Name: the use of the patch-clamp technique to study the thermogenic capacity of mitochondria
Uploaded: 2021-05-03T15:00:00
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나는 Yuriy Kirichok 박사에게 내가 그의 실험실에서 참여했던 위대한 과학과 도움이되는 토론을 위해 Kirichok 실험실의 구성원들에게 감사한다. 또한 AAC1 녹아웃 마우스를 제공해 주신 Douglas C. Wallace 박사님께도 감사드립니다. 기금: A.M.B는 American Heart Association Career Development Award 19CDA34630062의 지원을 받았습니다.

수행 된 모든 동물 실험 절차는 국립 보건원 지침을 준수하며 캘리포니아 대학 로스 앤젤레스 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다.
참고: 미토콘드리아 분리 절차는 차동 원심분리를 기반으로 하며 조직마다 약간 다릅니다. 예를 들어, 갈색 지방 조직은 지질이 매우 풍부하기 때문에 미토콘드리아를 수확하기 전에 지질 단계에서 세포 파편과 소기관을 ?...

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	<li>Divakaruni, A. S., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+and+physiology+of+mitochondrial+proton+leak.">The regulation and physiology of mitochondrial proton leak.</a> Physiology (Bethesda). 26 (3), 192-205 (2011).</li><li>Chouchani, E. T., Kazak, L., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+advances+in+adaptive+thermogenesis:+UCP1+and+beyond.">New advances in adaptive thermogenesis: UCP1 and beyond.</a> Cell Metabolism. 29 (1), 27-37 (2019).</li><li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue:+function+and+physiological+significance.">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).</li><li>Nicholls, D. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MICU1+imparts+the+mitochondrial+uniporter+with+the+ability+to+discriminate+between+Ca(2+)+and+Mn(2+).">MICU1 imparts the mitochondrial uniporter with the ability to discriminate between Ca(2+) and Mn(2+).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 7960-7969 (2018).</li><li>Bertholet, A. M., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+analysis+of+the+mitochondrial+H(+)+leak+in+brown+and+beige+fat.">Patch-clamp analysis of the mitochondrial H(+) leak in brown and beige fat.</a> Frontiers in Physiology. 11, 326 (2020).</li><li>Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. 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이 방법 논문은 미토콘드리아에 최근에 적용된 패치 클램프 기술을 제시하는 것을 목표로하며, 미토콘드리아 열발생 5,6,7,15를 담당하는 IMM을 통해 H + 누출을 직접 연구하는 새로운 접근 방식입니다. 이 기술은 조직에 한정되지 않으며, HAP1, COS7, C2C12 및 MEF 세포와 같은 상이한 표준 인간 및 세?...

