Name: the use of the patch-clamp technique to study the thermogenic capacity of mitochondria
Uploaded: 2021-05-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria at JoVE.com

Я благодарю доктора Юрия Киричка за великую науку, частью которой я был в его лаборатории, и членов лаборатории Киричка за полезные дискуссии. Я также благодарю доктора Дугласа К. Уоллеса за предоставление нокаутирующих мышей AAC1 . Финансирование: A.M.B была поддержана премией Американской кардиологической ассоциации за развитие карьеры 19CDA34630062.

Все экспериментальные процедуры на животных, которые были выполнены, соответствуют руководящим принципам Национального института здравоохранения и были одобрены Калифорнийским университетом Лос-Анджелесского институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IAC...

<ol>
	<li>Divakaruni, A. S., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+and+physiology+of+mitochondrial+proton+leak.">The regulation and physiology of mitochondrial proton leak.</a> Physiology (Bethesda). 26 (3), 192-205 (2011).</li><li>Chouchani, E. T., Kazak, L., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+advances+in+adaptive+thermogenesis:+UCP1+and+beyond.">New advances in adaptive thermogenesis: UCP1 and beyond.</a> Cell Metabolism. 29 (1), 27-37 (2019).</li><li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue:+function+and+physiological+significance.">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).</li><li>Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hunt+for+the+molecular+mechanism+of+brown+fat+thermogenesis.">The hunt for the molecular mechanism of brown fat thermogenesis.</a> Biochimie. 134, 9-18 (2017).</li><li>Bertholet, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H(+)+transport+is+an+integral+function+of+the+mitochondrial+ADP/ATP+carrier.">H(+) transport is an integral function of the mitochondrial ADP/ATP carrier.</a> Nature. 571 (7766), 515-520 (2019).</li><li>Fedorenko, A., Lishko, P. V., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+fatty-acid-dependent+UCP1+uncoupling+in+brown+fat+mitochondria.">Mechanism of fatty-acid-dependent UCP1 uncoupling in brown fat mitochondria.</a> Cell. 151 (2), 400-413 (2012).</li><li>Bertholet, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+patch+clamp+of+beige+adipocytes+reveals+UCP1-positive+and+UCP1-negative+cells+both+exhibiting+futile+creatine+cycling.">Mitochondrial patch clamp of beige adipocytes reveals UCP1-positive and UCP1-negative cells both exhibiting futile creatine cycling.</a> Cell Metabolism. 25 (4), 811-822 (2017).</li><li>Kirichok, Y., Krapivinsky, G., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+calcium+uniporter+is+a+highly+selective+ion+channel.">The mitochondrial calcium uniporter is a highly selective ion channel.</a> Nature. 427 (6972), 360-364 (2004).</li><li>Fieni, F., Lee, S. B., Jan, Y. N., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter+varies+greatly+between+tissues.">Activity of the mitochondrial calcium uniporter varies greatly between tissues.</a> Nature Communications. 3, 1317 (2012).</li><li>Chaudhuri, D., Sancak, Y., Mootha, V. K., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCU+encodes+the+pore+conducting+mitochondrial+calcium+currents.">MCU encodes the pore conducting mitochondrial calcium currents.</a> eLife. 2, 00704 (2013).