Name: the use of the patch-clamp technique to study the thermogenic capacity of mitochondria
Uploaded: 2021-05-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria at JoVE.com

私が彼の研究室で参加した素晴らしい科学について、ユーリー・キリコック博士と、有益な議論をしてくれたキリコック研究所のメンバーに感謝します。また、 AAC1 ノックアウトマウスを提供してくれたダグラス・C・ウォレス博士にも感謝します。 資金調達:AMBは、米国心臓協会キャリア開発賞19CDA34630062の支援を受けました。

実施されたすべての動物実験手順は、国立衛生研究所のガイドラインに準拠しており、カリフォルニア大学ロサンゼルス校の動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されました。
注:ミトコンドリア分離手順は、差動遠心分離に基づいており、組織ごとにわずかに異なります。例えば、褐色脂肪組織は脂質が非常に豊富であるため、ミトコンドリアを採取する前に細...

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	<li>Divakaruni, A. S., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+and+physiology+of+mitochondrial+proton+leak.">The regulation and physiology of mitochondrial proton leak.</a> Physiology (Bethesda). 26 (3), 192-205 (2011).</li><li>Chouchani, E. T., Kazak, L., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+advances+in+adaptive+thermogenesis:+UCP1+and+beyond.">New advances in adaptive thermogenesis: UCP1 and beyond.</a> Cell Metabolism. 29 (1), 27-37 (2019).</li><li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue:+function+and+physiological+significance.">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).</li><li>Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hunt+for+the+molecular+mechanism+of+brown+fat+thermogenesis.">The hunt for the molecular mechanism of brown fat thermogenesis.</a> Biochimie. 134, 9-18 (2017).</li><li>Bertholet, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H(+)+transport+is+an+integral+function+of+the+mitochondrial+ADP/ATP+carrier.">H(+) transport is an integral function of the mitochondrial ADP/ATP carrier.</a> Nature. 571 (7766), 515-520 (2019).</li><li>Fedorenko, A., Lishko, P. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+calcium+uniporter+is+a+highly+selective+ion+channel.">The mitochondrial calcium uniporter is a highly selective ion channel.</a> Nature. 427 (6972), 360-364 (2004).</li><li>Fieni, F., Lee, S. B., Jan, Y. N., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter+varies+greatly+between+tissues.">Activity of the mitochondrial calcium uniporter varies greatly between tissues.</a> Nature Communications. 3, 1317 (2012).</li><li>Chaudhuri, D., Sancak, Y., Mootha, V. K., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCU+encodes+the+pore+conducting+mitochondrial+calcium+currents.">MCU encodes the pore conducting mitochondrial calcium currents.</a> eLife. 2, 00704 (2013).</li><li>Vais, H., Payne, R., Paudel, U., Li, C., Foskett, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+transmembrane+mechanisms+control+MCU-mediated+mitochondrial+Ca(2+)+uptake.">Coupled transmembrane mechanisms control MCU-mediated mitochondrial Ca(2+) uptake.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21731-21739 (2020).</li><li>Vais, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMRE+is+a+matrix+Ca(2+)+sensor+that+governs+gatekeeping+of+the+mitochondrial+Ca(2+)+uniporter.">EMRE is a matrix Ca(2+) sensor that governs gatekeeping of the mitochondrial Ca(2+) uniporter.</a> Cell Reports. 14 (3), 403-410 (2016).</li><li>Vais, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCUR1,+CCDC90A,+is+a+regulator+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">MCUR1, CCDC90A, is a regulator of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Cell Metabolism. 22 (4), 533-535 (2015).</li><li>Kamer, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MICU1+imparts+the+mitochondrial+uniporter+with+the+ability+to+discriminate+between+Ca(2+)+and+Mn(2+).">MICU1 imparts the mitochondrial uniporter with the ability to discriminate between Ca(2+) and Mn(2+).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 7960-7969 (2018).</li><li>Bertholet, A. M., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+analysis+of+the+mitochondrial+H(+)+leak+in+brown+and+beige+fat.">Patch-clamp analysis of the mitochondrial H(+) leak in brown and beige fat.</a> Frontiers in Physiology. 11, 326 (2020).</li><li>Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization,+identification,+and+excision+of+murine+adipose+depots.">Localization, identification, and excision of murine adipose depots.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52174 (2014).</li><li>Garg, V., Kirichok, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+analysis+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">Patch-clamp analysis of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Methods in Molecular Biology. 1925, 75-86 (2019).</li><li>Decker, G. L., Greenawalt, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+and+biochemical+studies+of+mitoplasts+and+outer+membranes+derived+from+French-pressed+mitochondria.+Advances+in+mitochondrial+subfractionation.">Ultrastructural and biochemical studies of mitoplasts and outer membranes derived from French-pressed mitochondria. Advances in mitochondrial subfractionation.</a> Journal of Ultrastructure Research. 59 (1), 44-56 (1977).</li><li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+electrical+currents+across+the+plasma+membrane+of+mammalian+sperm+cells.">Recording electrical currents across the plasma membrane of mammalian sperm cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), (2021).</li><li>Flaming, D. G., Brown, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropipette+puller+design:+form+of+the+heating+filament+and+effects+of+filament+width+on+tip+length+and+diameter.">Micropipette puller design: form of the heating filament and effects of filament width on tip length and diameter.</a> Journal of Neuroscience Methods. 6 (1-2), 91-102 (1982).</li><li>Klingenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ADP+and+ATP+transport+in+mitochondria+and+its+carrier.">The ADP and ATP transport in mitochondria and its carrier.</a> Biochimica and Biophysica Acta. 1778 (10), 1978-2021 (2008).</li></ol>

