Name: the use of the patch-clamp technique to study the thermogenic capacity of mitochondria
Uploaded: 2021-05-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria at JoVE.com

אני מודה לד"ר יורי קיריצ'וק על המדע הגדול שהייתי חלק ממנו במעבדתו ולחברי מעבדת קיריצ'וק על הדיונים המועילים. אני מודה גם לד"ר דאגלס ס. וואלאס על שסיפק עכברי נוקאאוט AAC1 . מימון: A.M.B נתמך על ידי פרס פיתוח קריירה של איגוד הלב האמריקאי 19CDA34630062.

כל ההליכים הניסוייים בבעלי חיים שבוצעו תואמים את הנחיות המכונים הלאומיים לבריאות ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס (IACUC).
הערה: הליך הבידוד המיטוכונדריאלי מבוסס על צנטריפוגה דיפרנציאלית ומשתנה מעט מרקמה לרקמה. לדוגמה...

<ol>
	<li>Divakaruni, A. S., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+and+physiology+of+mitochondrial+proton+leak.">The regulation and physiology of mitochondrial proton leak.</a> Physiology (Bethesda). 26 (3), 192-205 (2011).</li><li>Chouchani, E. T., Kazak, L., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+advances+in+adaptive+thermogenesis:+UCP1+and+beyond.">New advances in adaptive thermogenesis: UCP1 and beyond.</a> Cell Metabolism. 29 (1), 27-37 (2019).</li><li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue:+function+and+physiological+significance.">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).</li><li>Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hunt+for+the+molecular+mechanism+of+brown+fat+thermogenesis.">The hunt for the molecular mechanism of brown fat thermogenesis.</a> Biochimie. 134, 9-18 (2017).</li><li>Bertholet, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H(+)+transport+is+an+integral+function+of+the+mitochondrial+ADP/ATP+carrier.">H(+) transport is an integral function of the mitochondrial ADP/ATP carrier.</a> Nature. 571 (7766), 515-520 (2019).</li><li>Fedorenko, A., Lishko, P. V., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+fatty-acid-dependent+UCP1+uncoupling+in+brown+fat+mitochondria.">Mechanism of fatty-acid-dependent UCP1 uncoupling in brown fat mitochondria.</a> Cell. 151 (2), 400-413 (2012).</li><li>Bertholet, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+patch+clamp+of+beige+adipocytes+reveals+UCP1-positive+and+UCP1-negative+cells+both+exhibiting+futile+creatine+cycling.">Mitochondrial patch clamp of beige adipocytes reveals UCP1-positive and UCP1-negative cells both exhibiting futile creatine cycling.</a> Cell Metabolism. 25 (4), 811-822 (2017).</li><li>Kirichok, Y., Krapivinsky, G., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+calcium+uniporter+is+a+highly+selective+ion+channel.">The mitochondrial calcium uniporter is a highly selective ion channel.</a> Nature. 427 (6972), 360-364 (2004).</li><li>Fieni, F., Lee, S. B., Jan, Y. N., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter+varies+greatly+between+tissues.">Activity of the mitochondrial calcium uniporter varies greatly between tissues.</a> Nature Communications. 3, 1317 (2012).</li><li>Chaudhuri, D., Sancak, Y., Mootha, V. K., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCU+encodes+the+pore+conducting+mitochondrial+calcium+currents.">MCU encodes the pore conducting mitochondrial calcium currents.</a> eLife. 2, 00704 (2013).</li><li>Vais, H., Payne, R., Paudel, U., Li, C., Foskett, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+transmembrane+mechanisms+control+MCU-mediated+mitochondrial+Ca(2+)+uptake.">Coupled transmembrane mechanisms control MCU-mediated mitochondrial Ca(2+) uptake.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21731-21739 (2020).</li><li>Vais, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMRE+is+a+matrix+Ca(2+)+sensor+that+governs+gatekeeping+of+the+mitochondrial+Ca(2+)+uniporter.">EMRE is a matrix Ca(2+) sensor that governs gatekeeping of the mitochondrial Ca(2+) uniporter.</a> Cell Reports. 14 (3), 403-410 (2016).</li><li>Vais, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCUR1,+CCDC90A,+is+a+regulator+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">MCUR1, CCDC90A, is a regulator of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Cell Metabolism. 22 (4), 533-535 (2015).</li><li>Kamer, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MICU1+imparts+the+mitochondrial+uniporter+with+the+ability+to+discriminate+between+Ca(2+)+and+Mn(2+).">MICU1 imparts the mitochondrial uniporter with the ability to discriminate between Ca(2+) and Mn(2+).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 7960-7969 (2018).</li><li>Bertholet, A. M., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+analysis+of+the+mitochondrial+H(+)+leak+in+brown+and+beige+fat.">Patch-clamp analysis of the mitochondrial H(+) leak in brown and beige fat.</a> Frontiers in Physiology. 11, 326 (2020).</li><li>Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization,+identification,+and+excision+of+murine+adipose+depots.">Localization, identification, and excision of murine adipose depots.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52174 (2014).</li><li>Garg, V., Kirichok, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+analysis+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">Patch-clamp analysis of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Methods in Molecular Biology. 1925, 75-86 (2019).</li><li>Decker, G. L., Greenawalt, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+and+biochemical+studies+of+mitoplasts+and+outer+membranes+derived+from+French-pressed+mitochondria.+Advances+in+mitochondrial+subfractionation.">Ultrastructural and biochemical studies of mitoplasts and outer membranes derived from French-pressed mitochondria. Advances in mitochondrial subfractionation.</a> Journal of Ultrastructure Research. 59 (1), 44-56 (1977).</li><li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+electrical+currents+across+the+plasma+membrane+of+mammalian+sperm+cells.">Recording electrical currents across the plasma membrane of mammalian sperm cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), (2021).</li><li>Flaming, D. G., Brown, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropipette+puller+design:+form+of+the+heating+filament+and+effects+of+filament+width+on+tip+length+and+diameter.">Micropipette puller design: form of the heating filament and effects of filament width on tip length and diameter.</a> Journal of Neuroscience Methods. 6 (1-2), 91-102 (1982).</li><li>Klingenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ADP+and+ATP+transport+in+mitochondria+and+its+carrier.">The ADP and ATP transport in mitochondria and its carrier.</a> Biochimica and Biophysica Acta. 1778 (10), 1978-2021 (2008).</li></ol>

