Name: the use of the patch-clamp technique to study the thermogenic capacity of mitochondria
Uploaded: 2021-05-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria at JoVE.com

Jeg takker Dr. Yuriy Kirichok for den store vitenskapen jeg var en del av i laboratoriet hans og medlemmene av Kirichok-laboratoriet for de nyttige diskusjonene. Jeg takker også Dr. Douglas C. Wallace for å ha gitt AAC1 knockout mus. Finansiering: A.M.B ble støttet av American Heart Association Career Development Award 19CDA34630062.

Alle eksperimentelle prosedyrer for dyr som ble utført, samsvarer med National Institutes of Health-retningslinjene og ble godkjent av University of California Los Angeles Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
MERK: Mitokondrieisolasjonsprosedyren er basert på differensial sentrifugering og varierer litt fra vev til vev. For eksempel, siden brunt fettvev er ekstremt rik på lipider, krever det et ekstra skritt for å skille celleavfall og organeller fra lipidfasen før høstin...

<ol>
	<li>Divakaruni, A. S., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+and+physiology+of+mitochondrial+proton+leak.">The regulation and physiology of mitochondrial proton leak.</a> Physiology (Bethesda). 26 (3), 192-205 (2011).</li><li>Chouchani, E. T., Kazak, L., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+advances+in+adaptive+thermogenesis:+UCP1+and+beyond.">New advances in adaptive thermogenesis: UCP1 and beyond.</a> Cell Metabolism. 29 (1), 27-37 (2019).</li><li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue:+function+and+physiological+significance.">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).</li><li>Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hunt+for+the+molecular+mechanism+of+brown+fat+thermogenesis.">The hunt for the molecular mechanism of brown fat thermogenesis.</a> Biochimie. 134, 9-18 (2017).</li><li>Bertholet, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H(+)+transport+is+an+integral+function+of+the+mitochondrial+ADP/ATP+carrier.">H(+) transport is an integral function of the mitochondrial ADP/ATP carrier.</a> Nature. 571 (7766), 515-520 (2019).</li><li>Fedorenko, A., Lishko, P. V., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+fatty-acid-dependent+UCP1+uncoupling+in+brown+fat+mitochondria.">Mechanism of fatty-acid-dependent UCP1 uncoupling in brown fat mitochondria.</a> Cell. 151 (2), 400-413 (2012).</li><li>Bertholet, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+patch+clamp+of+beige+adipocytes+reveals+UCP1-positive+and+UCP1-negative+cells+both+exhibiting+futile+creatine+cycling.">Mitochondrial patch clamp of beige adipocytes reveals UCP1-positive and UCP1-negative cells both exhibiting futile creatine cycling.</a> Cell Metabolism. 25 (4), 811-822 (2017).</li><li>Kirichok, Y., Krapivinsky, G., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+calcium+uniporter+is+a+highly+selective+ion+channel.">The mitochondrial calcium uniporter is a highly selective ion channel.</a> Nature. 427 (6972), 360-364 (2004).</li><li>Fieni, F., Lee, S. B., Jan, Y. N., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter+varies+greatly+between+tissues.">Activity of the mitochondrial calcium uniporter varies greatly between tissues.</a> Nature Communications. 3, 1317 (2012).</li><li>Chaudhuri, D., Sancak, Y., Mootha, V. K., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCU+encodes+the+pore+conducting+mitochondrial+calcium+currents.">MCU encodes the pore conducting mitochondrial calcium currents.</a> eLife. 2, 00704 (2013).</li><li>Vais, H., Payne, R., Paudel, U., Li, C., Foskett, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+transmembrane+mechanisms+control+MCU-mediated+mitochondrial+Ca(2+)+uptake.">Coupled transmembrane mechanisms control MCU-mediated mitochondrial Ca(2+) uptake.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21731-21739 (2020).</li><li>Vais, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMRE+is+a+matrix+Ca(2+)+sensor+that+governs+gatekeeping+of+the+mitochondrial+Ca(2+)+uniporter.">EMRE is a matrix Ca(2+) sensor that governs gatekeeping of the mitochondrial Ca(2+) uniporter.</a> Cell Reports. 14 (3), 403-410 (2016).</li><li>Vais, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCUR1,+CCDC90A,+is+a+regulator+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">MCUR1, CCDC90A, is a regulator of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Cell Metabolism. 22 (4), 533-535 (2015).</li><li>Kamer, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MICU1+imparts+the+mitochondrial+uniporter+with+the+ability+to+discriminate+between+Ca(2+)+and+Mn(2+).">MICU1 imparts the mitochondrial uniporter with the ability to discriminate between Ca(2+) and Mn(2+).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 7960-7969 (2018).</li><li>Bertholet, A. M., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+analysis+of+the+mitochondrial+H(+)+leak+in+brown+and+beige+fat.">Patch-clamp analysis of the mitochondrial H(+) leak in brown and beige fat.</a> Frontiers in Physiology. 11, 326 (2020).</li><li>Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization,+identification,+and+excision+of+murine+adipose+depots.">Localization, identification, and excision of murine adipose depots.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52174 (2014).</li><li>Garg, V., Kirichok, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+analysis+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">Patch-clamp analysis of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Methods in Molecular Biology. 1925, 75-86 (2019).</li><li>Decker, G. L., Greenawalt, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+and+biochemical+studies+of+mitoplasts+and+outer+membranes+derived+from+French-pressed+mitochondria.+Advances+in+mitochondrial+subfractionation.">Ultrastructural and biochemical studies of mitoplasts and outer membranes derived from French-pressed mitochondria. Advances in mitochondrial subfractionation.</a> Journal of Ultrastructure Research. 59 (1), 44-56 (1977).</li><li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+electrical+currents+across+the+plasma+membrane+of+mammalian+sperm+cells.">Recording electrical currents across the plasma membrane of mammalian sperm cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), (2021).</li><li>Flaming, D. G., Brown, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropipette+puller+design:+form+of+the+heating+filament+and+effects+of+filament+width+on+tip+length+and+diameter.">Micropipette puller design: form of the heating filament and effects of filament width on tip length and diameter.</a> Journal of Neuroscience Methods. 6 (1-2), 91-102 (1982).</li><li>Klingenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ADP+and+ATP+transport+in+mitochondria+and+its+carrier.">The ADP and ATP transport in mitochondria and its carrier.</a> Biochimica and Biophysica Acta. 1778 (10), 1978-2021 (2008).</li></ol>

