Name: the use of the patch-clamp technique to study the thermogenic capacity of mitochondria
Uploaded: 2021-05-03T15:00:00
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यूरी किरिचोक को उस महान विज्ञान के लिए धन्यवाद देता हूं जिसका मैं अपनी प्रयोगशाला में हिस्सा था और सहायक चर्चाओं के लिए किरिचोक प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देता हूं। मैं एएसी 1 नॉकआउट चूहों को प्रदान करने के लिए डॉ डगलस सी वालेस को भी धन्यवाद देता हूं। फंडिंग: एएमबी को अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन करियर डेवलपमेंट अवार्ड 19सीडीए 34630062 द्वारा समर्थित किया गया था।

सभी पशु प्रयोगात्मक प्रक्रियाएं जो राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के दिशानिर्देशों के अनुरूप थीं और कैलिफ़ोर्निया विश्वविद्यालय लॉस एंजिल्स संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनु...

<ol>
	<li>Divakaruni, A. S., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+and+physiology+of+mitochondrial+proton+leak.">The regulation and physiology of mitochondrial proton leak.</a> Physiology (Bethesda). 26 (3), 192-205 (2011).</li><li>Chouchani, E. T., Kazak, L., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+advances+in+adaptive+thermogenesis:+UCP1+and+beyond.">New advances in adaptive thermogenesis: UCP1 and beyond.</a> Cell Metabolism. 29 (1), 27-37 (2019).</li><li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue:+function+and+physiological+significance.">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).</li><li>Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hunt+for+the+molecular+mechanism+of+brown+fat+thermogenesis.">The hunt for the molecular mechanism of brown fat thermogenesis.</a> Biochimie. 134, 9-18 (2017).</li><li>Bertholet, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H(+)+transport+is+an+integral+function+of+the+mitochondrial+ADP/ATP+carrier.">H(+) transport is an integral function of the mitochondrial ADP/ATP carrier.</a> Nature. 571 (7766), 515-520 (2019).</li><li>Fedorenko, A., Lishko, P. V., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+fatty-acid-dependent+UCP1+uncoupling+in+brown+fat+mitochondria.">Mechanism of fatty-acid-dependent UCP1 uncoupling in brown fat mitochondria.</a> Cell. 151 (2), 400-413 (2012).</li><li>Bertholet, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+patch+clamp+of+beige+adipocytes+reveals+UCP1-positive+and+UCP1-negative+cells+both+exhibiting+futile+creatine+cycling.">Mitochondrial patch clamp of beige adipocytes reveals UCP1-positive and UCP1-negative cells both exhibiting futile creatine cycling.</a> Cell Metabolism. 25 (4), 811-822 (2017).</li><li>Kirichok, Y., Krapivinsky, G., Clapham, D. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+transmembrane+mechanisms+control+MCU-mediated+mitochondrial+Ca(2+)+uptake.">Coupled transmembrane mechanisms control MCU-mediated mitochondrial Ca(2+) uptake.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21731-21739 (2020).</li><li>Vais, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMRE+is+a+matrix+Ca(2+)+sensor+that+governs+gatekeeping+of+the+mitochondrial+Ca(2+)+uniporter.">EMRE is a matrix Ca(2+) sensor that governs gatekeeping of the mitochondrial Ca(2+) uniporter.</a> Cell Reports. 14 (3), 403-410 (2016).</li><li>Vais, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCUR1,+CCDC90A,+is+a+regulator+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">MCUR1, CCDC90A, is a regulator of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Cell Metabolism. 22 (4), 533-535 (2015).</li><li>Kamer, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MICU1+imparts+the+mitochondrial+uniporter+with+the+ability+to+discriminate+between+Ca(2+)+and+Mn(2+).">MICU1 imparts the mitochondrial uniporter with the ability to discriminate between Ca(2+) and Mn(2+).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 7960-7969 (2018).</li><li>Bertholet, A. M., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+analysis+of+the+mitochondrial+H(+)+leak+in+brown+and+beige+fat.">Patch-clamp analysis of the mitochondrial H(+) leak in brown and beige fat.</a> Frontiers in Physiology. 11, 326 (2020).</li><li>Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization,+identification,+and+excision+of+murine+adipose+depots.">Localization, identification, and excision of murine adipose depots.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52174 (2014).</li><li>Garg, V., Kirichok, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+analysis+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">Patch-clamp analysis of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Methods in Molecular Biology. 1925, 75-86 (2019).</li><li>Decker, G. L., Greenawalt, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+and+biochemical+studies+of+mitoplasts+and+outer+membranes+derived+from+French-pressed+mitochondria.+Advances+in+mitochondrial+subfractionation.">Ultrastructural and biochemical studies of mitoplasts and outer membranes derived from French-pressed mitochondria. Advances in mitochondrial subfractionation.</a> Journal of Ultrastructure Research. 59 (1), 44-56 (1977).</li><li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+electrical+currents+across+the+plasma+membrane+of+mammalian+sperm+cells.">Recording electrical currents across the plasma membrane of mammalian sperm cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), (2021).</li><li>Flaming, D. G., Brown, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropipette+puller+design:+form+of+the+heating+filament+and+effects+of+filament+width+on+tip+length+and+diameter.">Micropipette puller design: form of the heating filament and effects of filament width on tip length and diameter.</a> Journal of Neuroscience Methods. 6 (1-2), 91-102 (1982).</li><li>Klingenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ADP+and+ATP+transport+in+mitochondria+and+its+carrier.">The ADP and ATP transport in mitochondria and its carrier.</a> Biochimica and Biophysica Acta. 1778 (10), 1978-2021 (2008).</li></ol>