미토콘드리아는 세포의 강국으로 유명합니다. 실제로, 그들은 화학 에너지의 주요 원천 인 ATP입니다. 덜 알려진 것은 미토콘드리아도 열을 발생시킨다는 것입니다. 사실, 모든 미토콘드리온은 두 가지 유형의 에너지 (ATP와 열)를 지속적으로 생성하며 두 에너지 형태 사이의 미세한 균형은 대사 세포 항상성을 정의합니다 (그림 1). 미토콘드리아가 ATP와 열 사이에 에너지를 분배하는 방법은 아직 크게 알려지지 않았지만 생물 에너지 분야에서 가장 근본적인 질문입니다. 우리는 미토콘드리아 열 생산 (미토콘드리아 열 발생이라고 함)을 증가시키고 결과적으로 ATP 생산을 줄이면 에너지 소비가 증가한다는 것을 알고 있으며 이는 대사 증후군1과 싸우는 가장 좋은 방법 중 하나입니다.
미토콘드리아 열발생은 미토콘드리아 내부 막(IMM)을 가로지르는 H+ 누출로 인해 기질 산화와 ATP 합성의 결합이 해제되어 결과적으로 열이 생성되므로 "미토콘드리아 비결합"1이라는 이름이 붙여집니다(그림 1). 이 H+ 누출은 언커플링 단백질(UCPs)이라고 불리는 미토콘드리아 수송체에 의존한다. UCP1은 최초로 확인된 UCP였다. 그것은 열원성 조직, 갈색 지방 및 미토콘드리아가 열 생산을 전문으로하는 베이지 색 지방에서만 발현됩니다 2,3,4. 골격근, 심장 및 간과 같은 비 지방 조직에서 UCP의 정체성은 논란의 여지가있다. 이들 조직 내의 미토콘드리아는 열로 변환된 총 미토콘드리아 에너지의 약 25%를 가질 수 있으며, 이는 전신의 생리학에 상당한 영향을 미칠 수 있다1. 핵심 체온을 유지하는 것 외에도 미토콘드리아 열 발생은 칼로리를 줄임으로써식이 요법으로 인한 비만을 예방합니다. 또한, 미토콘드리아에 의한 반응성 산소 종(ROS)의 생성을 감소시켜 산화 손상으로부터 세포를 보호한다1. 따라서, 미토콘드리아 열발생은 정상적인 노화, 연령-관련 퇴행성 장애, 및 허혈-재관류와 같은 산화 스트레스를 수반하는 다른 병태에 관여한다. 따라서 미토콘드리아 열발생은 세포 대사의 강력한 조절자이며,이 근본적인 과정에 대한 기계론적 이해는 미토콘드리아 기능 장애와 관련된 많은 병리학을 퇴치하기위한 치료 전략의 개발을 촉진 할 것입니다.
미토콘드리아 호흡은 세포 대사에서 미토콘드리아 열발생의 중요한 역할을 밝혀내는 최초의 기술이었으며 여전히 지역 사회에서 가장 인기가 있습니다1. 이 기술은 미토콘드리아 H+ 누출이 활성화될 때 증가하는 미토콘드리아 전자 수송 사슬(ETC)에 의한 산소 소비량 측정을 기반으로 합니다. 이 기술은 도구적이지만 IMM1에서 미토콘드리아 H+ 누출을 직접 연구할 수는 없으므로 특히 ATP 생산과 비교하여 열 생산이 이차적인 비지방 조직에서는 이를 담당하는 단백질의 정확한 식별 및 특성화가 어렵습니다. 최근에, 미토콘드리아에 적용된 패치-클램프 기술의 개발은, 다양한 조직들(5,6,7)에서 전체 IMM에 걸친 H+ 누출에 대한 최초의 직접적인 연구를 제공하였다.
전체 IMM의 미토콘드리아 패치 클램프는 Kirichok et al.8에 의해 재현 가능한 방식으로 처음 확립되었습니다. 그들은 COS-7 세포주8의 미토플라스트를 사용하여 2004 년 미토콘드리아 칼슘 유니포터 (MCU) 전류의 첫 번째 직접 측정을 설명했습니다. 나중에, Kirichok 실험실은 마우스 9 및 초파리 조직9의 IMM에서 칼슘 전류를보여주었습니다. 다른 실험실에서는 MCU10,11,12,13,14의 생물 물리학 적 특성을 연구하기 위해이 기술을 일상적으로 사용합니다. 칼륨 및 염화물 전도도의 전체 IMM 패치-클램프 분석도 가능하며, 몇몇 논문에서 언급되었지만, 아직 간행물 6,7,9의 주요 주제가 되지 않았다. IMM을 통한 H+ 전류의 첫 번째 측정은 2012년 마우스 갈색 지방 미토콘드리아(6)로부터, 그리고 2017년 마우스 베이지색 지방 미토콘드리아(2017년7)로부터 보고되었다. 이러한 전류는 열원성 조직인 UCP1 6,7의 특이적 비결합 단백질에 기인한다. 2019 년에 발표 된 최근 연구는 AAC를 심장 및 골격근과 같은 비 지방 조직에서 미토콘드리아 H + 누출을 담당하는 주요 단백질로 특성화했습니다5.
이 독특한 접근 방식은 이제 미토콘드리아 이온 채널 및 미토콘드리아 열 발생을 담당하는 수송체의 직접적인 고해상도 기능 분석을 허용합니다. 이 방법의 확장을 촉진하고 미토콘드리아 호흡과 같은 다른 연구를 보완하기 위해 UCP1 및 AAC에 의해 운반되는 H + 전류를 측정하기위한 상세한 프로토콜이 아래에 설명되어 있습니다. 세 가지 중요한 단계가 설명된다: 1) AAC 의존성 H+ 전류를 분석하기 위해 UCP1 의존성 H+ 전류 및 심장으로부터의 미토콘드리아 분리를 분석하기 위한 마우스 갈색 지방으로부터의 미토콘드리아 분리, 2) 외부 미토콘드리아 막(OMM)의 기계적 파열을 위한 프렌치 프레스를 이용한 미토플라스트 준비, 3) 전체 IMM에 걸친 UCP1 및 AAC 의존적 H+ 전류의 패치 클램프 기록.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% gelatin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60X water immersion objective, numerical aperture 1.20</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO60XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF150-86-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1550B Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Press</td>
			<td>Glen Mills</td>
			<td>5500-000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inversed Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71 or IX73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Forge</td>
			<td>(Narishige)</td>
			<td>MF-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanupulator MPC-385</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>FG-MPC325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode holder for agar bridge</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH3F4515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>(Sutter Instruments)</td>
			<td>P97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Cell for French Press</td>
			<td>Glen Mills</td>
			<td>5500-FA-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIXER IKA 6-2000RPM</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-50705-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 100X magnification</td>
			<td>Nikon&#160; lens</td>
			<td>MPlan 100/0.80 ELWD 210/0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pClamp 10</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-24E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>358039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75 009 521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table</td>
			<td>Newport</td>
			<td>VIS3036-SG2-325A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-gluconic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>M4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>3777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>60128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>63068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>331635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisBase</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisCl</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of the patch-clamp technique to study the thermogenic capacity of mitochondria

