Name: the use of the patch-clamp technique to study the thermogenic capacity of mitochondria
Uploaded: 2021-05-03T15:00:00
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Ringrazio il Dr. Yuriy Kirichok per la grande scienza di cui ho fatto parte nel suo laboratorio e i membri del laboratorio Kirichok per le utili discussioni. Ringrazio anche il Dr. Douglas C. Wallace per aver fornito topi knockout AAC1 . Finanziamento: A.M.B è stato supportato da un American Heart Association Career Development Award 19CDA34630062.

Tutte le procedure sperimentali sugli animali che sono state eseguite sono conformi alle linee guida del National Institutes of Health e sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università della California di Los Angeles.
NOTA: La procedura di isolamento mitocondriale si basa sulla centrifugazione differenziale e varia leggermente da tessuto a tessuto. Ad esempio, poiché il tessuto adiposo bruno è estremamente ricco di lipidi, richiede u...

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	<li>Divakaruni, A. S., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+and+physiology+of+mitochondrial+proton+leak.">The regulation and physiology of mitochondrial proton leak.</a> Physiology (Bethesda). 26 (3), 192-205 (2011).</li><li>Chouchani, E. T., Kazak, L., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+advances+in+adaptive+thermogenesis:+UCP1+and+beyond.">New advances in adaptive thermogenesis: UCP1 and beyond.</a> Cell Metabolism. 29 (1), 27-37 (2019).</li><li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue:+function+and+physiological+significance.">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).</li><li>Nicholls, D. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+transmembrane+mechanisms+control+MCU-mediated+mitochondrial+Ca(2+)+uptake.">Coupled transmembrane mechanisms control MCU-mediated mitochondrial Ca(2+) uptake.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21731-21739 (2020).</li><li>Vais, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMRE+is+a+matrix+Ca(2+)+sensor+that+governs+gatekeeping+of+the+mitochondrial+Ca(2+)+uniporter.">EMRE is a matrix Ca(2+) sensor that governs gatekeeping of the mitochondrial Ca(2+) uniporter.</a> Cell Reports. 14 (3), 403-410 (2016).</li><li>Vais, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCUR1,+CCDC90A,+is+a+regulator+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">MCUR1, CCDC90A, is a regulator of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Cell Metabolism. 22 (4), 533-535 (2015).</li><li>Kamer, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MICU1+imparts+the+mitochondrial+uniporter+with+the+ability+to+discriminate+between+Ca(2+)+and+Mn(2+).">MICU1 imparts the mitochondrial uniporter with the ability to discriminate between Ca(2+) and Mn(2+).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 7960-7969 (2018).</li><li>Bertholet, A. M., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+analysis+of+the+mitochondrial+H(+)+leak+in+brown+and+beige+fat.">Patch-clamp analysis of the mitochondrial H(+) leak in brown and beige fat.</a> Frontiers in Physiology. 11, 326 (2020).</li><li>Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+and+biochemical+studies+of+mitoplasts+and+outer+membranes+derived+from+French-pressed+mitochondria.+Advances+in+mitochondrial+subfractionation.">Ultrastructural and biochemical studies of mitoplasts and outer membranes derived from French-pressed mitochondria. Advances in mitochondrial subfractionation.</a> Journal of Ultrastructure Research. 59 (1), 44-56 (1977).</li><li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+electrical+currents+across+the+plasma+membrane+of+mammalian+sperm+cells.">Recording electrical currents across the plasma membrane of mammalian sperm cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), (2021).</li><li>Flaming, D. G., Brown, K. 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Questo articolo sul metodo si propone di presentare la tecnica patch-clamp recentemente applicata ai mitocondri, un nuovo approccio per studiare direttamente la perdita di H+ attraverso l'IMM responsabile della termogenesi mitocondriale 5,6,7,15. Questa tecnica non è limitata ai tessuti e può anche essere utilizzata per analizzare la perdita di H + e altre conduttanze de...