इस विधि लेख का उद्देश्य हाल ही में माइटोकॉन्ड्रिया पर लागू पैच-क्लैंप तकनीक को प्रस्तुत करना है, जो माइटोकॉन्ड्रियल थर्मोजेनेसिस 5,6,7,15 के लिए जिम्मेदार आईएमएम के माध्यम ?...

माइटोकॉन्ड्रिया सेल का पावरहाउस होने के लिए प्रसिद्ध हैं। दरअसल, वे रासायनिक ऊर्जा, एटीपी का प्रमुख स्रोत हैं। क्या कम ज्ञात है कि माइटोकॉन्ड्रिया भी गर्मी उत्पन्न करता है। वास्तव में, प्रत्येक माइटोकॉन्ड्रियन लगातार दो प्रकार की ऊर्जा (एटीपी और गर्मी) उत्पन्न करता है और दो ऊर्जा रूपों के बीच एक अच्छा संतुलन चयापचय सेल होमियोस्टेसिस (चित्रा 1) को परिभाषित करता है। एटीपी और गर्मी के बीच माइटोकॉन्ड्रिया ऊर्जा कैसे वितरित करता है, यह निश्चित रूप से बायोएनर्जेटिक्स के क्षेत्र में सबसे मौलिक प्रश्न है, हालांकि यह अभी भी काफी हद तक अज्ञात है। हम जानते हैं कि माइटोकॉन्ड्रियल गर्मी उत्पादन (जिसे माइटोकॉन्ड्रियल थर्मोजेनेसिस कहा जाता है) में वृद्धि, और इसके परिणामस्वरूप एटीपी उत्पादन को कम करने से ऊर्जा व्यय बढ़ जाता है और यह चयापचय सिंड्रोम1 से निपटने के सर्वोत्तम तरीकों में से एक है।
माइटोकॉन्ड्रियल थर्मोजेनेसिस आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली (आईएमएम) में एच + रिसाव से उत्पन्न होता है, जिससे गर्मी के परिणामी उत्पादन के साथ सब्सट्रेट ऑक्सीकरण और एटीपी संश्लेषण का विघटन होता है, इसलिए नाम "माइटोकॉन्ड्रियल अनकपलिंग" 1 (चित्रा 1)। यह एच + रिसाव माइटोकॉन्ड्रियल ट्रांसपोर्टर्स पर निर्भर करता है जिसे अनकपलिंग प्रोटीन (यूसीपी) कहा जाता है। यूसीपी 1 पहचाना गया पहला यूसीपी था। यह केवल थर्मोजेनिक ऊतकों, भूरे रंग की वसा और बेज वसा में व्यक्त किया जाता है जिसमें माइटोकॉन्ड्रिया गर्मी उत्पादन 2,3,4 के लिए विशिष्ट होते हैं। कंकाल की मांसपेशियों, हृदय और यकृत जैसे गैर-वसा ऊतकों में यूसीपी की पहचान विवादास्पद बनी हुई है। इन ऊतकों में माइटोकॉन्ड्रिया में गर्मी में परिवर्तित कुल माइटोकॉन्ड्रियल ऊर्जा का लगभग 25% हो सकता है, जो पूरे शरीर के शरीर विज्ञान को काफी प्रभावित कर सकताहै 1. कोर शरीर के तापमान को बनाए रखने के अलावा, माइटोकॉन्ड्रियल थर्मोजेनेसिस कैलोरी को कम करके आहार-प्रेरित मोटापे को भी रोकता है। इसके अलावा, यह कोशिकाओं को ऑक्सीडेटिव क्षति से बचाने के लिए माइटोकॉन्ड्रिया द्वारा प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के उत्पादन को कम करताहै 1. इस प्रकार, माइटोकॉन्ड्रियल थर्मोजेनेसिस सामान्य उम्र बढ़ने, उम्र से संबंधित अपक्षयी विकारों और ऑक्सीडेटिव तनाव से जुड़ी अन्य स्थितियों में शामिल है, जैसे कि इस्किमिया-रीपरफ्यूजन। इसलिए, माइटोकॉन्ड्रियल थर्मोजेनेसिस सेलुलर चयापचय का एक शक्तिशाली नियामक है, और इस मौलिक प्रक्रिया की एक यांत्रिक समझ माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन से जुड़े कई विकृतियों का मुकाबला करने के लिए चिकित्सीय रणनीतियों के विकास को बढ़ावा देगी।
माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन सेलुलर चयापचय में माइटोकॉन्ड्रियल थर्मोजेनेसिस की महत्वपूर्ण भूमिका को प्रकट करने वाली पहली तकनीक थी और अभी भी समुदाय1 में सबसे लोकप्रिय है। यह तकनीक माइटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रॉन ट्रांसपोर्ट चेन (ईटीसी) द्वारा ऑक्सीजन की खपत के माप पर आधारित है जो माइटोकॉन्ड्रियल एच + रिसाव सक्रिय होने पर बढ़ जाती है। यह तकनीक, हालांकि वाद्य, सीधे आईएमएम1 में माइटोकॉन्ड्रियल एच + रिसाव का अध्ययन नहीं कर सकती है, जिससे इसके लिए जिम्मेदार प्रोटीन की सटीक पहचान और लक्षण वर्णन मुश्किल हो जाता है, खासकर गैर-वसा ऊतकों में जिसमें एटीपी उत्पादन की तुलना में गर्मी उत्पादन माध्यमिक होता है। हाल ही में, माइटोकॉन्ड्रिया पर लागू पैच-क्लैंप तकनीक के विकास ने विभिन्न ऊतकों 5,6,7 में पूरे आईएमएम में एच + रिसाव का पहला प्रत्यक्ष अध्ययन प्रदान किया।
पूरे आईएमएम के माइटोकॉन्ड्रियल पैच-क्लैंप को पहली बार किरिचोक एट अल द्वारा प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से स्थापित किया गया था। उन्होंने सीओएस -7 सेल लाइनों 8 से मिटोप्लास्ट का उपयोग करके 2004 में माइटोकॉन्ड्रियल कैल्शियम यूनिपोर्टर (एमसीयू) धाराओं के पहले प्रत्यक्ष माप का वर्णनकिया। बाद में, किरिचोक प्रयोगशाला ने माउस9 और ड्रोसोफिला ऊतकों9 के आईएमएम से कैल्शियम धाराओं को दिखाया। अन्य प्रयोगशालाएं अब नियमित रूप से एमसीयू10,11,12,13,14 के बायोफिजिकल गुणों का अध्ययन करने के लिए इस तकनीक का उपयोग करती हैं। पोटेशियम और क्लोराइड आचरण का पूरा आईएमएम पैच-क्लैंप विश्लेषण भी संभव है और कई पत्रों में उल्लेख किया गया है लेकिन अभी तक प्रकाशन 6,7,9 का मुख्य विषय नहीं रहा है। आईएमएम में एच + धाराओं का पहला माप 2012 में माउस ब्राउन वसा माइटोकॉन्ड्रिया6 से और 20177 में माउस बेज वसा माइटोकॉन्ड्रिया से रिपोर्ट किया गया था। यह वर्तमान थर्मोजेनिक ऊतकों, यूसीपी 1 6,7 के विशिष्ट अनकपलिंग प्रोटीन के कारण है। 2019 में प्रकाशित हालिया काम ने एएसी को दिल और कंकाल की मांसपेशियों जैसे गैर-वसा ऊतकों में माइटोकॉन्ड्रियल एच + रिसाव के लिए जिम्मेदार मुख्य प्रोटीन के रूप में वर्णितकिया।
यह अनूठा दृष्टिकोण अब माइटोकॉन्ड्रियल आयन चैनलों और माइटोकॉन्ड्रियल थर्मोजेनेसिस के लिए जिम्मेदार ट्रांसपोर्टरों के प्रत्यक्ष उच्च-रिज़ॉल्यूशन कार्यात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है। विधि के विस्तार को सुविधाजनक बनाने के लिए और माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन जैसे अन्य अध्ययनों के पूरक के लिए, यूसीपी 1 और एएसी द्वारा किए गए एच + धाराओं को मापने के लिए नीचे एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। तीन महत्वपूर्ण चरणों का वर्णन किया गया है: 1) माउस ब्राउन वसा से माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव एएसी-निर्भर एच + वर्तमान का विश्लेषण करने के लिए दिल से यूसीपी 1-निर्भर एच + वर्तमान और माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव का विश्लेषण करने के