Name: the use of the patch-clamp technique to study the thermogenic capacity of mitochondria
Uploaded: 2021-05-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria at JoVE.com

Jag tackar Dr. Yuriy Kirichok för den stora vetenskapen jag var en del av i hans labb och medlemmarna i Kirichok-labbet för de hjälpsamma diskussionerna. Jag tackar också Dr Douglas C. Wallace för att ha tillhandahållit AAC1 knockout-möss. Finansiering: A.M.B stöddes av ett American Heart Association Career Development Award 19CDA34630062.

Alla djurförsök som utfördes överensstämmer med Riktlinjerna för National Institutes of Health och godkändes av University of California Los Angeles Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
OBS: Mitokondriell isoleringsproceduren är baserad på differentiell centrifugering och varierar något från vävnad till vävnad. Till exempel, eftersom brun fettvävnad är extremt rik på lipider, kräver det ett ytterligare steg för att separera cellskräp och organeller från lipi...

<ol>
	<li>Divakaruni, A. S., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+and+physiology+of+mitochondrial+proton+leak.">The regulation and physiology of mitochondrial proton leak.</a> Physiology (Bethesda). 26 (3), 192-205 (2011).</li><li>Chouchani, E. T., Kazak, L., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+advances+in+adaptive+thermogenesis:+UCP1+and+beyond.">New advances in adaptive thermogenesis: UCP1 and beyond.</a> Cell Metabolism. 29 (1), 27-37 (2019).</li><li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue:+function+and+physiological+significance.">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).</li><li>Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hunt+for+the+molecular+mechanism+of+brown+fat+thermogenesis.">The hunt for the molecular mechanism of brown fat thermogenesis.</a> Biochimie. 134, 9-18 (2017).</li><li>Bertholet, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H(+)+transport+is+an+integral+function+of+the+mitochondrial+ADP/ATP+carrier.">H(+) transport is an integral function of the mitochondrial ADP/ATP carrier.</a> Nature. 571 (7766), 515-520 (2019).</li><li>Fedorenko, A., Lishko, P. V., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+fatty-acid-dependent+UCP1+uncoupling+in+brown+fat+mitochondria.">Mechanism of fatty-acid-dependent UCP1 uncoupling in brown fat mitochondria.</a> Cell. 151 (2), 400-413 (2012).</li><li>Bertholet, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+patch+clamp+of+beige+adipocytes+reveals+UCP1-positive+and+UCP1-negative+cells+both+exhibiting+futile+creatine+cycling.">Mitochondrial patch clamp of beige adipocytes reveals UCP1-positive and UCP1-negative cells both exhibiting futile creatine cycling.</a> Cell Metabolism. 25 (4), 811-822 (2017).</li><li>Kirichok, Y., Krapivinsky, G., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+calcium+uniporter+is+a+highly+selective+ion+channel.">The mitochondrial calcium uniporter is a highly selective ion channel.</a> Nature. 427 (6972), 360-364 (2004).</li><li>Fieni, F., Lee, S. B., Jan, Y. N., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter+varies+greatly+between+tissues.">Activity of the mitochondrial calcium uniporter varies greatly between tissues.</a> Nature Communications. 3, 1317 (2012).</li><li>Chaudhuri, D., Sancak, Y., Mootha, V. K., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCU+encodes+the+pore+conducting+mitochondrial+calcium+currents.">MCU encodes the pore conducting mitochondrial calcium currents.</a> eLife. 2, 00704 (2013).</li><li>Vais, H., Payne, R., Paudel, U., Li, C., Foskett, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+transmembrane+mechanisms+control+MCU-mediated+mitochondrial+Ca(2+)+uptake.">Coupled transmembrane mechanisms control MCU-mediated mitochondrial Ca(2+) uptake.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21731-21739 (2020).</li><li>Vais, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMRE+is+a+matrix+Ca(2+)+sensor+that+governs+gatekeeping+of+the+mitochondrial+Ca(2+)+uniporter.">EMRE is a matrix Ca(2+) sensor that governs gatekeeping of the mitochondrial Ca(2+) uniporter.</a> Cell Reports. 14 (3), 403-410 (2016).</li><li>Vais, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCUR1,+CCDC90A,+is+a+regulator+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">MCUR1, CCDC90A, is a regulator of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Cell Metabolism. 22 (4), 533-535 (2015).</li><li>Kamer, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MICU1+imparts+the+mitochondrial+uniporter+with+the+ability+to+discriminate+between+Ca(2+)+and+Mn(2+).">MICU1 imparts the mitochondrial uniporter with the ability to discriminate between Ca(2+) and Mn(2+).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 7960-7969 (2018).</li><li>Bertholet, A. M., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+analysis+of+the+mitochondrial+H(+)+leak+in+brown+and+beige+fat.">Patch-clamp analysis of the mitochondrial H(+) leak in brown and beige fat.</a> Frontiers in Physiology. 11, 326 (2020).</li><li>Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization,+identification,+and+excision+of+murine+adipose+depots.">Localization, identification, and excision of murine adipose depots.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52174 (2014).</li><li>Garg, V., Kirichok, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+analysis+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">Patch-clamp analysis of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Methods in Molecular Biology. 1925, 75-86 (2019).</li><li>Decker, G. L., Greenawalt, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+and+biochemical+studies+of+mitoplasts+and+outer+membranes+derived+from+French-pressed+mitochondria.+Advances+in+mitochondrial+subfractionation.">Ultrastructural and biochemical studies of mitoplasts and outer membranes derived from French-pressed mitochondria. Advances in mitochondrial subfractionation.</a> Journal of Ultrastructure Research. 59 (1), 44-56 (1977).</li><li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+electrical+currents+across+the+plasma+membrane+of+mammalian+sperm+cells.">Recording electrical currents across the plasma membrane of mammalian sperm cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), (2021).</li><li>Flaming, D. G., Brown, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropipette+puller+design:+form+of+the+heating+filament+and+effects+of+filament+width+on+tip+length+and+diameter.">Micropipette puller design: form of the heating filament and effects of filament width on tip length and diameter.</a> Journal of Neuroscience Methods. 6 (1-2), 91-102 (1982).</li><li>Klingenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ADP+and+ATP+transport+in+mitochondria+and+its+carrier.">The ADP and ATP transport in mitochondria and its carrier.</a> Biochimica and Biophysica Acta. 1778 (10), 1978-2021 (2008).</li></ol>

