Name: the use of the patch-clamp technique to study the thermogenic capacity of mitochondria
Uploaded: 2021-05-03T15:00:00
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Yuriy Kirichok pela grande ciência da qual fiz parte do laboratório dele e dos membros do laboratório Kirichok pelas discussões úteis. Também agradeço ao Dr. Douglas C. Wallace por fornecer ratos aac1 . Financiamento: A.M.B foi apoiado por um American Heart Association Career Development Award 19CDA34630062.

Todos os procedimentos experimentais animais que foram realizados de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Califórnia em Los Angeles (IACUC).
NOTA: O procedimento de isolamento mitocondrial é baseado na centrifugação diferencial e varia ligeiramente de tecido para tecido. Por exemplo, uma vez que o tecido adiposo marrom é extremamente rico em lipídios, requer um passo adicio...

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Este artigo de método visa apresentar a técnica de grampo de remendo recentemente aplicada às mitocôndrias, uma nova abordagem para estudar diretamente o vazamento de H+ através do IMM responsável pela termogênese mitocondrial 5,6,7,15. Esta técnica não se limita aos tecidos e também pode ser usada para analisar vazamento de H+ e outras conduções do IMM em dife...

Mitocôndrias são famosas por serem a potência da célula. Na verdade, eles são a principal fonte de energia química, ATP. O que é menos conhecido é que mitocôndrias também geram calor. De fato, cada mitocôndria constantemente gera os dois tipos de energias (ATP e calor) e um equilíbrio fino entre as duas formas de energia define homeostase de células metabólicas (Figura 1). Como as mitocôndrias distribuem energia entre ATP e calor é certamente a questão mais fundamental no campo da bioenergetics, embora ainda seja amplamente desconhecida. Sabemos que o aumento da produção de calor mitocondrial (chamada termogênese mitocondrial), e consequentemente reduzir a produção de ATP aumenta o gasto energético e esta é uma das melhores formas de combater a síndrome metabólica1.
A termogênese mitocondrial origina-se do vazamento de H+ através da membrana mitocondrial interna (IMM), levando ao desacoplamento da oxidação do substrato e da síntese de ATP com consequente produção de calor, daí o nome "desacoplamento mitocondrial"1 (Figura 1). Este vazamento H+ depende de transportadores mitocondriais chamados proteínas de desacoplamento (UCPs). A UCP1 foi a primeira UCP identificada. É expressa apenas em tecidos termogênicos, gordura marrom e gordura bege em que mitocôndrias são especializadas para produção de calor 2,3,4. A identidade da UCP em tecidos não adiposos, como músculo esquelético, coração e fígado, tem permanecido controversa. Mitocôndrias nesses tecidos podem ter cerca de 25% da energia mitocondrial total convertida em calor, o que pode impactar significativamente a fisiologia de todo o corpo1. Além de manter a temperatura corporal do núcleo, a termogênese mitocondrial também previne a obesidade induzida pela dieta, reduzindo as calorias. Além disso, reduz a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) por mitocôndrias para proteger as células de danos oxidativos1. Assim, a termogênese mitocondrial está envolvida no envelhecimento normal, distúrbios degenerativos relacionados à idade e outras condições que envolvem estresse oxidativo, como isquemia-reperfusão. Portanto, a termogênese mitocondrial é um poderoso regulador do metabolismo celular, e uma compreensão mecanicista desse processo fundamental promoverá o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para combater muitas patologias associadas à disfunção mitocondrial.
A respiração mitocondrial foi a primeira técnica a revelar o papel crucial da termogênese mitocondrial no metabolismo celular e ainda é a mais popular na comunidade1. Esta técnica é baseada na medição do consumo de oxigênio pela cadeia de transporte de elétrons mitocondrial (ETC) que aumenta quando o vazamento mitocondrial H+ é ativado. Esta técnica, embora instrumental, não pode estudar diretamente o vazamento mitocondrial H+ através do IMM1, dificultando assim a identificação e caracterização precisas das proteínas responsáveis por isso, particularmente em tecidos não adiposos em que a produção de calor é secundária em comparação com a produção de ATP. Recentemente, o desenvolvimento da técnica de grampo de remendo aplicada às mitocôndrias, forneceu o primeiro estudo direto do vazamento de H+ em todo o IMM em vários tecidos 5,6,7.
O grampo mitocondrial de toda a IMM foi estabelecido pela primeira vez de forma reprodutível por Kirichok et al.8. Eles descreveram a primeira medição direta das correntes mitocondriais de cálcio (MCU) em 2004 usando mitoplastos das linhas celulares COS-78. Mais tarde, o laboratório de Kirichok mostrou correntes de cálcio de IMMs de tecidos de camundongo9 e Drosophila 9. Outros laboratórios agora usam essa técnica rotineiramente para estudar as propriedades biofísicas da MCU 10,11,12,13,14. A análise completa do grampo de remendo do IMM da condutância de potássio e cloreto também é possível e foi mencionada em vários artigos, mas ainda não foi o tema principal de uma publicação 6,7,9. A primeira medição das correntes H+ em todo o IMM foi relatada em 2012 a partir de mitocôndrias de gorduramarrom-rato 6, e de mitocôndrias de gordura bege do rato em 20177. Esta corrente é devido à proteína de desacoplamento específica dos tecidos termogênicos, UCP1 6,7. Trabalho recente publicado em 2019 caracterizou a AAC como a principal proteína responsável pelo vazamento mitocondrial H+ em tecidos não adiposos, como o coração e o músculo esquelético5.
Esta abordagem única agora permite a análise funcional direta de alta resolução dos canais mitocondriais e transportadores responsáveis pela termogênese mitocondrial. Para facilitar a expansão do método e complementar outros estudos como a respiração mitocondrial, um protocolo detalhado é descrito abaixo para medir as correntes H+ transportadas pela UCP1 e AAC. Três passos importantes são descritos: 1) isolamento mitocondrial da gordura marrom do rato para analisar a corrente H+ dependente de UCP1 e o isolamento mitocondrial do coração para analisar a corrente H+ dependente de AAC, 2) preparação de mitoplastos com uma prensa francesa para ruptura mecânica da membrana mitocondrial externa (OMM), 3) gravações de grampos de remendo de UCP1 e correntes H+ dependentes de AAC em todo o IMM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% gelatin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60X water immersion objective, numerical aperture 1.20</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO60XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF150-86-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1550B Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Press</td>
			<td>Glen Mills</td>
			<td>5500-000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inversed Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71 or IX73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Forge</td>
			<td>(Narishige)</td>
			<td>MF-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanupulator MPC-385</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>FG-MPC325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode holder for agar bridge</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH3F4515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>(Sutter Instruments)</td>
			<td>P97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Cell for French Press</td>
			<td>Glen Mills</td>
			<td>5500-FA-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIXER IKA 6-2000RPM</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-50705-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 100X magnification</td>
			<td>Nikon&#160; lens</td>
			<td>MPlan 100/0.80 ELWD 210/0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pClamp 10</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-24E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>358039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75 009 521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table</td>
			<td>Newport</td>
			<td>VIS3036-SG2-325A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-gluconic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>M4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>3777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>60128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>63068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>331635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisBase</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisCl</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of the patch-clamp technique to study the thermogenic capacity of mitochondria