लिए, 2) बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली (ओएमएम) के यांत्रिक टूटने के लिए फ्रांसीसी प्रेस के साथ मिटोप्लास्ट की तैयारी, 3) पूरे आईएमएम में यूसीपी 1 और एएसी-निर्भर एच + धाराओं की पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% gelatin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60X water immersion objective, numerical aperture 1.20</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO60XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF150-86-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1550B Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Press</td>
			<td>Glen Mills</td>
			<td>5500-000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inversed Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71 or IX73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Forge</td>
			<td>(Narishige)</td>
			<td>MF-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanupulator MPC-385</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>FG-MPC325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode holder for agar bridge</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH3F4515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>(Sutter Instruments)</td>
			<td>P97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Cell for French Press</td>
			<td>Glen Mills</td>
			<td>5500-FA-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIXER IKA 6-2000RPM</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-50705-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 100X magnification</td>
			<td>Nikon&#160; lens</td>
			<td>MPlan 100/0.80 ELWD 210/0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pClamp 10</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-24E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>358039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75 009 521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table</td>
			<td>Newport</td>
			<td>VIS3036-SG2-325A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-gluconic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>M4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>3777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>60128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>63068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>331635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisBase</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisCl</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of the patch-clamp technique to study the thermogenic capacity of mitochondria