I mitocondri sono famosi per essere la centrale elettrica della cellula. In effetti, sono la principale fonte di energia chimica, l'ATP. Ciò che è meno noto è che anche i mitocondri generano calore. Infatti, ogni mitocondrio genera costantemente i due tipi di energie (ATP e calore) e un sottile equilibrio tra le due forme energetiche definisce l'omeostasi cellulare metabolica (Figura 1). Come i mitocondri distribuiscano energia tra ATP e calore è sicuramente la questione più fondamentale nel campo della bioenergetica, anche se è ancora in gran parte sconosciuta. Sappiamo che aumentare la produzione di calore mitocondriale (chiamata termogenesi mitocondriale) e di conseguenza ridurre la produzione di ATP aumenta il dispendio energetico e questo è uno dei modi migliori per combattere la sindrome metabolica1.
La termogenesi mitocondriale ha origine dalla perdita di H+ attraverso la membrana mitocondriale interna (IMM), che porta al disaccoppiamento dell'ossidazione del substrato e alla sintesi di ATP con conseguente produzione di calore, da cui il nome "disaccoppiamento mitocondriale"1 (Figura 1). Questa perdita di H + dipende dai trasportatori mitocondriali chiamati proteine di disaccoppiamento (UCP). UCP1 è stato il primo UCP identificato. È espresso solo in tessuti termogenici, grasso bruno e grasso beige in cui i mitocondri sono specializzati per la produzione di calore 2,3,4. L'identità di UCP nei tessuti non adiposi come il muscolo scheletrico, il cuore e il fegato, è rimasta controversa. I mitocondri in questi tessuti possono avere circa il 25% dell'energia mitocondriale totale convertita in calore, che può avere un impatto significativo sulla fisiologia di tutto il corpo1. Oltre a mantenere la temperatura corporea interna, la termogenesi mitocondriale previene anche l'obesità indotta dalla dieta riducendo le calorie. Inoltre, riduce la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) da parte dei mitocondri per proteggere le cellule dal danno ossidativo1. Pertanto, la termogenesi mitocondriale è coinvolta nel normale invecchiamento, nei disturbi degenerativi legati all'età e in altre condizioni che coinvolgono lo stress ossidativo, come l'ischemia-riperfusione. Pertanto, la termogenesi mitocondriale è un potente regolatore del metabolismo cellulare e una comprensione meccanicistica di questo processo fondamentale promuoverà lo sviluppo di strategie terapeutiche per combattere molte patologie associate alla disfunzione mitocondriale.
La respirazione mitocondriale è stata la prima tecnica a rivelare il ruolo cruciale della termogenesi mitocondriale nel metabolismo cellulare ed è ancora la più popolare nella comunità1. Questa tecnica si basa sulla misurazione del consumo di ossigeno da parte della catena di trasporto degli elettroni mitocondriale (ETC) che aumenta quando viene attivata la perdita mitocondriale di H+. Questa tecnica, sebbene strumentale, non può studiare direttamente la perdita mitocondriale di H+ attraverso l'IMM1, rendendo così difficile l'identificazione e la caratterizzazione precisa delle proteine responsabili, in particolare nei tessuti non adiposi in cui la produzione di calore è secondaria rispetto alla produzione di ATP. Recentemente, lo sviluppo della tecnica patch-clamp applicata ai mitocondri, ha fornito il primo studio diretto della perdita di H+ attraverso l'intero IMM in vari tessuti 5,6,7.
Il patch-clamp mitocondriale dell'intero IMM è stato stabilito per la prima volta in modo riproducibile da Kirichok et al.8. Hanno descritto la prima misurazione diretta delle correnti dell'uniporter di calcio mitocondriale (MCU) nel 2004 utilizzando mitoplasti delle linee cellulari COS-78. Più tardi, il laboratorio kirichok ha mostrato correnti di calcio da IMM dei tessuti di topo9 e Drosophila 9. Altri laboratori ora usano abitualmente questa tecnica per studiare le proprietà biofisiche di MCU 10,11,12,13,14. È anche possibile l'analisi intera del patch-clamp IMM della conduttanza di potassio e cloruro ed è stata menzionata in diversi articoli, ma non è ancora stata l'oggetto principale di una pubblicazione 6,7,9. La prima misurazione delle correnti H + attraverso l'IMM è stata riportata nel 2012 dai mitocondri di grasso bruno del topo6 e dai mitocondri di grasso beige del topo nel 20177. Questa corrente è dovuta alla specifica proteina di disaccoppiamento dei tessuti termogenici, UCP1 6,7. Recenti lavori pubblicati nel 2019 hanno caratterizzato l'AAC come la principale proteina responsabile della perdita di H+ mitocondriale nei tessuti non adiposi come il cuore e il muscolo scheletrico5.
Questo approccio unico consente ora l'analisi funzionale diretta ad alta risoluzione dei canali ionici mitocondriali e dei trasportatori responsabili della termogenesi mitocondriale. Per facilitare l'espansione del metodo e per integrare altri studi come la respirazione mitocondriale, di seguito viene descritto un protocollo dettagliato per misurare le correnti H + trasportate da UCP1 e AAC. Vengono descritti tre passaggi importanti: 1) isolamento mitocondriale dal grasso bruno del topo per analizzare la corrente H+ dipendente da UCP1 e l'isolamento mitocondriale dal cuore per analizzare la corrente H+ dipendente da AAC, 2) preparazione di mitoplasti con una pressa francese per la rottura meccanica della membrana mitocondriale esterna (OMM), 3) registrazioni patch-clamp di correnti H+ UCP1 e AAC-dipendenti su tutto l'IMM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% gelatin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60X water immersion objective, numerical aperture 1.20</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO60XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF150-86-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1550B Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Press</td>
			<td>Glen Mills</td>
			<td>5500-000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inversed Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71 or IX73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Forge</td>
			<td>(Narishige)</td>
			<td>MF-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanupulator MPC-385</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>FG-MPC325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode holder for agar bridge</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH3F4515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>(Sutter Instruments)</td>
			<td>P97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Cell for French Press</td>
			<td>Glen Mills</td>
			<td>5500-FA-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIXER IKA 6-2000RPM</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-50705-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 100X magnification</td>
			<td>Nikon&#160; lens</td>
			<td>MPlan 100/0.80 ELWD 210/0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pClamp 10</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-24E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>358039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75 009 521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table</td>
			<td>Newport</td>
			<td>VIS3036-SG2-325A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-gluconic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>M4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>3777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>60128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>63068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>331635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisBase</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisCl</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of the patch-clamp technique to study the thermogenic capacity of mitochondria