מאמר שיטה זה נועד להציג את טכניקת מהדק הטלאי שיושמה לאחרונה על המיטוכונדריה, גישה חדשה לחקר ישיר של דליפת H+ דרך ה-IMM האחראית על תרמוגנזה מיטוכונדריאלית 5,6,7,15. טכניקה זו אינה מוגבלת לרקמות וניתן להשתמש בה גם כדי לנת?...

המיטוכונדריה מפורסמים בהיותם תחנת הכוח של התא. ואכן, הם המקור העיקרי לאנרגיה כימית, ATP. מה שפחות ידוע הוא כי המיטוכונדריה גם לייצר חום. למעשה, כל מיטוכונדריה מייצרת כל הזמן את שני סוגי האנרגיות (ATP וחום) ואיזון עדין בין שתי צורות האנרגיה מגדיר הומאוסטזיס של תאים מטבוליים (איור 1). כיצד המיטוכונדריה מפיצה אנרגיה בין ATP לחום היא ללא ספק השאלה הבסיסית ביותר בתחום הביו-אנרגיה, אם כי היא עדיין לא ידועה במידה רבה. אנו כן יודעים שהגדלת ייצור החום המיטוכונדריאלי (הנקראת תרמוגנזה מיטוכונדריאלית), וכתוצאה מכך הפחתת ייצור ה-ATP מגדילה את ההוצאה האנרגטית וזו אחת הדרכים הטובות ביותר להילחם בתסמונת מטבולית1.
תרמוגנזה מיטוכונדריאלית מקורה בדליפת H+ על פני הממברנה המיטוכונדרית הפנימית (IMM), מה שמוביל לניתוק של חמצון המצע וסינתזת ATP עם ייצור כתוצאה מכך של חום, ומכאן השם "uncoupling המיטוכונדריאלי"1 (איור 1). דליפה זו של H+ תלויה במובילים מיטוכונדריאליים הנקראים חלבונים לא משתפים פעולה (UCPs). UCP1 היה ה-UCP הראשון שזוהה. זה בא לידי ביטוי רק ברקמות תרמוגניות, שומן חום, ושומן בז 'שבו המיטוכונדריה מתמחים בייצור חום 2,3,4. הזהות של UCP ברקמות שאינן שומן כגון שרירי השלד, הלב והכבד, נותרה שנויה במחלוקת. המיטוכונדריה ברקמות אלה יכולה להיות כ -25% מכלל האנרגיה המיטוכונדרית המומרת לחום, אשר יכול להשפיע באופן משמעותי על הפיזיולוגיה של כל הגוף1. מלבד שמירה על טמפרטורת הגוף הבסיסית, תרמוגנזה מיטוכונדריאלית גם מונעת השמנת יתר הנגרמת על ידי דיאטה על ידי הפחתת קלוריות. בנוסף, הוא מפחית את הייצור של מיני חמצן תגובתי (ROS) על ידי מיטוכונדריה כדי להגן על תאים מפני נזק חמצוני1. לפיכך, תרמוגנזה מיטוכונדריאלית מעורבת בהזדקנות תקינה, בהפרעות ניווניות הקשורות לגיל ובמצבים אחרים המערבים עקה חמצונית, כגון איסכמיה-רפרפוזיה. לכן, תרמוגנזה מיטוכונדריאלית היא מווסת רב עוצמה של חילוף החומרים התאי, והבנה מכניסטית של תהליך בסיסי זה תקדם את הפיתוח של אסטרטגיות טיפוליות כדי להילחם בפתולוגיות רבות הקשורות לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה.
נשימה מיטוכונדריאלית הייתה הטכניקה הראשונה שחשפה את התפקיד המכריע של תרמוגנזה מיטוכונדריאלית בחילוף החומרים התאי והיא עדיין הפופולרית ביותר בקהילה1. טכניקה זו מבוססת על מדידת צריכת החמצן על ידי שרשרת הובלת האלקטרונים המיטוכונדרית (ETC) הגוברת כאשר מופעלת דליפת H+ מיטוכונדריאלית. טכניקה זו, למרות שהיא אינסטרומנטלית, אינה יכולה לחקור באופן ישיר דליפת H+ מיטוכונדריאלית על פני IMM1, ובכך הופכת את הזיהוי והאפיון המדויקים של החלבונים האחראים לכך לקשה, במיוחד ברקמות שאינן שומן שבהן ייצור החום הוא משני בהשוואה לייצור ATP. לאחרונה, הפיתוח של טכניקת הידוק הטלאי המיושמת על המיטוכונדריה, סיפק את המחקר הישיר הראשון של דליפת H+ על פני כל ה-IMM ברקמות שונות 5,6,7.
מהדק הטלאים המיטוכונדריאלי של כל ה-IMM הוקם לראשונה בצורה ניתנת לשחזור על ידי Kirichok et al.8. הם תיארו את המדידה הישירה הראשונה של זרמי חד-פורטר סידן מיטוכונדריאלי (MCU) בשנת 2004 באמצעות מיטופלסטים מקווי תאים COS-78. מאוחר יותר, מעבדת קיריצ'וק הראתה זרמי סידן מהודעות מיידיות של רקמות עכבר9 ודרוזופילה 9. מעבדות אחרות משתמשות כיום באופן שגרתי בטכניקה זו כדי לחקור את התכונות הביופיזיות של MCU 10,11,12,13,14. ניתוח מדבקת IMM שלם של מוליכות אשלגן וכלוריד אפשרי גם הוא והוזכר במספר מאמרים אך עדיין לא היה הנושא העיקרי של פרסום 6,7,9. המדידה הראשונה של זרמי H+ ברחבי ה-IMM דווחה בשנת 2012 ממיטוכונדריה6 של שומן חום עכבר, וממיטוכונדריה של שומן בז' בעכבר בשנת 20177. זרם זה נובע מחלבון ה-uncoupling הספציפי של רקמות תרמוגניות, UCP1 6,7. עבודות שפורסמו לאחרונה בשנת 2019 אפיינו את AAC כחלבון העיקרי האחראי לדליפת H+ מיטוכונדריאלית ברקמות שאינן שומן כגון הלב ושרירי השלד5.