Denne metodeartikkelen tar sikte på å presentere patch-clamp teknikken som nylig ble brukt på mitokondrier, en ny tilnærming for å direkte studere H + lekkasje gjennom IMM ansvarlig for mitokondrie termogenese 5,6,7,15. Denne teknikken er ikke begrenset til vev og kan også brukes til å analysere H + lekkasje og andre ledninger av IMM i forskjellige standard menneske...

Mitokondrier er kjent for å være cellens kraftstasjon. Faktisk er de den viktigste kilden til kjemisk energi, ATP. Det som er mindre kjent er at mitokondrier også genererer varme. Faktisk genererer hver mitokon hele tiden de to energitypene (ATP og varme) og en fin balanse mellom de to energiformene definerer metabolsk celle homeostase (figur 1). Hvordan mitokondrier distribuerer energi mellom ATP og varme er absolutt det mest grunnleggende spørsmålet innen bioenergetikk, selv om det fortsatt i stor grad er ukjent. Vi vet at økende mitokondrievarmeproduksjon (kalt mitokondrietermogenese), og dermed redusere ATP-produksjonen øker energiforbruket, og dette er en av de beste måtene å bekjempe metabolsk syndrom1.
Mitokondrietermogenese stammer fra H+ lekkasje over den indre mitokondriemembranen (IMM), noe som fører til frakobling av substratoksidasjon og ATP-syntese med påfølgende varmeproduksjon, derav navnet "mitokondrie-frakobling"1 (figur 1). Denne H+ lekkasjen avhenger av mitokondrietransportører kalt frakoblingsproteiner (UCPer). UCP1 var den første UCP identifisert. Det uttrykkes bare i termogent vev, brunt fett og beige fett der mitokondrier er spesialisert for varmeproduksjon 2,3,4. Identiteten til UCP i ikke-fettvev som skjelettmuskulatur, hjerte og lever, har forblitt kontroversielt. Mitokondrier i disse vevene kan ha ca 25% av den totale mitokondrieenergien omdannet til varme, noe som kan påvirke fysiologien til hele kroppen1 betydelig. I tillegg til å opprettholde kroppstemperaturen, forhindrer mitokondrie termogenese også diettindusert fedme ved å redusere kalorier. I tillegg reduserer det produksjonen av reaktive oksygenarter (ROS) av mitokondrier for å beskytte celler mot oksidativ skade1. Dermed er mitokondrietermogenese involvert i normal aldring, aldersrelaterte degenerative lidelser og andre forhold som involverer oksidativt stress, som iskemi-reperfusjon. Derfor er mitokondrietermogenese en kraftig regulator av cellulær metabolisme, og en mekanistisk forståelse av denne grunnleggende prosessen vil fremme utviklingen av terapeutiske strategier for å bekjempe mange patologier forbundet med mitokondrie dysfunksjon.
Mitokondrie respirasjon var den første teknikken for å avsløre den avgjørende rollen av mitokondrie termogenese i cellulær metabolisme og er fortsatt den mest populære i samfunnet1. Denne teknikken er basert på måling av oksygenforbruk av mitokondrie-elektrontransportkjeden (ETC) som øker når mitokondrie H + lekkasje aktiveres. Denne teknikken, selv om den er instrumentell, kan ikke direkte studere mitokondrie H + lekkasje over IMM1, og dermed gjøre presis identifisering og karakterisering av proteinene som er ansvarlige for det vanskelig, spesielt i ikke-fettvev der varmeproduksjonen er sekundær sammenlignet med ATP-produksjon. Nylig ga utviklingen av patch-clamp-teknikken som brukes på mitokondrier, den første direkte studien av H + lekkasje over hele IMM i ulike vev 5,6,7.