माइटोकॉन्ड्रियल थर्मोजेनेसिस (जिसे माइटोकॉन्ड्रियल अनकपलिंग के रूप में भी जाना जाता है) चयापचय सिंड्रोम से निपटने के लिए ऊर्जा व्यय बढ़ाने के लिए सबसे आशाजनक लक्ष्यों में से एक है। थर्मोजेनिक ऊतक जैसे भूरे और बेज वसा गर्मी उत्पादन के लिए अत्यधिक विशिष्ट माइटोकॉन्ड्रिया विकसित करते हैं। अन्य ऊतकों के माइटोकॉन्ड्रिया, जो मुख्य रूप से एटीपी का उत्पादन करते हैं, कुल माइटोकॉन्ड्रियल ऊर्जा उत्पादन के 25% तक गर्मी में परिवर्तित होते हैं और इसलिए, पूरे शरीर के शरीर विज्ञान पर काफी प्रभाव डाल सकते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल थर्मोजेनेसिस न केवल शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए आवश्यक है, बल्कि आहार-प्रेरित मोटापे को भी रोकता है और कोशिकाओं को ऑक्सीडेटिव क्षति से बचाने के लिए प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के उत्पादन को कम करता है। चूंकि माइटोकॉन्ड्रियल थर्मोजेनेसिस सेलुलर चयापचय का एक प्रमुख नियामक है, इसलिए इस मौलिक प्रक्रिया की एक यांत्रिक समझ माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन से जुड़े कई विकृतियों का मुकाबला करने के लिए चिकित्सीय रणनीतियों के विकास में मदद करेगी। महत्वपूर्ण रूप से, सटीक आणविक तंत्र जो माइटोकॉन्ड्रिया में थर्मोजेनेसिस के तीव्र सक्रियण को नियंत्रित करते हैं, खराब रूप से परिभाषित हैं। जानकारी की यह कमी काफी हद तक अनकपलिंग प्रोटीन के प्रत्यक्ष माप के तरीकों की कमी के कारण है। माइटोकॉन्ड्रिया पर लागू पैच-क्लैंप पद्धति के हालिया विकास ने पहली बार, माइटोकॉन्ड्रियल थर्मोजेनेसिस की उत्पत्ति पर घटना का प्रत्यक्ष अध्ययन, आईएमएम के माध्यम से एच + रिसाव, और इसके लिए जिम्मेदार माइटोकॉन्ड्रियल ट्रांसपोर्टरों का पहला बायोफिजिकल लक्षण वर्णन सक्षम किया, अनकपलिंग प्रोटीन 1 (यूसीपी 1), भूरे और बेज वसा के विशिष्ट, और अन्य सभी ऊतकों के लिए एडीपी / यह अनूठा दृष्टिकोण एच + रिसाव और माइटोकॉन्ड्रियल थर्मोजेनेसिस को नियंत्रित करने वाले तंत्रों में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा और चयापचय सिंड्रोम का मुकाबला करने के लिए उन्हें कैसे लक्षित किया जा सकता है। यह पेपर आईएमएम के माध्यम से एच + धाराओं को सीधे मापकर उनकी थर्मोजेनिक क्षमता का अध्ययन करने के लिए माइटोकॉन्ड्रिया पर लागू पैच-क्लैंप पद्धति का वर्णन करता है।