גישה ייחודית זו מאפשרת כעת ניתוח פונקציונלי ישיר ברזולוציה גבוהה של תעלות היונים המיטוכונדריה והמובילים האחראים על תרמוגנזה מיטוכונדריאלית. כדי להקל על הרחבת השיטה ולהשלים מחקרים אחרים כגון נשימה מיטוכונדריאלית, מתואר להלן פרוטוקול מפורט למדידת זרמי H+ הנישאים על ידי UCP1 ו- AAC. שלושה שלבים חשובים מתוארים: 1) בידוד מיטוכונדריאלי משומן חום עכברי כדי לנתח זרם H+ תלוי UCP1 ובידוד מיטוכונדריאלי מהלב כדי לנתח זרם H+ תלוי AAC, 2) הכנת מיטופלסטים עם מכבש צרפתי לקרע מכני של הממברנה המיטוכונדרית החיצונית (OMM), 3) הקלטות מהדק טלאי של זרמי UCP1 ו-H+ התלויים ב-AAC על פני כל ה-IMM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% gelatin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60X water immersion objective, numerical aperture 1.20</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO60XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF150-86-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1550B Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Press</td>
			<td>Glen Mills</td>
			<td>5500-000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inversed Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71 or IX73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Forge</td>
			<td>(Narishige)</td>
			<td>MF-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanupulator MPC-385</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>FG-MPC325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode holder for agar bridge</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH3F4515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>(Sutter Instruments)</td>
			<td>P97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Cell for French Press</td>
			<td>Glen Mills</td>
			<td>5500-FA-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIXER IKA 6-2000RPM</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-50705-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 100X magnification</td>
			<td>Nikon&#160; lens</td>
			<td>MPlan 100/0.80 ELWD 210/0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pClamp 10</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-24E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>358039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75 009 521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table</td>
			<td>Newport</td>
			<td>VIS3036-SG2-325A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-gluconic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>M4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>3777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>60128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>63068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>331635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisBase</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisCl</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of the patch-clamp technique to study the thermogenic capacity of mitochondria

