts ist ebenfalls möglich und wurde in mehreren Artikeln erwähnt, war aber noch nicht das Hauptthema einer Veröffentlichung 6,7,9. Die erste Messung der H + -Ströme im gesamten IMM wurde 2012 von Maus-Braunfett-Mitochondrien6 und von Maus-Beigefett-Mitochondrien im Jahr 20177 berichtet. Dieser Strom ist auf das spezifische Entkopplungsprotein thermogener Gewebe, UCP16,7, zurückzuführen. Jüngste Arbeiten, die 2019 veröffentlicht wurden, charakterisierten AAC als das Hauptprotein, das für das mitochondriale H + -Leck in Nicht-Fettgeweben wie Herz und Skelettmuskulatur verantwortlich ist 5.
Dieser einzigartige Ansatz ermöglicht nun die direkte hochauflösende Funktionsanalyse der mitochondrialen Ionenkanäle und Transporter, die für die mitochondriale Thermogenese verantwortlich sind. Um die Erweiterung der Methode zu erleichtern und andere Studien wie die mitochondriale Atmung zu ergänzen, wird im Folgenden ein detailliertes Protokoll zur Messung der H + -Ströme beschrieben, die von UCP1 und AAC übertragen werden. Drei wichtige Schritte werden beschrieben: 1) mitochondriale Isolierung von braunem Mausfett zur Analyse des UCP1-abhängigen H + -Stroms und der mitochondrialen Isolierung vom Herzen, um den AAC-abhängigen H + -Strom zu analysieren, 2) Vorbereitung von Mitoplasten mit einer französischen Presse für den mechanischen Bruch der äußeren mitochondrialen Membran (OMM), 3) Patch-Clamp-Aufnahmen von UCP1- und AAC-abhängigen H + -Strömen über das gesamte IMM.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% gelatin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60X water immersion objective, numerical aperture 1.20</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO60XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF150-86-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1550B Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Press</td>
			<td>Glen Mills</td>
			<td>5500-000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inversed Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71 or IX73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Forge</td>
			<td>(Narishige)</td>
			<td>MF-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanupulator MPC-385</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>FG-MPC325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode holder for agar bridge</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH3F4515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>(Sutter Instruments)</td>
			<td>P97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Cell for French Press</td>
			<td>Glen Mills</td>
			<td>5500-FA-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIXER IKA 6-2000RPM</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-50705-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 100X magnification</td>
			<td>Nikon&#160; lens</td>
			<td>MPlan 100/0.80 ELWD 210/0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pClamp 10</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-24E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>358039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75 009 521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table</td>
			<td>Newport</td>
			<td>VIS3036-SG2-325A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-gluconic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>M4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>3777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>60128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>63068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>331635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisBase</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisCl</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of the patch-clamp technique to study the thermogenic capacity of mitochondria

Die mitochondriale Thermogenese (auch bekannt als mitochondriale Entkopplung) ist eines der vielversprechendsten Ziele für die Erhöhung des Energieverbrauchs zur Bekämpfung des metabolischen Syndroms. Thermogene Gewebe wie braune und beige Fette entwickeln hochspezialisierte Mitochondrien zur Wärmeerzeugung. Mitochondrien anderer Gewebe, die primär ATP produzieren, wandeln ebenfalls bis zu 25% der gesamten mitochondrialen Energieproduktion in Wärme um und können daher einen erheblichen Einfluss auf die Physiologie des gesamten Körpers haben. Die mitochondriale Thermogenese ist nicht nur für die Aufrechterhaltung der Körpertemperatur unerlässlich, sondern beugt auch ernährungsbedingter Fettleibigkeit vor und reduziert die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), um Zellen vor oxidativen Schäden zu schützen. Da die mitochondriale Thermogenese ein Schlüsselregulator des Zellstoffwechsels ist, wird ein mechanistisches Verständnis dieses grundlegenden Prozesses bei der Entwicklung therapeutischer Strategien zur Bekämpfung vieler Pathologien im Zusammenhang mit mitochondrialer Dysfunktion helfen. Wichtig ist, dass die genauen molekularen Mechanismen, die die akute Aktivierung der Thermogenese in Mitochondrien steuern, schlecht definiert sind. Dieser Mangel an Informationen ist weitgehend auf einen Mangel an Methoden zur direkten Messung von entkoppelnden Proteinen zurückzuführen. Die jüngste Entwicklung der Patch-Clamp-Methodik, die auf Mitochondrien angewendet wurde, ermöglichte zum ersten Mal die direkte Untersuchung des Phänomens am Ursprung der mitochondrialen Thermogenese, H + -Leck durch das IMM und die erste biophysikalische Charakterisierung der dafür verantwortlichen mitochondrialen Transporter, des Entkopplungsproteins 1 (UCP1), spezifisch für braune und beige Fette, und des ADP / ATP-Transporters (AAC) für alle anderen Gewebe. Dieser einzigartige Ansatz wird neue Einblicke in die Mechanismen liefern, die H + - Leck und mitochondriale Thermogenese kontrollieren und wie sie zur Bekämpfung des metabolischen Syndroms eingesetzt werden können. Dieses Papier beschreibt die Patch-Clamp-Methodik, die auf Mitochondrien angewendet wird, um ihre thermogene Kapazität durch direkte Messung von H + - Strömen durch das IMM zu untersuchen.