माइटोकॉन्ड्रिया पर लागू पैच-क्लैंप पद्धति के विकास ने आईएमएम और माइटोकॉन्ड्रियल ट्रांसपोर्टर्स, यूसीपी 1 और एएसी के माध्यम से एच + रिसाव का पहला प्रत्यक्ष अध्ययन प्रदान किया, जो इसके लिए जिम्मेदा?...

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The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria

यह विधि लेख पैच-क्लैंप तकनीक के साथ आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली में एच + रिसाव को मापने में मुख्य चरणों का विवरण देता है, जो माइटोकॉन्ड्रिया की थर्मोजेनिक क्षमता का अध्ययन करने के लिए एक नया दृष्टिकोण है।

माइटोकॉन्ड्रिया की थर्मोजेनिक क्षमता का अध्ययन करने के लिए पैच-क्लैंप तकनीक का उपयोग

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat ...

यह प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली में माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटॉन रिसाव को सीधे मापकर माइटोकॉन्ड्रिया की थर्मोजेनिक क्षमता का अध्ययन करने के लिए पैच क्लैंप तकनीक का उपयोग कैसे किया जा सकता है। आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली के माध्यम से प्रोटॉन वर्तमान का प्रत्यक्ष माप माइटोकॉन्ड्रियल थर्मोजेनेसिस के लिए जिम्मेदार आणविक तंत्र की पहचान करने और ठीक से चिह्नित करने में मदद करता है। यह तकनीक न केवल आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली में प्रोटॉन वर्तमान को मापने की अनुमति देती है, बल्कि माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के लिए महत्वपूर्ण अन्य आचरणों का अध्ययन करने की भी अनुमति देती है, जैसे कैल्शियम या एडेनिन न्यूक्लियोटाइड जैसे मेटाबोलाइट्स।अपनी पीठ पर euthanized माउस की स्थिति और स्प्रे अल्कोहल साफ और बालों को गीला करने के लिए। फिर, वक्ष पर दो सेंटीमीटर चीरा बनाएं। चिमटी के साथ त्वचा को पकड़ने के बाद, जानवर की छाती से दिल को विच्छेदित करें और ठंडे अलगाव समाधान के पांच मिलीलीटर के साथ 10 मिलीलीटर बीकर में सभी रक्त को हटाने के लिए इसे कुल्लाएं।एक बार जब दिल को रक्त के निशान से साफ कर दिया जाता है, तो इसे एक और 10-मिलीलीटर बीकर में स्थानांतरित करें जिसमें पांच मिलीलीटर ठंडे अलगाव बफर होते हैं और इसे पतले टुकड़ों में काट लें। फिर, इसे बर्फ-ठंडा 10-मिलीलीटर ग्लास होमोजेनाइज़र में स्थानांतरित करें। प्रति मिनट 275 घूर्णन की नियंत्रित गति पर छह कोमल स्ट्रोक के साथ बर्फ पर प्रीकट ऊतक को समरूप करने के लिए एक ओवरहेड स्टिरर का उपयोग करें।होमोजेनेट को 15-मिलीलीटर बर्फ-ठंडे शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें और नाभिक और अखंड कोशिकाओं को गोली देने के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 700 बार जी पर इसे अपकेंद्रित्र करें। एक ताजा 15 मिलीलीटर ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला ले लीजिए और इसे बर्फ पर रखें। माइटोकॉन्ड्रिया युक्त गोली प्राप्त करने के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 8, 500 बार जी पर सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र।बर्फ-ठंडे हाइपरटोनिक मैनीटोल बफर के 3.8 मिलीलीटर में माइटोकॉन्ड्रियल गोली को फिर से निलंबित करें और 10 से 15 मिनट के लिए बर्फ पर माइटोकॉन्ड्रियल निलंबन को सेते हैं। फ्रांसीसी प्रेस के एक प्रशीतित मिनी-दबाव सेल में माइटोकॉन्ड्रियल हाइपरटोनिक मैनिटोल निलंबन भरें। फिर, सेल को फ्रेंच प्रेस पर रखें।