</li><li>Vais, H., Payne, R., Paudel, U., Li, C., Foskett, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+transmembrane+mechanisms+control+MCU-mediated+mitochondrial+Ca(2+)+uptake.">Coupled transmembrane mechanisms control MCU-mediated mitochondrial Ca(2+) uptake.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21731-21739 (2020).</li><li>Vais, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMRE+is+a+matrix+Ca(2+)+sensor+that+governs+gatekeeping+of+the+mitochondrial+Ca(2+)+uniporter.">EMRE is a matrix Ca(2+) sensor that governs gatekeeping of the mitochondrial Ca(2+) uniporter.</a> Cell Reports. 14 (3), 403-410 (2016).</li><li>Vais, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCUR1,+CCDC90A,+is+a+regulator+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">MCUR1, CCDC90A, is a regulator of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Cell Metabolism. 22 (4), 533-535 (2015).</li><li>Kamer, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MICU1+imparts+the+mitochondrial+uniporter+with+the+ability+to+discriminate+between+Ca(2+)+and+Mn(2+).">MICU1 imparts the mitochondrial uniporter with the ability to discriminate between Ca(2+) and Mn(2+).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 7960-7969 (2018).</li><li>Bertholet, A. M., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+analysis+of+the+mitochondrial+H(+)+leak+in+brown+and+beige+fat.">Patch-clamp analysis of the mitochondrial H(+) leak in brown and beige fat.</a> Frontiers in Physiology. 11, 326 (2020).</li><li>Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization,+identification,+and+excision+of+murine+adipose+depots.">Localization, identification, and excision of murine adipose depots.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52174 (2014).</li><li>Garg, V., Kirichok, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+analysis+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">Patch-clamp analysis of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Methods in Molecular Biology. 1925, 75-86 (2019).</li><li>Decker, G. L., Greenawalt, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+and+biochemical+studies+of+mitoplasts+and+outer+membranes+derived+from+French-pressed+mitochondria.+Advances+in+mitochondrial+subfractionation.">Ultrastructural and biochemical studies of mitoplasts and outer membranes derived from French-pressed mitochondria. Advances in mitochondrial subfractionation.</a> Journal of Ultrastructure Research. 59 (1), 44-56 (1977).</li><li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+electrical+currents+across+the+plasma+membrane+of+mammalian+sperm+cells.">Recording electrical currents across the plasma membrane of mammalian sperm cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), (2021).</li><li>Flaming, D. G., Brown, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropipette+puller+design:+form+of+the+heating+filament+and+effects+of+filament+width+on+tip+length+and+diameter.">Micropipette puller design: form of the heating filament and effects of filament width on tip length and diameter.</a> Journal of Neuroscience Methods. 6 (1-2), 91-102 (1982).</li><li>Klingenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ADP+and+ATP+transport+in+mitochondria+and+its+carrier.">The ADP and ATP transport in mitochondria and its carrier.</a> Biochimica and Biophysica Acta. 1778 (10), 1978-2021 (2008).</li></ol>