미토콘드리아 열발생(미토콘드리아 비결합이라고도 함)은 대사 증후군과 싸우기 위해 에너지 소비를 증가시키는 가장 유망한 목표 중 하나입니다. 갈색 및 베이지 색 지방과 같은 열 생성 조직은 열 생산을 위해 고도로 전문화 된 미토콘드리아를 개발합니다. 주로 ATP를 생산하는 다른 조직의 미토콘드리아도 전체 미토콘드리아 에너지 생산의 최대 25 %를 열로 변환하므로 전신의 생리학에 상당한 영향을 줄 수 있습니다. 미토콘드리아 열발생은 체온 유지에 필수적일 뿐만 아니라 식이요법으로 인한 비만을 예방하고 반응성 산소종(ROS)의 생성을 감소시켜 산화 손상으로부터 세포를 보호합니다. 미토콘드리아 열발생은 세포 대사의 핵심 조절자이기 때문에, 이 근본적인 과정에 대한 기계론적 이해는 미토콘드리아 기능 장애와 관련된 많은 병리와 싸우기 위한 치료 전략의 개발에 도움이 될 것이다. 중요하게도, 미토콘드리아에서 열발생의 급성 활성화를 조절하는 정확한 분자 메커니즘은 제대로 정의되지 않았다. 이러한 정보의 부족은 주로 언커플링 단백질의 직접적인 측정을 위한 방법의 부족 때문이다. 미토콘드리아에 적용된 패치 클램프 방법론의 최근 개발은 처음으로 미토콘드리아 열발생의 기원에서의 현상에 대한 직접적인 연구, IMM을 통한 H+ 누출, 그리고 이를 담당하는 미토콘드리아 운반체의 첫 번째 생물물리학적 특성화, 갈색 및 베이지 색 지방의 특이적인 단백질 1(UCP1), 그리고 다른 모든 조직에 대한 ADP/ATP 수송체(AAC)를 가능하게 했다. 이 독특한 접근법은 H + 누출 및 미토콘드리아 열 발생을 제어하는 메커니즘과 대사 증후군 퇴치를 목표로하는 방법에 대한 새로운 통찰력을 제공 할 것입니다. 이 논문은 IMM을 통해 H+ 전류를 직접 측정하여 열원성 능력을 연구하기 위해 미토콘드리아에 적용된 패치 클램프 방법론을 설명합니다.