Mitokondrie patch-klemmen til hele IMM ble først etablert på en reproduserbar måte av Kirichok et al.8. De beskrev den første direkte målingen av mitokondriekalsium uniporter (MCU) strømmer i 2004 ved hjelp av mitoplaster fra COS-7 cellelinjer8. Senere viste Kirichok-laboratoriet kalsiumstrømmer fra IMMer av mus9 og Drosophila vev9. Andre laboratorier bruker nå rutinemessig denne teknikken til å studere de biofysiske egenskapene til MCU 10,11,12,13,14. Hele IMM patch-clamp analyse av kalium og kloridledning er også mulig og har blitt nevnt i flere papirer, men har ennå ikke vært hovedtema for en publikasjon 6,7,9. Den første målingen av H + strømmer over IMM ble rapportert i 2012 fra musbrun fett mitokondrier6, og fra mus beige fett mitokondrier i 20177. Denne strømmen skyldes det spesifikke frakoblingsproteinet av termogent vev, UCP1 6,7. Nyere arbeid publisert i 2019 karakteriserte AAC som det viktigste proteinet som er ansvarlig for mitokondrie H + lekkasje i ikke-fettvev som hjerte og skjelettmuskulatur5.
Denne unike tilnærmingen gir nå mulighet for direkte høyoppløselig funksjonell analyse av mitokondrieionkanaler og transportører som er ansvarlige for mitokondrietermogenese. For å lette utvidelsen av metoden og for å utfylle andre studier som mitokondrie-respirasjon, er en detaljert protokoll beskrevet nedenfor for måling av H + strømninger som bæres av UCP1 og AAC. Tre viktige trinn er beskrevet: 1) mitokondrieisolasjon fra musbrunt fett for å analysere UCP1-avhengig H + strøm og mitokondrieisolasjon fra hjertet for å analysere AAC-avhengig H + strøm, 2) tilberedning av mitoplaster med en fransk presse for mekanisk brudd på den ytre mitokondriemembranen (OMM), 3) patch-klemmeopptak av UCP1 og AAC-avhengige H + strømmer over hele IMM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% gelatin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60X water immersion objective, numerical aperture 1.20</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO60XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF150-86-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1550B Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Press</td>
			<td>Glen Mills</td>
			<td>5500-000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inversed Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71 or IX73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Forge</td>
			<td>(Narishige)</td>
			<td>MF-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanupulator MPC-385</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>FG-MPC325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode holder for agar bridge</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH3F4515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>(Sutter Instruments)</td>
			<td>P97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Cell for French Press</td>
			<td>Glen Mills</td>
			<td>5500-FA-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIXER IKA 6-2000RPM</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-50705-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 100X magnification</td>
			<td>Nikon&#160; lens</td>
			<td>MPlan 100/0.80 ELWD 210/0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pClamp 10</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-24E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>358039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75 009 521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table</td>
			<td>Newport</td>
			<td>VIS3036-SG2-325A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-gluconic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>M4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>3777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>60128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>63068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>331635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisBase</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisCl</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of the patch-clamp technique to study the thermogenic capacity of mitochondria