Эта статья о методе направлена на то, чтобы представить метод зажимов, недавно примененный к митохондриям, новый подход к непосредственному изучению утечки H+ через IMM, ответственный за митохондриальный термогенез 5,6,7,15.<sup cla...

Митохондрии славятся тем, что являются электростанцией клетки. Действительно, они являются основным источником химической энергии, АТФ. Что менее известно, так это то, что митохондрии также генерируют тепло. Фактически, каждая митохондрия постоянно генерирует два типа энергий (АТФ и тепло), а тонкий баланс между двумя энергетическими формами определяет метаболический гомеостаз клеток (рисунок 1). Как митохондрии распределяют энергию между АТФ и теплом, безусловно, является самым фундаментальным вопросом в области биоэнергетики, хотя он до сих пор в значительной степени неизвестен. Мы знаем, что увеличение производства митохондриального тепла (называемое митохондриальным термогенезом) и, следовательно, снижение производства АТФ увеличивает расход энергии, и это один из лучших способов борьбы с метаболическим синдромом1.
Митохондриальный термогенез возникает из-за утечки H+ через внутреннюю митохондриальную мембрану (IMM), что приводит к разъединению окисления субстрата и синтеза АТФ с последующим производством тепла, отсюда и название «митохондриальное разъединение»1 (рисунок 1). Эта утечка H+ зависит от митохондриальных транспортеров, называемых разъединяющими белками (UCP). UCP1 был первым идентифицированным UCP. Он выражается только в термогенных тканях, буром жире и бежевом жире, в которых митохондрии специализируются на производстве тепла 2,3,4. Идентичность UCP в нежировых тканях, таких как скелетные мышцы, сердце и печень, остается спорной. Митохондрии в этих тканях могут иметь около 25% общей митохондриальной энергии, преобразованной в тепло, что может значительно повлиять на физиологию всего тела1. Помимо поддержания температуры тела, митохондриальный термогенез также предотвращает ожирение, вызванное диетой, уменьшая калории. Кроме того, он уменьшает выработку активных форм кислорода (АФК) митохондриями для защиты клеток от окислительного повреждения1. Таким образом, митохондриальный термогенез участвует в нормальном старении, возрастных дегенеративных расстройствах и других состояниях, связанных с окислительным стрессом, таких как ишемия-реперфузия. Поэтому митохондриальный термогенез является мощным регулятором клеточного метаболизма, и механистическое понимание этого фундаментального процесса будет способствовать разработке терапевтических стратегий борьбы со многими патологиями, связанными с митохондриальной дисфункцией.
Митохондриальное дыхание было первым методом, раскрывшим решающую роль митохондриального термогенеза в клеточном метаболизме и до сих пор является самым популярным в сообществе1. Этот метод основан на измерении потребления кислорода митохондриальной цепью переноса электронов (ETC), которая увеличивается при активации утечки митохондриального H+. Этот метод, хотя и инструментальный, не может непосредственно изучать утечку митохондриального H+ через IMM1, тем самым затрудняя точную идентификацию и характеристику белков, ответственных за него, особенно в нежировых тканях, в которых производство тепла является вторичным по сравнению с производством АТФ. Недавно разработка метода пластыря-зажима, применяемого к митохондриям, обеспечила первое прямое исследование утечки H+ по всему ИММ в различных тканях 5,6,7.
Митохондриальный пластырь-зажим всего ИММ был впервые установлен воспроизводимым способом Kirichok et al.8. Они описали первое прямое измерение токов митохондриального юнипортера кальция (MCU) в 2004 году с использованием митопластов из клеточных линий COS-78. Позже лаборатория Kirichok показала токи кальция из IMM тканей мыши9 и дрозофилы 9. Другие лаборатории в настоящее время регулярно используют этот метод для изучения биофизических свойств MCU 10,11,12,13,14. Анализ проводимости калия и хлорида также возможен и упоминался в нескольких статьях, но еще не был основным предметом публикации 6,7,9. Первое измерение токов H+ через IMM было зарегистрировано в 2012 году из митохондрий бурого жира мыши6 и из митохондрий мышиного бежевого жира в 2017году 7. Этот ток обусловлен специфическим разъединяющим белком термогенных тканей UCP1 6,7. Недавняя работа, опубликованная в 2019 году, охарактеризовала AAC как основной белок, ответственный за утечку митохондриального H+ в нежировых тканях, таких как сердце и скелетные мышцы5.
Этот уникальный подход теперь позволяет проводить прямой функциональный анализ с высоким разрешением митохондриальных ионных каналов и транспортеров, ответственных за митохондриальный термогенез. Чтобы облегчить расширение метода и дополнить другие исследования, такие как митохондриальное дыхание, ниже описан подробный протокол измерения токов H+ , переносимых UCP1 и AAC. Описаны три важных шага: 1) выделение митохондрий из мышиного бурого жира для анализа UCP1-зависимого тока H+ и митохондриальная изоляция от сердца для анализа AAC-зависимого тока H+ , 2) подготовка митопластов с помощью френч-пресса для механического разрыва внешней митохондриальной мембраны (OMM), 3) записи зажимов UCP1 и AAC-зависимых токов H+ по всему ИММ.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% gelatin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60X water immersion objective, numerical aperture 1.20</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO60XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF150-86-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1550B Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Press</td>
			<td>Glen Mills</td>
			<td>5500-000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inversed Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71 or IX73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Forge</td>
			<td>(Narishige)</td>
			<td>MF-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanupulator MPC-385</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>FG-MPC325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode holder for agar bridge</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH3F4515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>(Sutter Instruments)</td>
			<td>P97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Cell for French Press</td>
			<td>Glen Mills</td>
			<td>5500-FA-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIXER IKA 6-2000RPM</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-50705-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 100X magnification</td>
			<td>Nikon&#160; lens</td>
			<td>MPlan 100/0.80 ELWD 210/0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pClamp 10</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-24E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>358039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75 009 521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table</td>
			<td>Newport</td>
			<td>VIS3036-SG2-325A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-gluconic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>M4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>3777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>60128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>63068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>331635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisBase</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisCl</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of the patch-clamp technique to study the thermogenic capacity of mitochondria