Denna metodartikel syftar till att presentera patch-clamp-tekniken som nyligen applicerats på mitokondrier, ett nytt tillvägagångssätt för att direkt studera H + -läckage genom IMM som är ansvarig för mitokondriell termogenes 5,6,7,15. Denna teknik är inte begränsad till vävnader och kan också användas för att analysera H + -läckage och andra konduktanser av...

Mitokondrier är kända för att vara cellens kraftverk. De är faktiskt den största källan till kemisk energi, ATP. Vad som är mindre känt är att mitokondrier också genererar värme. Faktum är att varje mitokondrion ständigt genererar de två typerna av energier (ATP och värme) och en fin balans mellan de två energiformerna definierar metabolisk cellhomeostas (Figur 1). Hur mitokondrier fördelar energi mellan ATP och värme är verkligen den mest grundläggande frågan inom bioenergetik, även om det fortfarande är till stor del okänt. Vi vet att ökad mitokondriell värmeproduktion (kallad mitokondriell termogenes) och därmed minska ATP-produktionen ökar energiförbrukningen och detta är ett av de bästa sätten att bekämpa metaboliskt syndrom1.
Mitokondriell termogenes härstammar från H + -läckage över det inre mitokondriella membranet (IMM), vilket leder till frikoppling av substratoxidation och ATP-syntes med därmed produktion av värme, därav namnet "mitokondriell frikoppling"1 (Figur 1). Denna H + -läcka beror på mitokondriella transportörer som kallas frikopplingsproteiner (UCP). UCP1 var det första UCP som identifierades. Det uttrycks endast i termogena vävnader, brunt fett och beige fett där mitokondrier är specialiserade för värmeproduktion 2,3,4. Identiteten av UCP i icke-fettvävnader såsom skelettmuskulatur, hjärta och lever har förblivit kontroversiell. Mitokondrier i dessa vävnader kan ha cirka 25% av den totala mitokondriella energin omvandlad till värme, vilket kan påverka hela kroppens fysiologi avsevärt1. Förutom att upprätthålla kärnkroppstemperaturen förhindrar mitokondriell termogenes också dietinducerad fetma genom att minska kalorierna. Dessutom minskar det produktionen av reaktiva syrearter (ROS) av mitokondrier för att skydda celler från oxidativ skada1. Således är mitokondriell termogenes involverad i normalt åldrande, åldersrelaterade degenerativa störningar och andra tillstånd som involverar oxidativ stress, såsom ischemi-reperfusion. Därför är mitokondriell termogenes en kraftfull regulator för cellulär metabolism, och en mekanistisk förståelse av denna grundläggande process kommer att främja utvecklingen av terapeutiska strategier för att bekämpa många patologier associerade med mitokondriell dysfunktion.
Mitokondriell andning var den första tekniken som avslöjade mitokondriell termogenes avgörande roll i cellulär metabolism och är fortfarande den mest populära i samhället1. Denna teknik är baserad på mätning av syreförbrukning av mitokondriell elektrontransportkedja (ETC) som ökar när mitokondriell H + -läcka aktiveras. Denna teknik, även om den är instrumentell, kan inte direkt studera mitokondriell H + -läcka över IMM1, vilket gör den exakta identifieringen och karakteriseringen av proteinerna som är ansvariga för det svårt, särskilt i icke-fettvävnader där värmeproduktionen är sekundär jämfört med ATP-produktion. Nyligen gav utvecklingen av patch-clamp-tekniken som tillämpas på mitokondrier den första direkta studien av H + -läckage över hela IMM i olika vävnader 5,6,7.