미토콘드리아에 적용된 패치 클램프 방법론의 개발은 IMM과 이를 담당하는 미토콘드리아 수송체인 UCP1 및 AAC를 통한 H+ 누출에 대한 최초의 직접적인 연구를 제공했다. UCP1- 및 AAC 의존성 H+ 누출의 전기생리학적 분석은 미토콘드리아의 열원성 용량에 대한 첫눈에 제공할 수 있다. 결과 섹션에서는 UCP1 및 AAC를 통해 H+ 누출을 측정하는 표준 절차에 대해 설명합니다.
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The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria

이 방법 기사는 미토콘드리아의 열 생성 능력을 연구하기위한 새로운 접근 방식 인 패치 클램프 기술로 내부 미토콘드리아 막을 가로 지르는 H + 누출을 측정하는 주요 단계를 자세히 설명합니다.

미토콘드리아의 열원성 능력을 연구하기 위한 패치 클램프 기술의 사용

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat ...

이 프로토콜은 패치 클램프 기술이 미토콘드리아 내부 막을 가로 지르는 미토콘드리아 양성자 누출을 직접 측정하여 미토콘드리아의 열원성 능력을 연구하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 설명합니다. 내부 미토콘드리아 막을 통한 양성자 전류의 직접 측정은 미토콘드리아 열발생을 담당하는 분자 메커니즘을 식별하고 정확하게 특성화하는 데 도움이됩니다. 이 기술은 미토콘드리아 내부 막을 가로 지르는 양성자 전류를 측정 할뿐만 아니라 칼슘 또는 아데닌 뉴클레오티드와 같은 대사 산물과 같은 미토콘드리아 기능에 중요한 다른 전도도를 연구 할 수있게합니다.안락사 된 마우스를 등에 놓고 알코올을 뿌려 머리카락을 닦고 적시십시오. 그런 다음 흉부를 두 센티미터 절개하십시오. 핀셋으로 피부를 움켜 잡은 후 동물의 가슴에서 심장을 해부하고 헹구어 모든 혈액을 5 밀리리터의 차가운 격리 용액이있는 10 밀리리터 비커에 넣으십시오.심장이 혈액의 흔적을 제거하면 다섯 밀리리터의 차가운 격리 버퍼가 들어있는 다른 10 밀리리터 비커로 옮겨 얇은 조각으로 자릅니다. 그런 다음 얼음으로 식힌 10 밀리리터 유리 균질 기로 옮깁니다. 오버헤드 교반기를 사용하여 분당 275회 회전의 제어된 속도로 여섯 번의 부드러운 스트로크로 얼음 위에 미리 절단된 조직을 균질화합니다.균질액을 15밀리리터 얼음처럼 차가운 원뿔형 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 10분 동안 700배 G에서 원심분리하여 핵과 깨지지 않은 세포를 펠릿화한다. 상층액을 신선한 15 밀리리터 튜브에 모아 얼음 위에 놓습니다. 상층액을 섭씨 4도에서 10분 동안 8, 500배 G에서 원심분리하여 미토콘드리아를 함유하는 펠렛을 얻었다.미토콘드리아 펠렛을 3.8 밀리리터의 얼음처럼 차가운 고장성 만니톨 완충액에 재현탁시키고 미토콘드리아 현탁액을 얼음 상에서 10 내지 15분 동안 인큐베이션한다. 미토콘드리아 고장성 만니톨 현탁액을 프랑스 프레스의 냉장 미니압력 셀에 채운다. 그런 다음 셀을 프랑스 프레스에 놓습니다.그런 다음, 프렌치 프레스의 로우 모드를 선택하고 갈색 지방 미토콘드리아에 대한 다이얼의 110에서 미니 압력 셀을 통해 서스펜션을 압축하고, 심장 미토콘드리아에 대해 140에서 서스펜션이 초당 약 1 방울의 속도로 미니 압력 셀에서 나오도록 보장하십시오. 