Митохондриальный термогенез (также известный как митохондриальное разъединение) является одной из наиболее перспективных целей для увеличения расхода энергии для борьбы с метаболическим синдромом. Термогенные ткани, такие как коричневые и бежевые жиры, развивают узкоспециализированные митохондрии для производства тепла. Митохондрии других тканей, которые в первую очередь вырабатывают АТФ, также преобразуют до 25% от общего производства митохондриальной энергии в тепло и могут, следовательно, оказывать значительное влияние на физиологию всего организма. Митохондриальный термогенез не только необходим для поддержания температуры тела, но также предотвращает ожирение, вызванное диетой, и снижает выработку активных форм кислорода (АФК) для защиты клеток от окислительного повреждения. Поскольку митохондриальный термогенез является ключевым регулятором клеточного метаболизма, механистическое понимание этого фундаментального процесса поможет в разработке терапевтических стратегий борьбы со многими патологиями, связанными с митохондриальной дисфункцией. Важно отметить, что точные молекулярные механизмы, которые контролируют острую активацию термогенеза в митохондриях, плохо определены. Этот недостаток информации во многом связан с нехваткой методов прямого измерения разъединяющихся белков. Недавняя разработка методологии пластырного зажима, применяемой к митохондриям, позволила впервые непосредственно изучить явление, лежащее в основе митохондриального термогенеза, утечку H+ через ИММ, и первую биофизическую характеристику митохондриальных транспортеров, ответственных за него, разъединяющего белка 1 (UCP1), специфичного для бурых и бежевых жиров, и транспортера АДФ/АТФ (AAC) для всех других тканей. Этот уникальный подход даст новое представление о механизмах, которые контролируют утечку H + и митохондриальный термогенез, и о том, как они могут быть нацелены на борьбу с метаболическим синдромом. В этой статье описывается методология зажимов, применяемая к митохондриям для изучения их термогенной способности путем непосредственного измерения токов H+ через IMM.

Разработка методологии пластырного зажима, применяемой к митохондриям, обеспечила первое прямое исследование утечки H+ через IMM и митохондриальные транспортеры, UCP1 и AAC, которые отвечают за нее. Электрофизиологический анализ UCP1- и AAC-зависимых Утечек H+ может дать первый взгл?...

Watch this Scientific Journal Video about The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria at JoVE.com

The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria

В этой статье подробно описываются основные этапы измерения утечки H+ через внутреннюю митохондриальную мембрану с помощью метода пластырного зажима, нового подхода к изучению термогенной способности митохондрий.

Использование метода patch-clamp для изучения термогенной способности митохондрий

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat ...