फिर, फ्रांसीसी प्रेस के कम मोड का चयन करें और ब्राउन वसा माइटोकॉन्ड्रिया के लिए डायल पर 110 पर मिनी-दबाव सेल के माध्यम से निलंबन को संपीड़ित करें, और हृदय माइटोकॉन्ड्रिया के लिए 140 पर, यह सुनिश्चित करते हुए कि निलंबन मिनी-प्रेशर सेल से बाहर आता है प्रति सेकंड लगभग एक बूंद की दर से। एक 15 मिलीलीटर बर्फ ठंडा शंक्वाकार ट्यूब में बूंदों को इकट्ठा करें। चार डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 10, 500 बार जी पर निलंबन अपकेंद्रित्र।बर्फ-ठंडे हाइपरटोनिक पोटेशियम क्लोराइड बफर के 0.5 से 2 मिलीलीटर में मिटोप्लास्ट गोली को फिर से निलंबित करें और बर्फ पर निलंबन को स्टोर करें। माइक्रोपिपेट पुलर का उपयोग करके रिकॉर्डिंग के दिन बोरोसिलिकेट ग्लास फिलामेंट्स को खींचें, उच्च स्तर की प्रजनन क्षमता के साथ पिपेट उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले पुलर पर एक कार्यक्रम स्थापित करें। खींचने वाले के भीतर एक ग्लास फिलामेंट डालें और एक बोरोसिलिकेट फिलामेंट से लगभग दो समान पैच पिपेट प्राप्त करने के लिए खींचें।कार्यक्रम को समायोजित करें जब पिपेट खींचने वाले के हीटिंग बॉक्स फिलामेंट की उम्र बढ़ने के कारण चक्र खींचने के बीच असंगत हो जाते हैं। पिपेट पॉलिशर के अंदर विंदुक की स्थिति और इसे आग पॉलिश करने के लिए 100X आवर्धन के तहत फिलामेंट के पास टिप जगह। टिप वक्र को बंद किए बिना या नुकसान पहुंचाए बिना फिलामेंट को गर्म करने के लिए पैर पेडल को कई बार दबाएं।जब तक पिपेट में 25 और 35 मेगाओहम के बीच प्रतिरोध न हो तब तक पोलिश प्राप्त किया जाता है जब टीएमए-आधारित विंदुक समाधान से भरा होता है। पूर्व-सेतेज कवर 0.1% जिलेटिन के साथ फिसल जाता है ताकि मिटोप्लास्ट आसंजन को कम किया जा सके और उन्हें मिटोप्लास्ट निलंबन जमा करने से पहले पोटेशियम क्लोराइड स्नान समाधान के साथ कुल्ला जा सके। पोटेशियम क्लोराइड स्नान समाधान के 500 माइक्रोलीटर के साथ केंद्रित मिटोप्लास्ट निलंबन के लगभग 35 माइक्रोलीटर को मिलाकर एक कच्चे कमजोर पड़ने को तैयार करें और इसे चार-अच्छी तरह से प्लेट के कुएं में पहले रखे गए कवर स्लिप्स पर रखें।कवर स्लिप के नीचे तलछट के लिए मिटोप्लास्ट के लिए 15 से 20 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं। पोटेशियम क्लोराइड स्नान समाधान के लगभग 50 माइक्रोलीटर के साथ स्नान कक्ष को पूरी तरह से भरें और एक तुला टिप के साथ पतली माइक्रोडिसेक्शन चिमटी का उपयोग करके कक्ष के भीतर मिटोप्लास्ट के साथ एक कवर पर्ची को स्थानांतरित करें। कवर स्लिप पर मिटोप्लास्ट को स्थिर रखने के लिए कक्ष को छेड़छाड़ किए बिना कक्ष के निचले भाग में कवर स्लिप को व्यवस्थित करें।60 एक्स उद्देश्य के साथ माइक्रोस्कोप के नीचे कवर स्लिप को स्कैन करके एक व्यक्तिगत गैर-चिपकने वाला मिटोप्लास्ट चुनें। विंदुक समाधान के साथ विंदुक लोड और यह विंदुक धारक में जगह है। एक माइक्रोमैनिपुलेटर के साथ स्नान समाधान में विंदुक लाएं और आईएमएम के करीब पहुंचने के लिए इसे चयनित मिटोप्लास्ट के ठीक ऊपर ले जाएं।शून्य मिलीवोल्ट पर झिल्ली क्षमता पकड़ो और एम्पलीफायर कार्यक्रम में झिल्ली परीक्षण कमांड का उपयोग करके 10 मिलीवोल्ट दालों को लागू करें। आईएमएम के साथ जल्दी से एक गीगासेल बनाने के लिए थोड़ा नकारात्मक दबाव लागू करें। प्रयोग के दौरान विंदुक बहाव के कारण सील टूटने से बचने के लिए उन्हें कवर पर्ची से दूर रखने के लिए संलग्न मिटोप्लास्ट के साथ विंदुक बढ़ाएं।