Mitokondriell patch-klämma för hela IMM etablerades först på ett reproducerbart sätt av Kirichok et al.8. De beskrev den första direkta mätningen av mitokondriella kalcium uniporterströmmar (MCU) 2004 med hjälp av mioplaster från COS-7 cellinjer8. Senare visade Kirichok-labbet kalciumströmmar från IMMs av mus9 och Drosophila-vävnader 9. Andra laboratorier använder nu rutinmässigt denna teknik för att studera de biofysiska egenskaperna hos MCU 10,11,12,13,14. Hela IMM-patch-clamp-analys av kalium- och kloridkonduktans är också möjlig och har nämnts i flera artiklar men har ännu inte varit huvudämnet för en publikation 6,7,9. Den första mätningen av H+ strömmar över IMM rapporterades 2012 från musbruna fett mitokondrier6 och från musbeige fett mitokondrier 20177. Denna ström beror på det specifika frikopplingsproteinet i termogena vävnader, UCP1 6,7. Nyligen publicerat arbete 2019 karakteriserade AKK som det huvudsakliga proteinet som är ansvarigt för mitokondriell H + -läcka i icke-fettvävnader som hjärtat och skelettmuskeln5.
Detta unika tillvägagångssätt möjliggör nu en direkt högupplöst funktionell analys av mitokondriella jonkanaler och transportörer som är ansvariga för mitokondriell termogenes. För att underlätta expansionen av metoden och för att komplettera andra studier såsom mitokondriell andning beskrivs ett detaljerat protokoll nedan för att mäta H + - strömmarna som bärs av UCP1 och AAC. Tre viktiga steg beskrivs: 1) mitokondriell isolering från musbrunt fett för att analysera UCP1-beroende H + -ström och mitokondriell isolering från hjärtat för att analysera AAC-beroende H + -ström, 2) beredning av mioplaster med en fransk press för mekanisk bristning av det yttre mitokondriella membranet (OMM), 3) patch-clamp-inspelningar av UCP1- och AAC-beroende H + -strömmar över hela IMM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% gelatin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60X water immersion objective, numerical aperture 1.20</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO60XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF150-86-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1550B Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Press</td>
			<td>Glen Mills</td>
			<td>5500-000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inversed Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71 or IX73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Forge</td>
			<td>(Narishige)</td>
			<td>MF-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanupulator MPC-385</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>FG-MPC325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode holder for agar bridge</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH3F4515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>(Sutter Instruments)</td>
			<td>P97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Cell for French Press</td>
			<td>Glen Mills</td>
			<td>5500-FA-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIXER IKA 6-2000RPM</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-50705-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 100X magnification</td>
			<td>Nikon&#160; lens</td>
			<td>MPlan 100/0.80 ELWD 210/0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pClamp 10</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-24E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>358039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75 009 521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table</td>
			<td>Newport</td>
			<td>VIS3036-SG2-325A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-gluconic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>M4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>3777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>60128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>63068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>331635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisBase</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisCl</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of the patch-clamp technique to study the thermogenic capacity of mitochondria