La termogenesi mitocondriale (nota anche come disaccoppiamento mitocondriale) è uno degli obiettivi più promettenti per aumentare il dispendio energetico per combattere la sindrome metabolica. I tessuti termogenici come i grassi marroni e beige sviluppano mitocondri altamente specializzati per la produzione di calore. Anche i mitocondri di altri tessuti, che producono principalmente ATP, convertono fino al 25% della produzione totale di energia mitocondriale in calore e possono, quindi, avere un impatto considerevole sulla fisiologia di tutto il corpo. La termogenesi mitocondriale non è solo essenziale per mantenere la temperatura corporea, ma previene anche l'obesità indotta dalla dieta e riduce la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) per proteggere le cellule dal danno ossidativo. Poiché la termogenesi mitocondriale è un regolatore chiave del metabolismo cellulare, una comprensione meccanicistica di questo processo fondamentale aiuterà nello sviluppo di strategie terapeutiche per combattere molte patologie associate alla disfunzione mitocondriale. È importante sottolineare che i precisi meccanismi molecolari che controllano l'attivazione acuta della termogenesi nei mitocondri sono scarsamente definiti. Questa mancanza di informazioni è in gran parte dovuta alla scarsità di metodi per la misurazione diretta delle proteine disaccoppiate. Il recente sviluppo della metodologia patch-clamp applicata ai mitocondri ha permesso, per la prima volta, lo studio diretto del fenomeno all'origine della termogenesi mitocondriale, la fuoriuscita di H+ attraverso l'IMM, e la prima caratterizzazione biofisica dei trasportatori mitocondriali responsabili di esso, la proteina di disaccoppiamento 1 (UCP1), specifica dei grassi bruni e beige, e il trasportatore ADP/ATP (AAC) per tutti gli altri tessuti. Questo approccio unico fornirà nuove informazioni sui meccanismi che controllano la perdita di H + e la termogenesi mitocondriale e su come possono essere mirati a combattere la sindrome metabolica. Questo articolo descrive la metodologia patch-clamp applicata ai mitocondri per studiare la loro capacità termogenica misurando direttamente le correnti H + attraverso l'IMM.

Lo sviluppo della metodologia patch-clamp applicata ai mitocondri ha fornito il primo studio diretto della perdita di H+ attraverso l'IMM e i trasportatori mitocondriali, UCP1 e AAC, che ne sono responsabili. L'analisi elettrofisiologica delle perdite H+ dipendenti da UCP1 e AAC può fornire una prima occhiata alla capacità termogenica dei mitocondri. La sezione dei risultati descrive le procedure standard per misurare la perdita di H+ tramite UCP1 e AAC.
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The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria

Questo articolo sul metodo descrive in dettaglio i passaggi principali nella misurazione della perdita di H + attraverso la membrana mitocondriale interna con la tecnica patch-clamp, un nuovo approccio per studiare la capacità termogenica dei mitocondri.