Этот протокол описывает, как метод зажима пластыря может быть использован для изучения термогенной способности митохондрий путем непосредственного измерения утечки митохондриального протона через внутреннюю митохондриальную мембрану. Прямое измерение протонного тока через внутреннюю митохондриальную мембрану помогает идентифицировать и точно охарактеризовать молекулярные механизмы, ответственные за митохондриальный термогенез. Этот метод позволяет не только измерить протонный ток через внутреннюю митохондриальную мембрану, но и изучить другие проводки, важные для функции митохондрий, такие как кальций или метаболиты, такие как нуклеотиды аденина.Поместите усыпленную мышь на спину и распылите спирт, чтобы очистить и намочить волосы. Затем делают двухсантиметровый разрез на грудной клетке. Захватив кожу пинцетом, рассекните сердце от груди животного и промойте его, чтобы удалить всю кровь в 10-миллилитровый стакан с пятью миллилитрами раствора холодной изоляции.Как только сердце будет очищено от следов крови, перенесите его на другой 10-миллилитровый стакан, содержащий пять миллилитров буфера холодной изоляции, и измельчите его на тонкие кусочки. Затем переложите его на охлажденный льдом 10-миллилитровый стеклянный гомогенизатор. Используйте верхнюю мешалку для гомогенизации предварительно нарезанной ткани на льду шестью мягкими ударами с контролируемой скоростью 275 оборотов в минуту.Переложите гомогенат в 15-миллилитровую ледяную коническую трубку и центрифугируйте его в 700 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия в гранулы ядер и неразрывных клеток. Соберите супернатант в свежую 15-миллилитровую трубку и положите на лед. Центрифугируйте супернатант в 8, 500 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы получить гранулу, содержащую митохондрии.Повторно суспендировать митохондриальную гранулу в 3,8 миллилитрах ледяного гипертонического маннитолового буфера и инкубировать митохондриальную суспензию на льду в течение 10-15 минут. Заполните митохондриальную гипертоническую суспензию маннитола в охлажденную мини-напорную ячейку французского пресса. Затем поместите ячейку на французский пресс.Затем выберите низкий режим французского пресса и сожмите суспензию через ячейку мини-давления при 110 на циферблате для митохондрий бурого жира и при 140 для митохондрий сердца, гарантируя, что суспензия выходит из ячейки мини-давления со скоростью около одной капли в секунду. Соберите капли в 15-миллилитровую коническую трубку, охлажденную льдом. Центрифугируйте суспензию в 10 500 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.Повторно суспендируют гранулы митопластов в 0,5-2 миллилитрах ледяного гипертонического буфера хлористого калия и хранят суспензию на льду. Потяните боросиликатные стеклянные нити в день записи с помощью съемника микропипетки, установив программу на съемник, используемый для генерации пипеток с высокой степенью воспроизводимости. Вставьте одну стеклянную нить в съемник и потяните, чтобы получить почти две одинаковые патч-пипетки из одной боросиликатной нити.Отрегулируйте программу, когда пипетки становятся непоследовательными между циклами вытягивания из-за старения нити нагревательной коробки съемника. Поместите пипетку внутри полировальной машины для пипетки и поместите наконечник рядом с нитью накаливания под 100-кратным увеличением, чтобы отполировать ее огнем. Нажмите ножную педаль несколько раз, чтобы нагреть нить накала, не забивая и не повреждая кривую наконечника.Полировка до тех пор, пока пипетки не будут иметь сопротивление от 25 до 35 мегаом, получаются при заполнении раствором пипетки на основе TMA. Предварительно инкубационная крышка скользит с 0,1% желатина для уменьшения адгезии митопласта и промывает их раствором для ванны хлорида калия перед нанесением суспензии митопласта. Подготовьте сырое разведение, смешав приблизительно 35 микролитров концентрированной суспензии митопласта с 500 микролитрами раствора для ванны хлорида калия и поместите его на крышку, предварительно помещенную в колодец из четырехлуночной пластины.Насиживайте на льду в течение 15-20 минут, чтобы митопласты отстояли вниз по покровному скольжению. Заполните камеру ванны полностью примерно 50 микролитрами раствора для ванны хлорида калия и переложите крышку с митопластами внутри камеры с помощью тонкого микродиссекционного пинцета с изогнутым наконечником. Расположите крышку в нижней части камеры без перфузии камеры, чтобы митопласты оставались стабильными на крышке.