この方法の記事は、ミトコンドリア熱発生を担当するIMMを介したH+リークを直接研究する新しいアプローチであるミトコンドリアに最近適用されたパッチクランプ技術を提示することを目的としています5,6,7,15。この技術は組織に限定されず、HAP1、COS7、C2C12、MEF細胞などの異なる標準ヒト...

ミトコンドリアは細胞の原動力として有名です。実際、それらは化学エネルギーの主要な供給源であるATPです。あまり知られていないのは、ミトコンドリアも熱を発生するということです。実際、すべてのミトコンドリアは常に2種類のエネルギー(ATPと熱)を生成し、2つのエネルギー形態の微妙なバランスが代謝細胞の恒常性を定義します(図1)。ミトコンドリアがATPと熱の間でどのようにエネルギーを分配するかは、生体エネルギー学の分野では確かに最も基本的な問題ですが、まだほとんど知られていません。ミトコンドリア熱産生(ミトコンドリア熱発生と呼ばれる)を増加させ、その結果ATP産生を減少させるとエネルギー消費が増加することが知られており、これはメタボリックシンドローム1と戦うための最良の方法の1つです。
ミトコンドリア熱発生は、ミトコンドリア内膜(IMM)を横切るH+リークに由来し、基質酸化の脱結合とATP合成、その結果生じる熱の生成につながるため、「ミトコンドリアアンカップリング」1という名前が付けられています(図1)。このH+リークは、アンカップリングタンパク質(UCP)と呼ばれるミトコンドリアトランスポーターに依存します。UCP1 は最初に同定された UCP でした。それは、ミトコンドリアが熱産生に特化している熱発生組織、褐色脂肪、およびベージュ脂肪でのみ発現される2,3,4。骨格筋、心臓、肝臓などの非脂肪組織におけるUCPの同一性は、依然として議論の余地がある。これらの組織におけるミトコンドリアは、全ミトコンドリアエネルギーの約25%を熱に変換することができ、これは全身の生理機能に大きな影響を与える可能性がある1。深部体温を維持することに加えて、ミトコンドリア熱発生はまた、カロリーを減らすことによって食事誘発性肥満を防ぎます。さらに、ミトコンドリアによる活性酸素種(ROS)の産生を減少させ、細胞を酸化的損傷から保護する1。したがって、ミトコンドリア熱発生は、正常な老化、加齢性変性障害、および虚血再灌流などの酸化ストレスを伴う他の状態に関与する。したがって、ミトコンドリア熱発生は細胞代謝の強力な調節因子であり、この基本的なプロセスの機構的理解は、ミトコンドリア機能障害に関連する多くの病状と戦うための治療戦略の開発を促進するであろう。
ミトコンドリア呼吸は、細胞代謝におけるミトコンドリア熱発生の重要な役割を明らかにした最初の技術であり、コミュニティ1で依然として最も人気があります。この技術は、ミトコンドリアH+リークが活性化されると増加するミトコンドリア電子輸送鎖(ETC)による酸素消費量の測定に基づいています。この技術は、道具的ではあるが、IMM 1を横切るミトコンドリアH+リークを直接研究することはできないため、特にATP産生と比較して熱産生が二次的である非脂肪組織において、IMM1の原因となるタンパク質の正確な同定および特性評価を困難にする。最近、ミトコンドリアに適用されるパッチクランプ技術の開発は、様々な組織におけるIMM全体にわたるH+リークの最初の直接研究を提供しました5、6、7。
IMM全体のミトコンドリアパッチクランプは、Kirichokらによって再現可能な方法で最初に確立された8。彼らは、2004年にCOS-7細胞株8からのミトプラストを用いてミトコンドリアカルシウムユニポーター(MCU)電流の最初の直接測定を説明した。その後、Kirichok研究室は、マウス9およびショウジョウバエ組織9のIMMからのカルシウム電流を示した。他の研究室は現在、MCU10、11、12、13、14の生物物理学的特性を研究するためにこの技術を日常的に使用しています。カリウムと塩化物のコンダクタンスのIMMパッチクランプ分析も可能であり、いくつかの論文で言及されていますが、まだ出版物6、7、9の主な主題ではありません。IMMを横切るH+電流の最初の測定は、2012年にマウスの褐色脂肪ミトコンドリア6から、そして2017年にマウスベージュ脂肪ミトコンドリアから報告されました7。この電流は、熱発生組織の特異的な脱共役タンパク質、UCP1 6,7によるものである。2019年に発表された最近の研究では、AACが心臓や骨格筋などの非脂肪組織におけるミトコンドリアH+リークの原因となる主なタンパク質として特徴付けられました5。
このユニークなアプローチにより、ミトコンドリアの熱発生を担うミトコンドリアイオンチャネルとトランスポーターの直接高分解能機能解析が可能になりました。この方法の拡大を促進し、ミトコンドリア呼吸などの他の研究を補完するために、UCP1およびAACによって運ばれるH+ 電流を測定するための詳細なプロトコルを以下に説明する。1)UCP1依存性H+ 電流を分析するためのマウス褐色脂肪からのミトコンドリア単離およびAAC依存性H+ 電流を分析するための心臓からのミトコンドリア単離、2)外側ミトコンドリア膜(OMM)の機械的破裂のためのフレンチプレスによるミトプラストの調製、3)IMM全体にわたるUCP1およびAAC依存性H+ 電流のパッチクランプ記録。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% gelatin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60X water immersion objective, numerical aperture 1.20</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO60XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF150-86-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1550B Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Press</td>
			<td>Glen Mills</td>
			<td>5500-000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inversed Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71 or IX73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Forge</td>
			<td>(Narishige)</td>
			<td>MF-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanupulator MPC-385</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>FG-MPC325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode holder for agar bridge</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH3F4515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>(Sutter Instruments)</td>
			<td>P97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Cell for French Press</td>
			<td>Glen Mills</td>
			<td>5500-FA-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIXER IKA 6-2000RPM</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-50705-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 100X magnification</td>
			<td>Nikon&#160; lens</td>
			<td>MPlan 100/0.80 ELWD 210/0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pClamp 10</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-24E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>358039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75 009 521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table</td>
			<td>Newport</td>
			<td>VIS3036-SG2-325A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-gluconic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>M4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>3777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>60128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>63068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>331635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisBase</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisCl</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of the patch-clamp technique to study the thermogenic capacity of mitochondria