ब्रेक-इन के बाद मिटोप्लास्ट झिल्ली के लिए सही समाई माप प्राप्त करने के लिए पूरे-मिटोप्लास्ट कॉन्फ़िगरेशन का परीक्षण करने से पहले एम्पलीफायर प्रोग्राम में झिल्ली परीक्षण कमांड के साथ आवारा समाई यात्रियों की क्षतिपूर्ति करें। कांच विंदुक के तहत झिल्ली पैच टूटना और पूरे mitoplast विन्यास प्राप्त करने के लिए एम्पलीफायर कार्यक्रम के साथ अल्पकालिक वोल्टेज दालों लागू होते हैं। ब्रेक-इन के बाद, झिल्ली समाई और इसके पहुंच प्रतिरोध का आकलन करने के लिए एम्पलीफायर कार्यक्रम के झिल्ली परीक्षण विकल्प के साथ समाई यात्रियों को फिट करें।ब्रेक-इन के तुरंत बाद, पोटेशियम क्लोराइड स्नान समाधान को छिड़काव के माध्यम से एचईपीईएस स्नान समाधान के साथ बदलें। एम्पलीफायर प्रोग्राम के साथ 850 मिलीसेकंड रैंप प्रोटोकॉल लागू करें। वोल्टेज रैंप प्रोटोकॉल का अनुप्रयोग बहिर्जात फैटी एसिड के अलावा, यूसीपी के आवश्यक सक्रियक के बिना भूरे रंग की वसा के आईएमएम में एक बड़े आयाम प्रोटॉन वर्तमान को प्रेरित करता है।अंतर्जात झिल्ली फैटी एसिड निष्कर्षण के लिए या तो यूसीपी 1 अवरोधक गुआनोसिन डिफॉस्फेट या 10-मिलीमोलर मिथाइल बीटा साइक्लोडेक्सट्रिन द्वारा छिड़काव के बाद, अवशिष्ट वर्तमान का उपयोग यूसीपी 1 धाराओं के आयाम को निर्धारित करने के लिए किया जाता है, जो यूसीपी 1 की कमी वाले चूहों के आईएमएम में पूरी तरह से गायब हो जाता है। भूरे रंग की वसा के विपरीत, कंकाल की मांसपेशियों और हृदय जैसे गैर-वसा ऊतकों का आईएमएम, ब्रेक-इन के तुरंत बाद एक औसत दर्जे का प्रोटॉन वर्तमान विकसित नहीं करता है। एएसी के माध्यम से एक औसत दर्जे का प्रोटॉन वर्तमान को प्रेरित करने के लिए, बहिर्जात फैटी एसिड के एक से दो-माइक्रोमोलर युक्त एचईपीईएस स्नान समाधान को लागू करना आवश्यक है।यह पुष्टि करने के लिए कि मापा गया प्रोटॉन वर्तमान एएसी द्वारा किया जाता है, विशिष्ट अवरोधकों, कार्बोक्सियाट्रैक्टिलोसाइड को लागू करना महत्वपूर्ण है, जो एएसी 1-कमी वाले चूहों के आईएमएम में दिखाए गए प्रोटॉन वर्तमान को लगभग पूरी तरह से रोकता है। प्रोटॉन रिसाव का एक निरंतर लेकिन कभी भी पूर्ण निषेध केवल तभी प्राप्त किया जाता है जब एडीपी एएसी के माध्यम से एक सक्रिय न्यूक्लियोटाइड एक्सचेंज उत्पन्न करने के लिए झिल्ली के दोनों किनारों पर मौजूद होता है। मिटोप्लास्ट तैयारी की गुणवत्ता पूरे-मिटोप्लास्ट कॉन्फ़िगरेशन को प्राप्त करने में सफलता दर को प्रभावित करेगी।इसे ऑप्टिमाइज़ करना जरूरी है। एक बार माइटोकॉन्ड्रियल थर्मोजेनेसिस के आणविक तंत्र को पैच क्लैंप तकनीक के साथ विच्छेदित किया जाता है, माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन खपत का माप बरकरार माइटोकॉन्ड्रिया में प्रोटॉन वर्तमान और थर्मोजेनेसिस के महत्व को प्रदर्शित करेगा। यह तकनीक शोधकर्ताओं के लिए माइटोकॉन्ड्रिया के कामकाज के लिए महत्वपूर्ण सभी प्रकार के आचरण, आयनों और मेटाबोलाइट्स का पता लगाने का रास्ता खोलती है।

Research

JoVE Journal

Biology

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The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

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का उपयोग<em&gt; पूर्व विवो</em&gt; पूरे अंग इमेजिंग और मात्रात्मक ऊतक प्रोटोकॉल fluorescently लेबल अणु की जैव वितरण निर्धारित करने के लिए

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

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The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) ...