Mitokondrietermogenese (også kjent som mitokondrie-frakobling) er et av de mest lovende målene for å øke energiforbruket for å bekjempe metabolsk syndrom. Termogene vev som brunt og beige fett utvikler svært spesialiserte mitokondrier for varmeproduksjon. Mitokondrier av andre vev, som primært produserer ATP, konverterer også opptil 25% av den totale mitokondrieenergiproduksjonen til varme og kan derfor ha en betydelig innvirkning på fysiologien til hele kroppen. Mitokondrietermogenese er ikke bare viktig for å opprettholde kroppstemperaturen, men forhindrer også diettindusert fedme og reduserer produksjonen av reaktive oksygenarter (ROS) for å beskytte celler mot oksidativ skade. Siden mitokondrietermogenese er en nøkkelregulator for cellulær metabolisme, vil en mekanistisk forståelse av denne grunnleggende prosessen hjelpe i utviklingen av terapeutiske strategier for å bekjempe mange patologier forbundet med mitokondrie dysfunksjon. Det er viktig at de presise molekylære mekanismene som styrer akutt aktivering av termogenese i mitokondrier er dårlig definert. Denne mangelen på informasjon skyldes i stor grad en rekke metoder for direkte måling av frakobling av proteiner. Den nylige utviklingen av patch-clamp metodikk anvendt på mitokondrier aktivert, for første gang, den direkte studien av fenomenet ved opprinnelsen til mitokondrie termogenese, H + lekkasje gjennom IMM, og den første biofysiske karakteriseringen av mitokondrietransportører som er ansvarlige for det, det frakoblingsprotein 1 (UCP1), spesifikk for brune og beige fettstoffer, og ADP / ATP-transportøren (AAC) for alle andre vev. Denne unike tilnærmingen vil gi ny innsikt i mekanismene som styrer H + lekkasje og mitokondrie termogenese og hvordan de kan målrettes mot å bekjempe metabolsk syndrom. Dette dokumentet beskriver patch-clamp-metoden som brukes på mitokondrier for å studere deres termogene kapasitet ved å måle H + strømmer direkte gjennom IMM.

Utviklingen av patch-clamp-metoden som brukes på mitokondrier, ga den første direkte studien av H + lekkasje gjennom IMM og mitokondrietransportører, UCP1 og AAC, som er ansvarlige for den. Den elektrofysiologiske analysen av UCP1- og AAC-avhengige H+ lekkasjer kan gi et første blikk på den termogene kapasiteten til mitokondrier. Resultatdelen beskriver standardprosedyrene for å måle H+ lekkasje via UCP1 og AAC.
UCP1-avhengig H+ gjelde...

Watch this Scientific Journal Video about The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria at JoVE.com

The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria

Denne metodeartikkelen beskriver hovedtrinnene for å måle H + lekkasje over den indre mitokondriemembranen med patch-clamp-teknikken, en ny tilnærming for å studere den termogene kapasiteten til mitokondrier.

Bruken av Patch-Clamp-teknikken for å studere den termogene kapasiteten til mitokondrier

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat ...