Die Entwicklung der Patch-Clamp-Methodik, die auf Mitochondrien angewendet wird, lieferte die erste direkte Untersuchung des H + - Lecks durch das IMM und die dafür verantwortlichen mitochondrialen Transporter UCP1 und AAC. Die elektrophysiologische Analyse von UCP1- und AAC-abhängigen H+ -Leckagen kann einen ersten Blick auf die thermogene Kapazität von Mitochondrien werfen. Im Abschnitt "Ergebnisse" werden die Standardverfahren zur Messung von H+- Lecks über UCP1 und AAC beschrieben...

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The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria

Dieser Methodenartikel beschreibt die wichtigsten Schritte bei der Messung des H + -Lecks über die innere mitochondriale Membran mit der Patch-Clamp-Technik, einem neuen Ansatz zur Untersuchung der thermogenen Kapazität von Mitochondrien.

Die Verwendung der Patch-Clamp-Technik zur Untersuchung der thermogenen Kapazität von Mitochondrien

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat ...

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Patch-Clamp-Technik verwendet werden kann, um die thermogene Kapazität von Mitochondrien zu untersuchen, indem das mitochondriale Protonenleck über die innere mitochondriale Membran direkt gemessen wird. Die direkte Messung des Protonenstroms durch die innere mitochondriale Membran hilft, die molekularen Mechanismen, die für die mitochondriale Thermogenese verantwortlich sind, zu identifizieren und genau zu charakterisieren. Diese Technik ermöglicht es nicht nur, den Protonenstrom über die innere mitochondriale Membran zu messen, sondern auch andere Leitwerte zu untersuchen, die für die mitochondriale Funktion wichtig sind, wie Kalzium oder Metaboliten wie Adeninnukleotide.Positionieren Sie die eingeschläferte Maus auf dem Rücken und sprühen Sie Alkohol ein, um das Haar zu reinigen und zu benetzen. Machen Sie dann einen zwei Zentimeter großen Schnitt am Thorax. Nachdem Sie die Haut mit einer Pinzette erfasst haben, sezieren Sie das Herz von der Brust des Tieres und spülen Sie es aus, um das gesamte Blut in ein 10-Milliliter-Becherglas mit fünf Millilitern kalter Isolationslösung zu entfernen.Sobald das Herz von Blutspuren befreit ist, geben Sie es in ein anderes 10-Milliliter-Becherglas, das fünf Milliliter kalten Isolationspuffer enthält, und zerkleinern Sie es in dünne Stücke. Dann geben Sie es in einen eisgekühlten 10-Milliliter-Glashomogenisator. Verwenden Sie einen Überkopfrührer, um das vorgeschnittene Gewebe auf Eis mit sechs sanften Strichen bei einer kontrollierten Geschwindigkeit von 275 Umdrehungen pro Minute zu homogenisieren.Übertragen Sie das Homogenat auf ein 15-Milliliter-eiskaltes konisches Röhrchen und zentrifugieren Sie es bei 700 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, um die Kerne und ungebrochenen Zellen zu pelletieren. Sammeln Sie den Überstand in einem frischen 15-Milliliter-Schlauch und legen Sie ihn auf Eis. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 8.500 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, um ein Pellet zu erhalten, das die Mitochondrien enthält.Schwebe das mitochondriale Pellet in 3,8 Milliliter eiskaltem hypertonem Mannitolpuffer und inkubiere die mitochondriale Suspension auf Eis für 10 bis 15 Minuten. Füllen Sie die mitochondriale hypertone Mannitolsuspension in eine gekühlte Mini-Druckzelle der französischen Presse. Legen Sie dann die Zelle auf die französische Presse.Wählen Sie dann den niedrigen Modus der französischen Presse und komprimieren Sie die Suspension durch die Mini-Druckzelle bei 110 auf dem Zifferblatt