방울을 15 밀리리터의 얼음으로 식힌 원뿔형 튜브에 모으십시오. 현탁액을 섭씨 4도에서 10분 동안 10, 500배 G에서 원심분리한다.미토플라스트 펠렛을 0.5 ~ 2 밀리리터의 얼음처럼 차가운 고장성 염화칼륨 완충액에 재현탁시키고 현탁액을 얼음 위에 저장한다. 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 녹화 당일 붕규산 유리 필라멘트를 당겨 재현성이 높은 피펫을 생성하는 데 사용되는 풀러에 프로그램을 설정하십시오. 풀러 내에 하나의 유리 필라멘트를 넣고 당겨서 하나의 붕규산염 필라멘트에서 거의 두 개의 동일한 패치 피펫을 얻습니다.피펫이 풀러의 가열 상자 필라멘트의 노화로 인해 당기는 사이클 사이에 일치하지 않을 때 프로그램을 조정하십시오. 피펫 폴리셔 내부에 피펫을 놓고 팁을 필라멘트 근처에 100X 배율로 배치하여 불을 닦으십시오. 발 페달을 여러 번 눌러 팁 곡선을 막히거나 손상시키지 않고 필라멘트를 가열하십시오.피펫이 25 내지 35 메가옴 사이의 저항을 가질 때까지 광택은 TMA 기반 피펫 용액으로 충전될 때 얻어진다. 미토플라스트 부착을 줄이기 위해 0.1% 젤라틴으로 커버 슬립을 사전 인큐베이션하고 미토플라스트 현탁액을 증착하기 전에 염화칼륨 욕조 용액으로 헹구십시오. 약 35 마이크로리터의 농축된 미토플라스트 현탁액을 500 마이크로리터의 염화칼륨 욕조 용액과 혼합하여 원료 희석물을 준비하고, 이를 네 웰 플레이트의 웰에 이전에 놓인 커버 슬립 상에 놓는다.미토플라스트가 커버 슬립 아래로 침전될 수 있도록 얼음 위에서 15-20분 동안 배양한다. 약 50 마이크로 리터의 염화칼륨 욕조 용액으로 욕조 챔버를 완전히 채우고 구부러진 팁이있는 얇은 미세 해부 핀셋을 사용하여 챔버 내의 미토플라스트로 커버 슬립을 옮깁니다. 커버 슬립을 챔버에 관류시키지 않고 챔버 바닥에 배치하여 커버 슬립에서 미토플라스트를 안정적으로 유지하십시오.현미경 아래에서 커버 슬립을 60X 목표로 스캔하여 개별 비접착성 미토플라스트를 선택하십시오. 피펫 용액으로 피펫을로드하고 피펫 홀더에 넣으십시오. 미세 조작기를 사용하여 피펫을 욕조 용액으로 가져 와서 선택한 미토플라스트 바로 위로 이동하여 IMM에 가까이 가십시오.멤브레인 전위를 0밀리볼트로 유지하고 증폭기 프로그램의 멤브레인 테스트 명령을 사용하여 10밀리볼트 펄스를 인가합니다. 약간의 음압을 가하여 IMM으로 기가살을 빠르게 만듭니다. 미토플라스트가 부착된 피펫을 들어 올려 커버 슬립으로부터 멀리 떨어뜨려 실험 중 피펫 드리프트로 인한 씰 파손을 방지합니다.전체 미토플라스트 구성을 테스트하기 전에 증폭기 프로그램에서 멤브레인 테스트 명령으로 이탈 정전 용량 과도 상태를 보상하여 침입 후 미토플라스트 멤브레인에 대한 정확한 정전용량 측정을 얻습니다. 증폭기 프로그램에 짧은 지속 시간 전압 펄스를 적용하여 유리 피펫 아래에서 멤브레인 패치를 파열시키고 전체 미토플라스트 구성을 달성하십시오. 침입 후 정전 용량 과도 상태를 증폭기 프로그램의 멤브레인 테스트 옵션에 맞게 조정하여 멤브레인 정전 용량과 액세스 저항을 평가합니다.침입 직후, 관류를 통해 염화칼륨 목욕 용액을 HEPES 목욕 용액으로 교체하십시오. 증폭기 프로그램에 850밀리초 램프 프로토콜을 적용합니다. 전압 램프 프로토콜의 적용은 UCPs의 필수 활성화제인 외인성 지방산의 첨가 없이 갈색 지방의 IMM을 가로질러 큰 진폭 양성자 전류를 유도한다.