Denne protokollen beskriver hvordan patch clamp teknikken kan brukes til å studere den termogene kapasiteten til mitokondrier ved direkte måling mitokondrie proton lekkasje over den indre mitokondriemembranen. Den direkte målingen av protonstrømmen gjennom den indre mitokondriemembranen bidrar til å identifisere og nøyaktig karakterisere de molekylære mekanismene som er ansvarlige for mitokondrietermogenese. Denne teknikken tillater ikke bare å måle protonstrømmen over den indre mitokondriemembranen, men også å studere andre ledninger som er viktige for mitokondriefunksjon, for eksempel kalsium eller metabolitter som adeninkjernerotider.Plasser den euthanized musen på ryggen og spray alkohol for å rengjøre og våte håret. Deretter gjør du et to centimeter snitt på thoraxen. Etter å ha tatt tak i huden med pinsett, dissekerer du hjertet fra dyrets bryst og skyller det for å fjerne alt blodet i et 10 milliliter beger med fem milliliter kald isolasjonsløsning.Når hjertet er ryddet for spor av blod, overfør det til et annet 10 milliliter beger som inneholder fem milliliter kald isolasjonsbuffer og hakk det opp i tynne stykker. Overfør den deretter til en iskjølt 10 milliliter glass homogenisator. Bruk en overhead røre for å homogenisere precut vevet på is med seks milde slag med en kontrollert hastighet på 275 rotasjoner per minutt.Overfør homogenatet til et 15 milliliter iskaldt konisk rør og sentrifuger det ved 700 ganger G i 10 minutter ved fire grader Celsius for å pellet kjernene og ubrutte celler. Samle supernatanten i et friskt 15 milliliterrør og legg det på is. Sentrifuger supernatanten ved 8500 ganger G i 10 minutter ved fire grader Celsius for å få en pellets som inneholder mitokondriene.Resuspend mitokondrie pellet i 3,8 milliliter iskald hypertonisk mannitol buffer og inkuber mitokondrie suspensjon på is i 10 til 15 minutter. Fyll mitokondrie hypertonisk mannitol suspensjon i en nedkjølt mini-trykkcelle av fransk presse. Deretter plasserer du cellen på den franske pressen.Velg deretter den lave modusen til den franske pressen og komprimer suspensjonen gjennom minitrykkcellen ved 110 på skiven for de brune fett mitokondriene, og ved 140 for hjertegetokondriene, og sørg for at suspensjonen kommer ut av minitrykkcellen med en hastighet på omtrent en dråpe per sekund. Samle dråpene i et 15 milliliter iskjølt konisk rør. Sentrifuger suspensjonen ved 10.500 ganger G i 10 minutter ved fire grader Celsius.Resuspend mitoplasts pellet i 0,5 til 2 milliliter iskald hypertonisk kaliumkloridbuffer og lagre suspensjonen på is. Trekk borosilikatglassfilamentene på innspillingsdagen ved hjelp av en mikropipettetrekker, og angi et program på trekkeren som brukes til å generere pipetter med høy grad av reproduserbarhet. Sett inn en glassfilament i trekkeren og trekk for å få nesten to identiske patchpipetter fra en borosilikatfilament.Juster programmet når pipetter blir inkonsekvente mellom trekksykluser på grunn av aldring av varmeboksens filament av trekkeren. Plasser pipetten inne i pipettepusseren og plasser spissen nær filamentet under 100X forstørrelse for å tenne den. Trykk på fotpedalen flere ganger for å varme opp filamentet uten å tette eller skade spisskurven.Polish til pipettene har en motstand mellom 25 og 35 megaohms oppnås når de fylles med TMA-basert pipetteoppløsning. For-inkuber deksel glir med 0,1% gelatin for å redusere mitoplastadhesjonen og skyll dem med kaliumkloridbadløsningen før du deponerer mitoplastfjæringen. Forbered en rå fortynning ved å blande ca. 35 mikroliter av den konsentrerte mitoplastfjæringen med 500 mikroliter kaliumkloridbadløsning og legg den på dekselskliene som tidligere var plassert i en brønn på en firebrønnsplate.Inkuber på is i 15 til 20 minutter for mitoplaster å sedimentere ned dekkslippet. Fyll badekammeret helt med ca. 50 mikroliter av kaliumkloridbadløsningen og overfør en dekselglidning med mitoplaster i kammeret ved hjelp av tynne mikrodesinfeksjons pinsett med bøyd spiss. Ordne dekselet på bunnen