L'uso della tecnica Patch-Clamp per studiare la capacità termogenica dei mitocondri

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat ...

Questo protocollo descrive come la tecnica del patch clamp può essere utilizzata per studiare la capacità termogenica dei mitocondri misurando direttamente la perdita di protoni mitocondriali attraverso la membrana mitocondriale interna. La misurazione diretta della corrente protonica attraverso la membrana mitocondriale interna aiuta a identificare e caratterizzare con precisione i meccanismi molecolari responsabili della termogenesi mitocondriale. Questa tecnica consente non solo di misurare la corrente protonica attraverso la membrana mitocondriale interna, ma anche di studiare altre conduttanze importanti per la funzione mitocondriale, come il calcio o metaboliti come i nucleotidi adeninici.Posizionare il mouse eutanasizzato sulla schiena e spruzzare alcool per pulire e bagnare i capelli. Quindi, fai un'incisione di due centimetri sul torace. Dopo aver afferrato la pelle con una pinzetta, sezionare il cuore dal petto dell'animale e risciacquarlo per rimuovere tutto il sangue in un becher da 10 millilitri con cinque millilitri di soluzione di isolamento a freddo.Una volta che il cuore è stato ripulito da tracce di sangue, trasferirlo in un altro becher da 10 millilitri contenente cinque millilitri di tampone di isolamento a freddo e tagliarlo in pezzi sottili. Quindi, trasferirlo in un omogeneizzatore di vetro da 10 millilitri raffreddato a ghiaccio. Utilizzare un agitatore sopraelevato per omogeneizzare il tessuto pretagliato sul ghiaccio con sei colpi delicati a una velocità controllata di 275 rotazioni al minuto.Trasferire l'omogeneizzato in un tubo conico ghiacciato da 15 millilitri e centrifugarlo a 700 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius per pellettare i nuclei e le cellule ininterrotte. Raccogliere il surnatante in un tubo fresco da 15 millilitri e metterlo sul ghiaccio. Centrifugare il surnatante a 8.500 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius per ottenere un pellet contenente i mitocondri.Risospendare il pellet mitocondriale in 3,8 millilitri di tampone di mannitolo ipertonico ghiacciato e incubare la sospensione mitocondriale su ghiaccio per 10-15 minuti. Riempire la sospensione di mannitolo ipertonico mitocondriale in una mini-cella di pressione refrigerata della stampa francese. Quindi, posizionare la cella sulla stampa francese.Quindi, selezionare la modalità bassa della pressa francese e comprimere la sospensione attraverso la mini-cella di pressione a 110 sul quadrante per i mitocondri del grasso bruno e a 140 per i mitocondri cardiaci, assicurandosi che la sospensione esca dalla mini-cella di pressione ad una velocità di circa una goccia al secondo. Raccogliere le gocce in un tubo conico raffreddato a ghiaccio da 15 millilitri. Centrifugare la sospensione a 10, 500 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius.Sospendere il pellet di mitoplasti in 0,5-2 millilitri di tampone di cloruro di potassio ipertonico ghiacciato e conservare la sospensione su ghiaccio. Tirare i filamenti di vetro borosilicato il giorno della registrazione utilizzando un estrattore di micropipette, impostando un programma sull'estrattore utilizzato per generare pipette con un alto grado di riproducibilità. Inserire un filamento di vetro all'interno dell'estrattore e tirare per ottenere quasi due pipette patch identiche da un filamento di borosilicato.Regolare il programma quando le pipette diventano incoerenti tra i cicli di trazione a causa dell'invecchiamento del filamento della scatola di riscaldamento dell'estrattore. Posizionare la pipetta all'interno della lucidatrice della pipetta e posizionare la punta vicino al filamento sotto l'ingrandimento 100X per lucidarlo a fuoco. Premere più volte il pedale per riscaldare il filamento senza intasare o danneggiare la curva della punta.Lucidare fino a quando le pipette non hanno una resistenza compresa tra 25 e 35 megaohm si ottengono quando riempite con soluzione di pipetta a base di TMA. Pre-incubare i coperchi scivola con gelatina allo 0,1% per ridurre l'adesione del mitoplasto e risciacquarli con la soluzione da bagno di cloruro di potassio prima di depositare la sospensione di mitoplasti. Preparare una diluizione grezza mescolando circa 35 microlitri della