A termogênese mitocondrial (também conhecida como desacoplamento mitocondrial) é uma das metas mais promissoras para aumentar o gasto energético para combater a síndrome metabólica. Tecidos termogênicos como gorduras marrons e bege desenvolvem mitocôndrias altamente especializadas para produção de calor. Mitocôndrias de outros tecidos, que produzem principalmente ATP, também convertem até 25% da produção total de energia mitocondrial em calor e podem, portanto, ter um impacto considerável na fisiologia de todo o corpo. A termogênese mitocondrial não é apenas essencial para manter a temperatura corporal, mas também previne a obesidade induzida pela dieta e reduz a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) para proteger as células contra danos oxidativos. Uma vez que a termogênese mitocondrial é um dos principais reguladores do metabolismo celular, uma compreensão mecanicista desse processo fundamental ajudará no desenvolvimento de estratégias terapêuticas para combater muitas patologias associadas à disfunção mitocondrial. É importante ressaltar que os mecanismos moleculares precisos que controlam a ativação aguda da termogênese nas mitocôndrias são mal definidos. Essa falta de informação deve-se, em grande parte, à escassez de métodos para a medição direta de proteínas desacoplamento. O desenvolvimento recente da metodologia de patch-clamp aplicada às mitocôndrias possibilitou, pela primeira vez, o estudo direto do fenômeno na origem da termogênese mitocondrial, o vazamento de H+ através do IMM, e a primeira caracterização biofísica dos transportadores mitocondriais responsáveis por ele, a proteína desacoplamento 1 (UCP1), específica das gorduras marrom e bege, e o transporte ADP/ATP (AAC) para todos os outros tecidos. Esta abordagem única fornecerá novas percepções sobre os mecanismos que controlam o vazamento de H+ e a termogênese mitocondrial e como eles podem ser direcionados para combater a síndrome metabólica. Este artigo descreve a metodologia de grampo de remendo aplicada às mitocôndrias para estudar sua capacidade termogênica medindo diretamente as correntes H+ através do IMM.