תרמוגנזה מיטוכונדריאלית (הידועה גם בשם uncoupling מיטוכונדריאלי) היא אחד היעדים המבטיחים ביותר להגדלת הוצאות האנרגיה כדי להילחם בתסמונת המטבולית. רקמות תרמוגניות כגון שומנים חומים ובז 'מפתחות מיטוכונדריה מיוחדת מאוד לייצור חום. מיטוכונדריה של רקמות אחרות, המייצרות בעיקר ATP, ממירות גם הן עד 25% מכלל ייצור האנרגיה המיטוכונדרית לחום ולכן יכולות להשפיע באופן ניכר על הפיזיולוגיה של הגוף כולו. תרמוגנזה מיטוכונדריאלית לא רק חיונית לשמירה על טמפרטורת הגוף, אלא גם מונעת השמנת יתר הנגרמת על ידי דיאטה ומפחיתה את הייצור של מיני חמצן תגובתי (ROS) כדי להגן על התאים מפני נזק חמצוני. מאחר שתרמוגנזה מיטוכונדריאלית היא מווסת מרכזי של חילוף החומרים התאי, הבנה מכניסטית של תהליך בסיסי זה תסייע בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות למאבק בפתולוגיות רבות הקשורות לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה. חשוב לציין שהמנגנונים המולקולריים המדויקים השולטים בהפעלה חריפה של תרמוגנזה במיטוכונדריה מוגדרים בצורה גרועה. מחסור זה במידע נובע במידה רבה ממחסור בשיטות למדידה ישירה של חלבונים שאינם מתחברים. ההתפתחות האחרונה של מתודולוגיית מהדקי טלאים המיושמת על המיטוכונדריה אפשרה, לראשונה, את המחקר הישיר של התופעה במקור התרמוגנזה המיטוכונדרית, דליפת H+ דרך ה-IMM, ואת האפיון הביופיזי הראשון של מובילי מיטוכונדריה האחראים לכך, את החלבון הלא-משתף פעולה 1 (UCP1), ספציפי לשומנים חומים ובז', ואת טרנספורטר ADP/ATP (AAC) לכל הרקמות האחרות. גישה ייחודית זו תספק תובנות חדשות על המנגנונים השולטים בדליפת H+ ובתרמוגנזה מיטוכונדריאלית וכיצד ניתן למקד אותם כדי להילחם בתסמונת המטבולית. מאמר זה מתאר את מתודולוגיית הידוק הטלאים המיושמת על המיטוכונדריה כדי לחקור את היכולת התרמוגנית שלהן על ידי מדידה ישירה של זרמי H+ באמצעות ה-IMM.