sospensione concentrata di mitoplasti con 500 microlitri della soluzione da bagno di cloruro di potassio e posizionarla sugli scivoli di copertura precedentemente collocati in un pozzetto di una piastra a quattro pozzetti.Incubare sul ghiaccio per 15-20 minuti affinché i mitoplasti si sedimentino lungo lo scivolamento della copertura. Riempire completamente la camera da bagno con circa 50 microlitri della soluzione da bagno di cloruro di potassio e trasferire un coperchio con mitoplasti all'interno della camera utilizzando sottili pinzette di microdissezione con una punta piegata. Disporre lo slittamento del coperchio sul fondo della camera senza perfondere la camera per mantenere stabili i mitoplasti sullo slittamento del coperchio.Scegli un singolo mitoplasto non adesivo scansionando il coperchio al microscopio con un obiettivo 60X. Caricare la pipetta con la soluzione di pipetta e posizionarla nel supporto della pipetta. Portare la pipetta nella soluzione da bagno con un micromanipolatore e spostarla appena sopra il mitoplasto selezionato per avvicinarsi all'IMM.Mantenere il potenziale di membrana a zero millivolt e applicare impulsi di 10 millivolt utilizzando il comando di test della membrana nel programma dell'amplificatore. Applicare una leggera pressione negativa per creare rapidamente un gigaseal con l'IMM. Sollevare la pipetta con il mitoplasto attaccato per tenerli lontani dallo slittamento del coperchio per evitare la rottura della guarnizione dovuta alla deriva della pipetta durante l'esperimento.Compensare i transitori di capacità vagante con il comando di test della membrana nel programma dell'amplificatore prima di testare la configurazione dell'intero mitoplasto per ottenere una corretta misurazione della capacità per la membrana del mitoplasto dopo l'irruzione. Applicare impulsi di tensione di breve durata con il programma amplificatore per rompere la patch di membrana sotto la pipetta di vetro e ottenere l'intera configurazione mitoplasto. Dopo l'effrazione, montare i transitori di capacità con l'opzione di test a membrana del programma amplificatore per valutare la capacità della membrana e la sua resistenza di accesso.Immediatamente dopo l'effrazione, sostituire la soluzione di bagno di cloruro di potassio con una soluzione da bagno HEPES tramite perfusione. Applicare un protocollo di rampa di 850 millisecondi con il programma dell'amplificatore. L'applicazione del protocollo di rampa di tensione induce una corrente protonica di grande ampiezza attraverso l'IMM di grasso bruno senza l'aggiunta di acidi grassi esogeni, gli attivatori richiesti delle OCP.Dopo la perfusione da parte dell'inibitore UCP1 guanosina difosfato o della metil beta ciclodestrina 10 millimolare per l'estrazione di acidi grassi di membrana endogena, la corrente residua viene utilizzata per determinare l'ampiezza delle correnti UCP1, che scompare completamente nell'IMM dei topi carenti di UCP1. A differenza del grasso bruno, l'IMM dei tessuti non adiposi, come il muscolo scheletrico e il cuore, non sviluppa una corrente protonica misurabile immediatamente dopo l'irruzione. Per indurre una corrente protonica misurabile attraverso l'AAC, è essenziale applicare la soluzione bagno hepes contenente da uno a due micromolari di acidi grassi esogeni.Per confermare che la corrente protonica misurata è trasportata da AAC, è importante applicare inibitori specifici, carbossiatractiloside, che inibiscono quasi completamente la corrente protonica mostrata nell'IMM di topi carenti di AAC1. Un'inibizione costante ma mai completa della perdita di protoni si ottiene solo quando l'ADP è presente su entrambi i lati della membrana per generare uno scambio nucleotidico attivo tramite AAC. La qualità della preparazione del mitoplasto influenzerà il tasso di successo nel raggiungimento della configurazione dell'intero mitoplasto.È essenziale ottimizzarlo. Una volta sezionato il meccanismo molecolare della termogenesi mitocondriale con la tecnica del patch clamp, la misurazione del consumo di ossigeno mitocondriale dimostrerà l'importanza della corrente protonica e della termogenesi nei mitocondri intatti. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori per esplorare tutti i tipi di conduttanza, ioni e metaboliti importanti per il funzionamento dei mitocondri.

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