ミトコンドリア熱発生(ミトコンドリアアンカップリングとしても知られている)は、メタボリックシンドロームと戦うためのエネルギー消費を増加させるための最も有望な標的の1つである。茶色脂肪やベージュ脂肪などの熱発生組織は、熱産生のために高度に専門化されたミトコンドリアを発達させる。主にATPを産生する他の組織のミトコンドリアも、ミトコンドリア全体のエネルギー産生の最大25%を熱に変換し、したがって、全身の生理機能に大きな影響を与える可能性があります。ミトコンドリア熱発生は、体温を維持するために不可欠であるだけでなく、食事誘発性肥満を予防し、活性酸素種(ROS)の産生を減少させ、細胞を酸化的損傷から保護する。ミトコンドリア熱発生は細胞代謝の重要な調節因子であるため、この基本的なプロセスの機構的理解は、ミトコンドリア機能障害に関連する多くの病状と戦うための治療戦略の開発に役立つであろう。重要なことに、ミトコンドリアにおける熱発生の急性活性化を制御する正確な分子機構は、あまり定義されていない。この情報の欠如は、主に、結合解除タンパク質を直接測定する方法が不足しているためです。ミトコンドリアに適用されたパッチクランプ方法論の最近の開発により、ミトコンドリア熱発生の起源における現象、IMMを介したH+ リークの直接研究が初めて可能になり、それを担うミトコンドリアトランスポーター、褐色およびベージュ色の脂肪に特異的な脱共役タンパク質1(UCP1)、および他のすべての組織に対するADP / ATPトランスポーター(AAC)の最初の生物物理学的特徴付けが可能になった。このユニークなアプローチは、H+ リークとミトコンドリア熱発生を制御するメカニズムと、メタボリックシンドロームと戦うためにそれらをどのように標的にすることができるかについての新しい洞察を提供します。この論文では、IMMを通るH+ 電流を直接測定することによってミトコンドリアの熱発生能力を研究するためにミトコンドリアに適用されたパッチクランプ方法論について説明します。

ミトコンドリアに適用されたパッチクランプ方法論の開発は、IMMとそれに関与するミトコンドリアトランスポーターUCP1およびAACを介したH+ リークの最初の直接研究を提供しました。UCP1およびAAC依存性のH+ リークの電気生理学的分析は、ミトコンドリアの熱発生能力の第一目瞭然を提供することができる。結果のセクションでは、UCP1 および AAC を介して H+ リークを測...

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The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria

この方法の記事では、ミトコンドリアの熱生成能力を研究するための新しいアプローチであるパッチクランプ技術を使用して、ミトコンドリア内膜を横切るH+ リークを測定する主な手順を詳述します。

ミトコンドリアの熱発生能力を研究するためのパッチクランプ技術の使用

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat ...