פיתוח מתודולוגיית הידוק התיקון המיושמת על המיטוכונדריה סיפק את המחקר הישיר הראשון של דליפת H+ דרך ה-IMM והמובילים המיטוכונדריים, UCP1 ו-AAC, האחראים לכך. הניתוח האלקטרופיזיולוגי של דליפות H+ תלויות UCP1 ו-AAC יכול לספק מבט ראשון על היכולת התרמוגנית של המיטוכונדריה. סעיף התוצאות מתאר את ה...

Watch this Scientific Journal Video about The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria at JoVE.com

The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria

מאמר שיטה זה מפרט את השלבים העיקריים במדידת דליפת H+ על פני הממברנה המיטוכונדריאלית הפנימית באמצעות טכניקת הידוק טלאי, גישה חדשה לחקר היכולת התרמוגנית של המיטוכונדריה.

השימוש בטכניקת המהדק טלאי כדי לחקור את היכולת התרמוגנית של המיטוכונדריה

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat ...

פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן להשתמש בטכניקת מהדק המדבקה כדי לחקור את היכולת התרמוגנית של המיטוכונדריה על ידי מדידה ישירה של דליפת פרוטונים מיטוכונדריאליים על פני קרום המיטוכונדריה הפנימי. המדידה הישירה של זרם הפרוטון דרך הממברנה המיטוכונדרית הפנימית מסייעת לזהות ולאפיין במדויק את המנגנונים המולקולריים האחראים על תרמוגנזה מיטוכונדריאלית. טכניקה זו מאפשרת לא רק למדוד את זרם הפרוטונים על פני הממברנה המיטוכונדרית הפנימית, אלא גם לחקור מוליכונדרים אחרים החשובים לתפקוד המיטוכונדריה, כגון סידן או מטבוליטים כמו נוקלאוטידים אדנין.מקם את העכבר המתת מורדם על גבו ומרסס אלכוהול כדי לנקות ולהרטיב את השיער. לאחר מכן, בצע חתך של שני סנטימטרים על בית החזה. לאחר שתפסו את העור בפינצטה, נתחו את הלב מהחזה של החיה ושטפו אותו כדי להסיר את כל הדם לכוס של 10 מיליליטר עם חמישה מיליליטרים של תמיסת בידוד קר.לאחר שהלב נוקה מעקבות של דם, העבירו אותו לכוס אחרת של 10 מיליליטר שהכילה חמישה מיליליטרים של מאגר בידוד קר וקיצצו אותו לחתיכות דקות. לאחר מכן, העבירו אותו להומוגנייזר זכוכית 10 מיליליטר מקורר קרח. השתמשו במערבל תקורה כדי ליצור הומוגניזציה של הרקמה החתוכה על קרח עם שש משיכות עדינות במהירות מבוקרת של 275 סיבובים בדקה.מעבירים את ההומוגנאט לצינור חרוטי קר כקרח של 15 מיליליטר וצנטריפוגות אותו ב-700 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לכדור את הגרעינים והתאים הלא שבורים. אספו את ה-supernatant בצינור טרי של 15 מיליליטר והניחו אותו על קרח. צנטריפוגה את הסופרנטנט ב 8, 500 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לקבל כדור המכיל את המיטוכונדריה.יש לגדל מחדש את הכדור המיטוכונדריאלי ב-3.8 מיליליטרים של חיץ מניטול היפרטוני קר כקרח ולדגום את התרחיף המיטוכונדריאלי על קרח למשך 10 עד 15 דקות. מלאו את תרחיף המניטול ההיפרטוני המיטוכונדריאלי לתוך תא לחץ מיני מקורר של העיתונות הצרפתית. לאחר מכן, הניחו את התא על המכבש הצרפתי.