Выберите индивидуальный неадгезивный митопласт, отсканировав крышку под микроскопом с объективом 60X. Загрузите пипетку раствором пипетки и поместите ее в держатель пипетки. Внесите пипетку в раствор ванны с помощью микроманипулятора и переместите ее чуть выше выбранного митопласта, чтобы приблизиться к ИММ.Удерживайте мембранный потенциал на уровне нуля милливольт и применяйте импульсы 10 милливольт с помощью команды мембранного теста в программе усилителя. Примените небольшое отрицательное давление, чтобы быстро создать гигасеал с IMM. Поднимите пипетку с прикрепленным митопластом, чтобы держать их подальше от скольжения крышки, чтобы избежать поломки уплотнения из-за дрейфа пипетки во время эксперимента.Компенсируйте блуждающие емкостные переходные процессы с помощью команды мембранного теста в программе усилителя перед тестированием конфигурации всего митопласта для получения правильного измерения емкости для мембраны митопласта после взлома. Примените кратковременные импульсы напряжения с помощью программы усилителя, чтобы разорвать мембранный пластырь под стеклянной пипеткой и достичь конфигурации всего митопласта. После обкатки установите емкостные переходные процессы с опцией мембранного теста программы усилителя для оценки емкости мембраны и ее сопротивления доступу.Сразу после обкатки замените раствор для ванны хлорида калия раствором для ванны HEPES посредством перфузии. Примените 850-миллисекундный протокол рампы с программой усилителя. Применение протокола рампы напряжения индуцирует протонный ток с большой амплитудой через ИММ бурого жира без добавления экзогенных жирных кислот, необходимых активаторов УКП.После перфузии либо ингибитором UCP1 гуанозиндифосфатом, либо 10-миллимолярным метилбетациклодекстрином для экстракции эндогенной мембраны жирных кислот остаточный ток используется для определения амплитуды токов UCP1, которая полностью исчезает в ИММ мышей с дефицитом UCP1. В отличие от бурого жира, ИММ нежировых тканей, таких как скелетные мышцы и сердце, не развивает измеримый протонный ток сразу после взлома. Чтобы индуцировать измеримый протонный ток через AAC, важно применять раствор для ванны HEPES, содержащий от одного до двух микромоляров экзогенных жирных кислот.Чтобы подтвердить, что измеряемый протонный ток переносится ААС, важно применять специфические ингибиторы, карбоксиатрактилозид, которые почти полностью ингибируют протонный ток, показанный в ИММ мышей с дефицитом AAC1. Постоянное, но никогда не полное ингибирование утечки протонов достигается только тогда, когда АДФ присутствует с обеих сторон мембраны для генерации активного нуклеотидного обмена через ААС. Качество препарата митопласта будет влиять на успешность в достижении конфигурации всего митопласта.Важно его оптимизировать. Как только молекулярный механизм митохондриального термогенеза будет расчленен с помощью метода зажима пластыря, измерение потребления митохондриального кислорода продемонстрирует важность протонного тока и термогенеза в интактных митохондриях. Этот метод открывает исследователям путь к изучению всех видов проводимости, ионов и метаболитов, важных для функционирования митохондрий.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Тестирование зрительной чувствительности к скорости и направления движения в Ящерицы

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Компьютерные Стимулы животной модели

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

Методы Patch Clamp Емкость записи из Чашечка

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Давление полировки Пипетки для улучшения Патч-зажим Запись

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

Multi-параметр измерения проницаемости пор Переход Открытие в изолированном сердце мыши Митохондрии

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Один канал сотового прилагается патч-зажим записи

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

Оценивая секреторную способность ацинарных клетках поджелудочной железы

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Выделение митохондрий из минимальных количествах мыши скелетных мышц для измерения Высокая пропускная микропланшетов дыхания

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Использование<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Обработки изображений цельнозерновой органов и тканей Количественные гистологии, чтобы определить, био-распределение флуоресцентно меченых молекул

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Выделение клеток интерстициального клапана мыши для изучения кальцификации аортального клапана in vitro

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) ...