O desenvolvimento da metodologia de grampo de remendo aplicado às mitocôndrias proporcionou o primeiro estudo direto do vazamento de H+ através do IMM e dos transportadores mitocondriais, UCP1 e AAC, responsáveis por isso. A análise eletrofisiológica dos vazamentos H+ dependentes de UCP1 e AAC pode fornecer um primeiro olhar da capacidade termogênica das mitocôndrias. A seção de resultados descreve os procedimentos padrão para medir o vazamento de H+ via UCP1 e AAC.
<p clas...

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The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria

Este artigo de método detalha os principais passos na medição do vazamento de H+ através da membrana mitocondrial interna com a técnica de patch-clamp, uma nova abordagem para estudar a capacidade termogênica das mitocôndrias.

O uso da técnica de grampo de remendo para estudar a capacidade termogênica das mitocôndrias

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat ...

Este protocolo descreve como a técnica de grampo de remendo pode ser usada para estudar a capacidade termogênica das mitocôndrias medindo diretamente o vazamento de prótons mitocondriais através da membrana mitocondrial interna. A medição direta da corrente de próton através da membrana mitocondrial interna ajuda a identificar e caracterizar precisamente os mecanismos moleculares responsáveis pela termogênese mitocondrial. Esta técnica permite não apenas medir a corrente de prótons através da membrana mitocondrial interna, mas também estudar outras condutas importantes para a função mitocondrial, como cálcio ou metabólitos como nucleotídeos de adenina.Posicione o rato eutanizado nas costas e pulverize o álcool para limpar e molhar o cabelo. Então, faça uma incisão de dois centímetros no tórax. Depois de agarrar a pele com pinças, disseque o coração do peito do animal e enxágue-o para remover todo o sangue em um béquer de 10 mililitros com cinco mililitros de solução de isolamento frio.Uma vez que o coração tenha sido limpo de vestígios de sangue, transfira-o para outro béquer de 10 mililitros contendo cinco mililitros de tampão de isolamento frio e corte-o em pedaços finos. Em seguida, transfira para um homogeneizador de vidro de 10 mililitros refrigerados no gelo. Use um agitador aéreo para homogeneizar o tecido pré-cortado no gelo com seis golpes suaves a uma velocidade controlada de 275 rotações por minuto.Transfira o homogene de homogeneização para um tubo cônico gelado de 15 mililitros e centrifuá-lo a 700 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius para pelotar os núcleos e células ininterruptas. Colete o supernatante em um tubo fresco de 15 mililitros e coloque-o no gelo. Centrifugar o supernante a 8.500 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius para obter uma pelota contendo as mitocôndrias.Resuspend a pelota mitocondrial em 3,8 mililitros de tampão de mannitol hipertônico frio e incubar a suspensão mitocondrial no gelo por 10 a 15 minutos. Preencha a suspensão de manitol hipertônico mitocondrial em uma célula de mini-pressão refrigerada da imprensa francesa. Então, coloque a célula na imprensa francesa.Em seguida, selecione o modo baixo da prensa francesa e comprima a suspensão através da célula de mini-pressão a 110 no mostrador para as mitocôndrias de gordura marrom, e a 140 para as mitocôndrias cardíacas, garantindo que a suspensão saia da célula de mini-pressão a uma taxa de cerca de uma gota por segundo. Colete as gotas em um tubo cônico refrigerado por gelo de 15 mililitros. Centrifugar a suspensão a 10,500 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius.Resuspenda a pelota mitoplasta em 0,5 a 2 mililitros de tampão de cloreto de potássio hipertônico frio e armazene a suspensão no gelo. Puxe os filamentos de vidro borossilicato no dia da gravação usando um puxador de micropipette, definindo um programa no puxador usado para gerar pipetas com alto grau de reprodutibilidade. Insira um filamento de vidro dentro do puxador e puxe para obter quase duas pipetas de remendo idênticas de um filamento borossilicato.Ajuste o programa quando as pipetas se tornarem inconsistentes entre os ciclos de puxar devido ao envelhecimento do filamento da caixa de aquecimento do puxador. Posicione a pipeta dentro do polidor de pipeta e coloque a ponta perto do filamento sob a ampliação de 100X para acioná-la. Pressione o pedal do pé várias vezes para aquecer o filamento sem entupir ou danificar a curva da ponta.Polonês até que as pipetas tenham uma resistência entre 25 e 35 megaohms são obtidos quando preenchidos com solução de pipeta baseada em TMA. A cobertura pré-incubada desliza com 0,1% de gelatina para reduzir a adesão mitoplastia e enxágüá-las com a solução de banho de cloreto de potássio antes de depositar a suspensão mitoplasta. Prepare uma diluição bruta misturando