לאחר מכן, בחר את המצב הנמוך של הלחיצה הצרפתית ודחס את המתלים דרך תא הלחץ הזעיר ב-110 על החוגה עבור המיטוכונדריה של השומן החום, ובשעה 140 עבור המיטוכונדריה של הלב, כדי להבטיח שהמתלים יוצאים מתא הלחץ הזעיר בקצב של כטיפה אחת לשנייה. אספו את הטיפות בצינור חרוטי מצונן קרח של 15 מיליליטר. צנטריפוגה ההשעיה ב 10, 500 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.בצעו שימוש חוזר בכדור המיטופלסטים ב-0.5 עד 2 מיליליטרים של חיץ אשלגן כלוריד היפרטוני קר כקרח ואחסנו את התרחיף על קרח. משוך את חוטי הזכוכית הבורוסיליקטים ביום ההקלטה באמצעות מושך מיקרופיפט, וקבע תוכנית על המושך המשמש ליצירת פיפטות עם רמה גבוהה של יכולת שכפול. הכנס חוט זכוכית אחד בתוך המושך ומשך כדי להשיג כמעט שתי פיפטות טלאי זהות מחוט בורוסיליקט אחד.התאם את התוכנית כאשר פיפטות הופכות להיות לא עקביות בין מחזורי משיכה עקב הזדקנות של חוט תיבת החימום של המושך. מקם את הפיפטה בתוך מלטש הפיפטה והנח את הקצה ליד החוט מתחת להגדלה של פי 100 כדי לירות לוטש אותו. לחץ על דוושת כף הרגל מספר פעמים כדי לחמם את החוט מבלי לסתום או לפגוע בעקומת הקצה.פולנית עד פיפטות יש התנגדות בין 25 ל 35 megaohms מתקבלים כאשר מלא בתמיסת פיפטה מבוססת TMA. החלקות כיסוי טרום הדגירה עם 0.1% ג'לטין כדי להפחית את הידבקות המיטופלסטיקה ולשטוף אותן בתמיסת אמבט אשלגן כלוריד לפני הפקדת תרחיף המיטופלסט. הכינו דילול גולמי על ידי ערבוב של כ-35 מיקרוליטרים של תרחיף המיטופלסט המרוכז עם 500 מיקרוליטרים של תמיסת אמבט האשלגן כלוריד והניחו אותה על תלושי הכיסוי שהונחו בעבר בבאר של צלחת בעלת ארבע בארות.דגירה על קרח במשך 15 עד 20 דקות עבור mitoplasts כדי משקעים במורד החלקת הכיסוי. מלאו את תא האמבטיה לחלוטין בכ-50 מיקרוליטרים של תמיסת האמבטיה אשלגן כלורי והעבירו החלקת כיסוי עם מיטופלסטים בתוך התא באמצעות פינצטה מיקרו-דיסקטיבית דקה עם קצה כפוף. סדרו את החלקת הכיסוי בתחתית התא מבלי לחדור את התא כדי לשמור על יציבות המיטופלסטים על החלקת הכיסוי.בחר מיטופלסט בודד שאינו דבק על-ידי סריקת החלקת הכיסוי מתחת למיקרוסקופ עם מטרה של פי 60. טענו את הפיפטה בתמיסת הפיפטה והניחו אותה במחזיק הפיפטה. מביאים את הפיפטה לתמיסת האמבטיה עם מיקרומניפולטור ומזיזים אותה ממש מעל המיטופלסט שנבחר כדי להתקרב ל-IMM.החזיקו את פוטנציאל הממברנה באפס מיליבולטים והחלו פולסים של 10 מיליוולט באמצעות פקודת בדיקת הממברנה בתוכנית המגבר. הפעילו לחץ שלילי קל כדי ליצור במהירות ג'יגאזאל עם ה-IMM. הרימו את הפיפטה עם המיטופלסט המחובר כדי להרחיק אותם מהחלקת הכיסוי כדי למנוע את שבירת האטמים עקב סחף פיפטה במהלך הניסוי.פצה את ארעי הקיבולים המשוטטים באמצעות פקודת בדיקת הממברנה בתוכנית המגבר לפני שתבדוק את תצורת המיטופלסט השלם כדי לקבל מדידת קיבוליות נכונה עבור קרום המיטופלסט לאחר הפריצה. החל פולסים של מתח קצר טווח עם תוכנית המגבר כדי לקרוע את מדבקת הממברנה מתחת לפיפטת הזכוכית ולהשיג את תצורת המיטולסט כולו. לאחר הפריצה, התאם את ארעי הקיבול עם אפשרות בדיקת הממברנה של תוכנית המגבר כדי להעריך את קיבוליות הממברנה ואת התנגדות הגישה שלה.