このプロトコルは、パッチクランプ技術を使用して、ミトコンドリア内膜を横切るミトコンドリアプロトンリークを直接測定することによって、ミトコンドリアの熱生成能力を研究する方法を説明しています。ミトコンドリア内膜を通るプロトン電流の直接測定は、ミトコンドリア熱発生の原因となる分子メカニズムを特定し、正確に特徴付けるのに役立ちます。この技術は、ミトコンドリア内膜を横切るプロトン電流を測定するだけでなく、カルシウムやアデニンヌクレオチドのような代謝産物など、ミトコンドリア機能に重要な他のコンダクタンスを研究することを可能にする。安楽死させたマウスを背中に置き、アルコールをスプレーして髪をきれいにし、濡らします。次に、胸郭に2センチメートルの切開を行う。ピンセットで皮膚をつかんだ後、動物の胸から心臓を解剖し、それをすすぎ、5ミリリットルの冷間隔離溶液を含む10ミリリットルのビーカーにすべての血液を取り除きます。心臓の痕跡の血液が取り除かれたら、5ミリリットルの冷間隔離バッファーを入れた別の10ミリリットルのビーカーに移し、それを細かく切り刻みます。その後、氷冷した10ミリリットルのガラスホモジナイザーに移す。オーバーヘッドスターラーを使用して、氷上のプレカット組織を毎分275回転の制御速度で6回の穏やかなストロークで均質化します。ホモジネートを15ミリリットルの氷冷円錐管に移し、それを摂氏4度で10分間700倍Gで遠心分離して、核および未切断の細胞をペレット化する。新鮮な15ミリリットルのチューブに上清を集め、氷の上に置きます。上清を8で遠心分離し、4°Cで10分間Gを500倍にし、ミトコンドリアを含むペレットを得た。ミトコンドリアペレットを3.8ミリリットルの氷冷高張マンニトール緩衝液に再懸濁し、ミトコンドリア懸濁液を氷上で10〜15分間インキュベートする。ミトコンドリア高張マンニトール懸濁液をフレンチプレスの冷蔵ミニ圧力セルに充填する。次に、セルをフレンチプレスの上に置きます。次に、フレンチプレスの低モードを選択し、褐色脂肪ミトコンドリアの場合はダイヤル上の110、心臓ミトコンドリアの場合は140でミニ圧力セルを介して懸濁液を圧縮し、懸濁液がミニ圧力セルから毎秒約1滴の速度で出てくるようにします。15ミリリットルの氷冷円錐管に滴を集める。懸濁液を10, 500倍のGで4°Cで10分間遠心分離する。マイトプラストペレットを0.5〜2ミリリットルの氷冷高張塩化カリウム緩衝液に再懸濁し、懸濁液を氷上に保存する。記録当日にマイクロピペットプーラーを用いて硼珪酸ガラスフィラメントを引っ張り、再現性の高いピペット生成に用いるプラーにプログラムを設定する。1つのガラスフィラメントをプーラー内に挿入して引っ張り、1つのホウケイ酸フィラメントからほぼ2つの同一のパッチピペットを得る。プーラーの加熱ボックスフィラメントの経年劣化により、ピペットが引っ張りサイクル間で不整合になった場合は、プログラムを調整してください。ピペットをピペットポリッシャーの内側に置き、フィラメントの近くに先端を倍率100倍以下に置いてファイアーポリッシュします。フットペダルを数回押して、先端の曲線を詰まらせたり傷つけたりすることなくフィラメントを加熱します。ピペットがTMAベースのピペット溶液で満たされたときに25〜35メガオームの間の抵抗を有するまでポリッシュが得られる。プレインキュベートカバーは、0.1%ゼラチンでスリップしてミトプラストの付着を減少させ、ミトプラスト懸濁液を沈着させる前に塩化カリウム浴溶液ですすいでください。約35マイクロリットルの濃縮マイトプラスト懸濁液と500マイクロリットルの塩化カリウム浴溶液を混合して生希釈液を調製し、4ウェルプレートのウェルに予め置いたカバースリップの上に置く。氷上で15〜20分間インキュベートし、マイトプラストをカバースリップに沈降させる。約50マイクロリットルの塩化カリウム浴溶液で浴室を完全に満たし、先端が曲がった薄い微小解離ピンセットを使用して、マイトプラストを含むカバースリップをチャンバー内に移す。カバースリップをチャンバーを灌流せずにチャンバーの底部に配置して、カバースリップ上でマイトプラストを安定に保ちます。60倍の対物レンズで顕微鏡下でカバースリップをスキャンして、個々の非粘着性マイトプラストを選択します。ピペットにピペット溶液をロードし、ピペットホルダーに入れます。マイクロマニピュレーターでピペットをバス溶液に入れ、選択したマイトプラストのすぐ上に動かしてIMMに近づきます。膜電位をゼロミリボルトに保持し、アンププログラムの膜テストコマンドを使用して10ミリボルトのパルスを印加します。