aproximadamente 35 microliters da suspensão mitoplastia concentrada com 500 microliters da solução de banho de cloreto de potássio e coloque-o nos deslizamentos de cobertura previamente colocados em um poço de uma placa de quatro poços.Incubar no gelo por 15 a 20 minutos para mitoplastos sedimentarem o deslizamento da tampa. Encha completamente a câmara de banho com aproximadamente 50 microlitres da solução de banho de cloreto de potássio e transfira um deslizamento de cobertura com mitoplastos dentro da câmara usando pinças finas de microdisseção com uma ponta dobrada. Disponha o deslizamento de cobertura na parte inferior da câmara sem perfumar a câmara para manter os mitoplastos estáveis no deslizamento de cobertura.Escolha um mitoplastia não adesiva individual escaneando o deslizamento da tampa sob o microscópio com um objetivo de 60X. Carregue a pipeta com a solução de pipeta e coloque-a no porta-pipetas. Leve a pipeta para a solução de banho com um micromanipulador e mova-a logo acima do mitoplasto selecionado para chegar perto do IMM.Segure o potencial da membrana em zero milvolts e aplique 10 pulsos de milívola usando o comando de teste de membrana no programa do amplificador. Aplique uma leve pressão negativa para criar rapidamente um gigaseal com o IMM. Levante a pipeta com o mitoplasto anexado para mantê-los longe do deslizamento da tampa para evitar a quebra da vedação devido à deriva da pipeta durante o experimento.Compense os transitórios de capacitância desviada com o comando de teste de membrana no programa do amplificador antes de testar a configuração de mitoplasto completo para obter uma medição correta de capacitância para a membrana mitoplasta após a invasão. Aplique pulsos de tensão de curta duração com o programa do amplificador para romper o patch de membrana sob a pipeta de vidro e alcançar a configuração de mitoplasto inteiro. Após a invasão, encaixe os transitórios de capacitância com a opção de teste de membrana do programa do amplificador para avaliar a capacitância da membrana e sua resistência ao acesso.Imediatamente após a invasão, substitua a solução de banho de cloreto de potássio por uma solução de banho HEPES por perfusão. Aplique um protocolo de rampa de 850 milissegundos com o programa do amplificador. A aplicação do protocolo de rampa de tensão induz uma corrente de próton de grande amplitude em toda a IMM de gordura marrom sem a adição de ácidos graxos exógenos, os ativadores necessários de UCPs.Após a perfusão pelo inibidor ucp1 difosfato de guanosina ou ciclodextrina beta de 10 milimolar para a extração de ácido graxo de membrana endógena, a corrente residual é usada para determinar a amplitude das correntes UCP1, que desaparece completamente no IMM de camundongos deficientes ucp1. Ao contrário da gordura marrom, o IMM de tecidos não adiposos, como músculo esquelético e coração, não desenvolve uma corrente de próton mensurável imediatamente após a invasão. Para induzir uma corrente de próton mensurável através da AAC, é essencial aplicar a solução de banho HEPES contendo um a dois micromolar de ácidos graxos exógenos.Para confirmar que a corrente de próton medido é transportada pela AAC, é importante aplicar inibidores específicos, carboxyatractyloside, que quase inibem completamente a corrente de prótons mostrada no IMM de camundongos deficientes AAC1. Uma inibição constante, mas nunca completa do vazamento de prótons, só é alcançada quando a ADP está presente em ambos os lados da membrana para gerar uma troca ativa de nucleotídeos via AAC. A qualidade da preparação do mitoplast influenciará a taxa de sucesso na obtenção da configuração de mitoplasto.É essencial otimizá-lo. Uma vez que o mecanismo molecular da termogênese mitocondrial é dissecado com a técnica de grampo de remendo, a medição do consumo mitocondrial de oxigênio demonstrará a importância da corrente de prótons e da termogênese em mitocôndrias intactas. Essa técnica abre caminho para os pesquisadores explorarem todos os tipos de condutâncias, íons e metabólitos importantes para o funcionamento das mitocôndrias.

Research

JoVE Journal

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Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

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Gerados por computador Modelo Estímulos animal

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Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

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The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

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O uso de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Imagem de órgãos inteiros e Histologia Tissue quantitativa para determinar o Bio-distribuição das moléculas fluorescente etiquetado

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