מיד לאחר הפריצה, החליפו את תמיסת האמבטיה אשלגן כלורי בתמיסת אמבט HEPES באמצעות זלוף. החל פרוטוקול רמפה של 850 אלפיות השנייה עם תוכנית המגבר. יישום פרוטוקול רמפת המתח משרה זרם פרוטון בעל משרעת גדולה על פני ה- IMM של שומן חום ללא תוספת של חומצות שומן אקסוגניות, המפעילים הנדרשים של UCPs.לאחר זלוף על ידי מעכב UCP1 גואנוזין דיפוספט או 10-millimolar מתיל בטא ציקלודקסטרין עבור מיצוי חומצת שומן ממברנה אנדוגנית, הזרם השיורי משמש כדי לקבוע את המשרעת של זרמי UCP1, אשר נעלם לחלוטין ב- IMM של עכברים לקויי UCP1. בניגוד לשומן חום, ה-IMM של רקמות שאינן שומן, כגון שרירי השלד והלב, אינו מפתח זרם פרוטון הניתן למדידה מיד לאחר הפריצה. כדי לגרום לזרם פרוטונים הניתן למדידה באמצעות AAC, חיוני ליישם את תמיסת האמבטיה HEPES המכילה מיקרומולר אחד עד שני מיקרומולרי של חומצות שומן אקסוגניות.כדי לאשר כי זרם הפרוטון הנמדד נישא על ידי AAC, חשוב ליישם מעכבים ספציפיים, carboxyatractyloside, אשר מעכבים כמעט לחלוטין את זרם הפרוטונים המוצג ב- IMM של עכברים לקויי AAC1. עיכוב קבוע אך לעולם לא מלא של דליפת פרוטונים מושג רק כאשר ADP נמצא משני צידי הממברנה כדי ליצור חילופי נוקלאוטידים פעילים באמצעות AAC. איכות הכנת המיטופלסט תשפיע על שיעור ההצלחה בהשגת תצורת המיטופלסט השלם.זה חיוני כדי לייעל את זה. לאחר שהמנגנון המולקולרי של תרמוגנזה מיטוכונדריאלית מנותח בטכניקת מהדק הטלאי, מדידת צריכת החמצן המיטוכונדרית תדגים את החשיבות של זרם פרוטונים ותרמוגנזה במיטוכונדריה שלמה. טכניקה זו פותחת את הדרך לחוקרים לחקור כל מיני מוליכות, יונים ומטבוליטים החשובים לתפקוד המיטוכונדריה.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

בדיקת רגישות חזותית על מהירות ועל כיוון התנועה של לטאות

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

מחשב שנוצר מודל החיה גירויים

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

שיטות הצמד תיקון הקלטות קיבול מן Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

לחץ לליטוש pipettes עבור Patch-clamp הקלטה משופרים

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

מדידת פרמטר-Multi של הפתיחה הנקבובית מעבר החדירות בלב עכבר מבודד המיטוכונדריה

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

הקלטת תיקון מהדק מצורף תא אחד ערוצים

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

הערכת יכולת ההפרשה של תאי הלבלב Acinar

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

בידוד של המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות תפוקה גבוהה microplate נשימה

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

השימוש של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; הדמיה Whole-איברים היסטולוגיה רקמות כמותי כדי לקבוע את ביו-הפצה של מולקולות שכותרתו fluorescently

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

בידוד של תאי שסתום ביניים עכבר ללמוד את הסתיידות של שסתום אבי העורקים במבחנה

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) ...