für die braunen Fettmitochondrien und bei 140 für die Herzmitochondrien, um sicherzustellen, dass die Suspension mit einer Rate von etwa einem Tropfen pro Sekunde aus der Mini-Druckzelle kommt. Sammeln Sie die Tropfen in einem 15-Milliliter-eisgekühlten konischen Rohr. Zentrifen Sie die Suspension bei 10.500 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.Resuspendiert das Mitoplastenpellet in 0,5 bis 2 Milliliter eiskaltem hypertonem Kaliumchloridpuffer und lagert die Suspension auf Eis. Ziehen Sie die Borosilikatglasfilamente am Tag der Aufnahme mit einem Mikropipettenabzieher und stellen Sie ein Programm auf dem Abzieher ein, der zum Erzeugen von Pipetten mit hoher Reproduzierbarkeit verwendet wird. Führen Sie ein Glasfilament in den Abzieher ein und ziehen Sie, um fast zwei identische Patchpipetten aus einem Borosilikatfilament zu erhalten.Passen Sie das Programm an, wenn Pipetten aufgrund der Alterung des Heizkastenfilaments des Abziehers zwischen den Zugzyklen inkonsistent werden. Positionieren Sie die Pipette im Inneren des Pipettenpolierers und platzieren Sie die Spitze in der Nähe des Filaments unter 100-facher Vergrößerung, um sie zu polieren. Drücken Sie mehrmals auf das Fußpedal, um das Filament zu erwärmen, ohne die Spitzenkurve zu verstopfen oder zu beschädigen.Polieren, bis die Pipetten einen Widerstand zwischen 25 und 35 Megaohm haben, werden erhalten, wenn sie mit TMA-basierter Pipettenlösung gefüllt werden. Vorinkubierende Deckscheine mit 0,1% Gelatine, um die Mitoplast-Adhäsion zu reduzieren und sie mit der Kaliumchlorid-Badelösung abzuspülen, bevor die Mitoplast-Suspension abgeschieden wird. Bereiten Sie eine Rohverdünnung vor, indem Sie etwa 35 Mikroliter der konzentrierten Mitoplastsuspension mit 500 Mikrolitern der Kaliumchlorid-Badelösung mischen und auf die zuvor in einer Vertiefung einer Vier-Well-Platte platzierten Deckscheine legen.15 bis 20 Minuten auf Eis inkubieren, damit Mitoplasten den Deckslip absacken können. Füllen Sie die Badekammer vollständig mit ca. 50 Mikrolitern der Kaliumchlorid-Badelösung und übertragen Sie einen Deckzettel mit Mitoplasten innerhalb der Kammer mit einer dünnen Mikrodissektionspinzette mit einer gebogenen Spitze. Ordnen Sie den Deckzettel am Boden der Kammer an, ohne die Kammer zu durchbluten, um die Mitoplasten auf dem Deckglas stabil zu halten.Wählen Sie einen individuellen, nicht klebenden Mitoplasten, indem Sie den Deckschlitten unter dem Mikroskop mit einem 60X-Objektiv scannen. Beladen Sie die Pipette mit der Pipettenlösung und legen Sie sie in den Pipettenhalter. Bringen Sie die Pipette mit einem Mikromanipulator in die Badlösung und bewegen Sie sie knapp über den ausgewählten Mitoplasten, um sich dem IMM zu nähern.Halten Sie das Membranpotential bei null Millivolt und wenden Sie 10 Millivoltimpulse mit dem Membrantestbefehl im Verstärkerprogramm an. Üben Sie einen leichten Unterdruck aus, um schnell eine Gigaseal mit dem IMM zu erstellen. Heben Sie die Pipette mit dem Mitoplast an, um sie vom Deckschlupf fernzuhalten, um den Dichtungsbruch aufgrund von Pipettendrift während des Experiments zu vermeiden.Kompensieren Sie die Streukapazitätstransienten mit dem Membrantestbefehl im Verstärkerprogramm, bevor Sie die Gesamt-Mitoplast-Konfiguration testen, um nach dem Einbruch eine korrekte Kapazitätsmessung für die Mitoplastmembran zu erhalten. Wenden Sie kurzzeitige Spannungsimpulse mit dem Verstärkerprogramm an, um das Membranpflaster unter der Glaspipette zu brechen und die Gesamt-Mitoplast-Konfiguration zu erreichen. Passen Sie nach dem Einbruch die