내인성 막 지방산 추출을 위해 UCP1 억제제 구아노신 디포스페이트 또는 10-밀리몰 메틸베타 시클로덱스트린에 의한 관류 후, 잔류 전류는 UCP1 결핍 마우스의 IMM에서 완전히 사라지는 UCP1 전류의 진폭을 결정하기 위해 사용된다. 갈색 지방과는 달리, 골격근 및 심장과 같은 비 지방 조직의 IMM은 침입 직후에 측정 가능한 양성자 전류를 발생시키지 않습니다. AAC를 통해 측정 가능한 양성자 전류를 유도하기 위해서는 외인성 지방산의 일에서 두 마이크로 몰을 포함하는 HEPES 배쓰 용액을 적용하는 것이 필수적입니다.측정된 양성자 전류가 AAC에 의해 운반된다는 것을 확인하기 위해, AAC1 결핍 마우스의 IMM에 나타난 양성자 전류를 거의 완전히 억제하는 특정 억제제인 카르복시아트랙틸로시드를 적용하는 것이 중요하다. 양성자 누출의 일정하지만 결코 완전한 억제는 ADP가 AAC를 통한 활성 뉴클레오티드 교환을 생성하기 위해 막의 양쪽에 존재할 때만 달성된다. 미토플라스트 준비의 품질은 전체 미토플라스트 구성을 달성하는 데 성공률에 영향을 미칩니다.최적화하는 것이 필수적입니다. 일단 미토콘드리아 열발생의 분자 메커니즘이 패치 클램프 기술로 해부되면, 미토콘드리아 산소 소비의 측정은 무손상 미토콘드리아에서 양성자 전류 및 열발생의 중요성을 입증할 것이다. 이 기술은 연구자가 미토콘드리아의 기능에 중요한 모든 종류의 전도성, 이온 및 대사 산물을 탐구 할 수있는 길을 열어줍니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

도마뱀의 운동의 속도와 방향에 시각 민감도 테스트

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

연구

생물학

Computer-Generated Animal Model Stimuli

컴퓨터가 만든 동물 모델 자극

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

칼리에서 패치 클램프 커패시턴스 레코딩을위한 방법

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

향상된 패치 - 클램프 녹음 압력 연마 Pipettes

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

미토콘드리아 절연 마우스 중심부에 투과율 전환 기공 영업의 다중 매개 변수 측정

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

1 채널의 세포 부착 된 패치 클램프 녹음

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

췌장 선포 세포의 분비 능력 평가

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

높은 처리량 마이크로 호흡 측정을위한 마우스 골격근의 최소 수량에서 미토콘드리아의 분리

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

사용<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 전체 기관 이미징 및 정량 조직 조직학는 형광 표지 된 분자의 생물 분포를 확인하는 방법

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

시험관 내 대동맥 판막의 석회화를 연구하기 위해 마우스 간막판 세포의 격리

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) ...