av kammeret uten å parfyme kammeret for å holde mitoplastene stabile på dekselslippet.Velg en individuell ikke-klebende mitoplast ved å skanne dekselslippet under mikroskopet med et 60X mål. Legg pipetten med pipetteoppløsningen og legg den i pipetteholderen. Ta pipetten inn i badeløsningen med en mikromanipulator og flytt den like over den valgte mitoplasten for å komme nær IMM.Hold membranpotensialet på null millivolt og påfør 10 millivoltpulser ved hjelp av membrantestkommandoen i forsterkerprogrammet. Påfør et lite negativt trykk for raskt å skape en gigaseal med IMM. Løft pipetten med mitoplasten festet for å holde dem borte fra dekselslippet for å unngå tetningsbrudd på grunn av pipettedrift under eksperimentet.Kompenser de bortkomne kapasitans forbigående transientene med membrantestkommandoen i forsterkerprogrammet før du tester hele mitoplastkonfigurasjonen for å oppnå riktig kapasitansmåling for mitoplastmembranen etter innbruddet. Påfør spenningspulser med kort varighet med forsterkerprogrammet for å sprekke membranplasten under glasspipetten og oppnå hele mitoplastkonfigurasjonen. Etter innbruddet monterer du kapasitanstransientene med forsterkerprogrammets membrantestalternativ for å vurdere membrankapasitansen og tilgangsmotstanden.Umiddelbart etter innbruddet, bytt ut kaliumkloridbadløsningen med en HEPES-badeløsning via perfusjon. Påfør en rampeprotokoll på 850 millisekunder med forsterkerprogrammet. Påføring av spenningsrampeprotokollen induserer en protonstrøm med stor amplitude over IMM av brunt fett uten tilsetning av eksogene fettsyrer, de nødvendige aktivatorene til UCPer.Etter perfusjon av enten UCP1-hemmer guanosindifosfat eller 10 millimolar metyl beta cyclodextrin for endogen membranfettsyreutvinning, brukes reststrømmen til å bestemme amplituden til UCP1-strømmene, som forsvinner helt i IMM av UCP1-mangelfulle mus. I motsetning til brunt fett utvikler IMM av ikke-fettvev, som skjelettmuskulatur og hjerte, ikke en målbar protonstrøm umiddelbart etter innbruddet. For å indusere en målbar protonstrøm gjennom AAC, er det viktig å bruke HEPES-badeløsningen som inneholder en til to mikromolar av eksogene fettsyrer.For å bekrefte at den målte protonstrømmen bæres av AAC, er det viktig å bruke spesifikke hemmere, karboxyatractyloside, som nesten helt hemmer protonstrøm vist i IMM av AAC1-mangelfulle mus. En konstant, men aldri fullstendig hemming av protonlekkasje oppnås bare når ADP er til stede på begge sider av membranen for å generere en aktiv nukleotidutveksling via AAC. Kvaliteten på mitoplastpreparatet vil påvirke suksessraten for å oppnå hele mitoplastkonfigurasjonen.Det er viktig å optimalisere det. Når den molekylære mekanismen for mitokondrietermogenese er dissekert med patchklemmeteknikken, vil måling av mitokondrie oksygenforbruk demonstrere betydningen av protonstrøm og termogenese i intakt mitokondrier. Denne teknikken åpner for at forskere kan utforske alle slags ledninger, ioner og metabolitter som er viktige for mitokondrienes funksjon.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

Multi-parameter Måling av permeabilitet Transition pore åpningen i Isolert Mouse Hjerte Mitokondrier

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

En kanal Cell-festet Patch-clamp opptak

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

Vurdere sekretoriske Kapasitet av bukspyttkjertelen akinærceller

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Isolering av Mitokondrier fra minimale mengder av Mouse Skeletal Muscle for høy gjennomstrømming Micro respirasjonsmålinger

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Bruken av<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Hel-organ Imaging og kvantitativ Tissue Histologi fastslår Bio-distribusjon av fluorescensmerkede molekyler

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Isolering av mus interstitial ventilceller for å studere forkalkning av aortaventilen in vitro

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) ...