Kapazitätstransienten mit der Membrantestoption des Verstärkerprogramms an, um die Membrankapazität und ihren Zugangswiderstand zu beurteilen.Ersetzen Sie unmittelbar nach dem Einbruch die Kaliumchlorid-Badelösung durch eine HEPES-Badelösung durch Perfusion. Wenden Sie ein 850-Millisekunden-Rampenprotokoll mit dem Verstärkerprogramm an. Die Anwendung des Spannungsrampenprotokolls induziert einen Protonenstrom mit großer Amplitude über das IMM von braunem Fett ohne die Zugabe von exogenen Fettsäuren, den erforderlichen Aktivatoren von UCPs.Nach Perfusion entweder durch UCP1-Inhibitor Guanosindiphosphat oder 10-millimolares Methylbeta-Cyclodextrin zur endogenen Membranfettsäureextraktion wird der Reststrom verwendet, um die Amplitude der UCP1-Ströme zu bestimmen, die im IMM von UCP1-defizienten Mäusen vollständig verschwindet. Im Gegensatz zu braunem Fett entwickelt das IMM von Nicht-Fettgeweben wie Skelettmuskulatur und Herz unmittelbar nach dem Einbruch keinen messbaren Protonenstrom. Um einen messbaren Protonenstrom durch AAC zu induzieren, ist es wichtig, die HEPES-Badelösung anzuwenden, die ein bis zwei Mikromolar exogene Fettsäuren enthält.Um zu bestätigen, dass der gemessene Protonenstrom von AAC getragen wird, ist es wichtig, spezifische Inhibitoren, Carboxyatractylosid, anzuwenden, die den Protonenstrom, der im IMM von AAC1-defizienten Mäusen gezeigt wird, fast vollständig hemmen. Eine konstante, aber nie vollständige Hemmung des Protonenlecks wird nur erreicht, wenn ADP auf beiden Seiten der Membran vorhanden ist, um einen aktiven Nukleotidaustausch über AAC zu erzeugen. Die Qualität der Mitoplast-Zubereitung beeinflusst die Erfolgsquote bei der Erreichung der Whole-Mitoplast-Konfiguration.Es ist wichtig, es zu optimieren. Sobald der molekulare Mechanismus der mitochondrialen Thermogenese mit der Patch-Clamp-Technik seziert wurde, wird die Messung des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs die Bedeutung von Protonenstrom und Thermogenese in intakten Mitochondrien demonstrieren. Diese Technik öffnet den Forschern den Weg, alle Arten von Leitwerten, Ionen und Metaboliten zu erforschen, die für das Funktionieren der Mitochondrien wichtig sind.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testen visueller Sensibilität für die Geschwindigkeit und Richtung der Bewegung in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Forschung

Biologie

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Computer-Generated-Tiermodell Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

Methoden für die Patch-Clamp Kapazität Recordings aus dem Kelch

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

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Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

Multi-Parameter-Messung der Durchlässigkeit Transition Pore Opening in isolierten Maus-Mitochondrien

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ein-Kanal-Cell-Attached-Patch-Clamp-Aufnahme

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

Beurteilung der sekretorischen Kapazität von Azinuszellen des Pankreas

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Isolierung von Mitochondrien von minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

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Die Verwendung von<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Whole-Orgel Imaging und Quantitative Tissue Histologie des Bio-Verteilung von fluoreszenzmarkierten Moleküle zu bestimmen

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

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