わずかな負圧を加えて、IMMでギガシールをすばやく作成します。実験中のピペットのドリフトによるシールの破損を避けるために、マイトプラストを取り付けたピペットを持ち上げてカバースリップから遠ざけてください。ミトプラスト全体の構成をテストする前に、アンププログラムのメンブレンテストコマンドで浮遊容量トランジェントを補償し、侵入後のミトプラスト膜の正しい静電容量測定値を取得します。アンププログラムで短時間の電圧パルスを印加し、ガラスピペットの下の膜パッチを破裂させ、全体のミトプラスト構成を実現します。ブレークイン後、容量トランジェントをアンププログラムのメンブレンテストオプションに合わせ、メンブレン容量とそのアクセス抵抗を評価します。侵入直後は、灌流により塩化カリウム浴液をHEPES浴液に交換する。アンププログラムに850ミリ秒のランププロトコルを適用します。電圧ランププロトコルの適用は、UCPの必要な活性化剤である外因性脂肪酸を添加することなく、褐色脂肪のIMMの両端に大振幅のプロトン電流を誘導する。内因性膜脂肪酸抽出のためのUCP1阻害剤グアノシン二リン酸または10ミリモルメチルベータシクロデキストリンのいずれかによる灌流後、残留電流を使用してUCP1電流の振幅を決定し、UCP1欠損マウスのIMMにおいて完全に消失する。褐色脂肪とは異なり、骨格筋や心臓などの非脂肪組織のIMMは、侵入直後に測定可能な陽子電流を発達させない。AACを介して測定可能なプロトン電流を誘導するためには、1〜2マイクロモルの外因性脂肪酸を含むHEPES浴溶液を適用することが不可欠である。測定されたプロトン電流がAACによって運ばれていることを確認するためには、AAC1欠損マウスのIMMに示されるプロトン電流をほぼ完全に阻害する特異的阻害剤、カルボキシアトラチロシドを適用することが重要である。プロトンリークの一定かつ決して完全な阻害は、ADPが膜の両側に存在し、AACを介して活性なヌクレオチド交換を生成する場合にのみ達成される。ミトプラスト調製物の品質は、ミトプラスト構成全体を達成する際の成功率に影響する。最適化することが不可欠です。ミトコンドリア熱発生の分子メカニズムをパッチクランプ技術で解剖すると、ミトコンドリアの酸素消費量の測定は、無傷のミトコンドリアにおけるプロトン電流と熱発生の重要性を実証するでしょう。この技術は、研究者がミトコンドリアの機能に重要なあらゆる種類のコンダクタンス、イオン、代謝産物を探索するための道を開きます。

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

トカゲの運動の速度と方向の視覚感度のテスト

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

コンピュータによって生成された動物モデルの刺激

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

がくからパッチクランプの静電容量の録音のための方法

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

改善されたパッチクランプ記録のための圧力 - 研磨ピペット

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

単離ミトコンドリアマウス心臓における透水性遷移孔の開口部のマルチパラメータ測定

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

一チャネルセル付パッチクランプ法

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

膵臓腺房細胞の分泌能力を評価する

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウスの骨格筋の最小量からミトコンドリアの単離

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

の用法<em&gt; ex vivoで</em&gt;全体の臓器イメージングと定量的組織組織学は、蛍光標識分子のバイオ分布を決定します

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

マウス間質弁細胞の分離を用いて大動脈弁の石灰化を 研究

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) ...