Mitokondriell termogenes (även känd som mitokondriell frikoppling) är ett av de mest lovande målen för att öka energiförbrukningen för att bekämpa metaboliskt syndrom. Termogena vävnader som bruna och beige fetter utvecklar högspecialiserade mitokondrier för värmeproduktion. Mitokondrier i andra vävnader, som främst producerar ATP, omvandlar också upp till 25% av den totala mitokondriella energiproduktionen till värme och kan därför ha en betydande inverkan på hela kroppens fysiologi. Mitokondriell termogenes är inte bara viktigt för att upprätthålla kroppstemperaturen utan förhindrar också dietinducerad fetma och minskar produktionen av reaktiva syrearter (ROS) för att skydda celler från oxidativ skada. Eftersom mitokondriell termogenes är en viktig regulator för cellulär metabolism, kommer en mekanistisk förståelse av denna grundläggande process att hjälpa till vid utvecklingen av terapeutiska strategier för att bekämpa många patologier associerade med mitokondriell dysfunktion. Viktigt är att de exakta molekylära mekanismerna som styr akut aktivering av termogenes i mitokondrier är dåligt definierade. Denna brist på information beror till stor del på brist på metoder för direkt mätning av frikopplande proteiner. Den senaste utvecklingen av patch-clamp-metodik tillämpad på mitokondrier möjliggjorde för första gången den direkta studien av fenomenet vid ursprunget till mitokondriell termogenes, H + -läckage genom IMM och den första biofysiska karakteriseringen av mitokondriella transportörer som är ansvariga för det, det frikopplande proteinet 1 (UCP1), specifikt för bruna och beige fetter, och ADP / ATP-transportören (AAC) för alla andra vävnader. Detta unika tillvägagångssätt kommer att ge nya insikter om de mekanismer som styr H + -läckage och mitokondriell termogenes och hur de kan riktas för att bekämpa metaboliskt syndrom. Detta dokument beskriver patch-clamp-metoden som tillämpas på mitokondrier för att studera deras termogena kapacitet genom att direkt mäta H + - strömmar genom IMM.

Utvecklingen av patch-clamp-metoden som tillämpas på mitokondrier gav den första direkta studien av H + -läckage genom IMM och mitokondriella transportörer, UCP1 och AAC, som är ansvariga för det. Den elektrofysiologiska analysen av UCP1- och AAC-beroende H + -läckor kan ge en första blick på mitokondriernas termogena kapacitet. I resultatavsnittet beskrivs standardprocedurerna för att mäta H+- läckage via UCP1 och AAC.
UCP1-beroende H...

Watch this Scientific Journal Video about The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria at JoVE.com

The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria

Denna metodartikel beskriver de viktigaste stegen för att mäta H + -läckage över det inre mitokondriella membranet med patch-clamp-tekniken, ett nytt tillvägagångssätt för att studera mitokondriernas termogena kapacitet.

Användningen av Patch-Clamp-tekniken för att studera mitokondriernas termogena kapacitet

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat ...

Detta protokoll beskriver hur patch clamp-tekniken kan användas för att studera mitokondriernas termogena kapacitet genom att direkt mäta mitokondriell protonläckage över det inre mitokondriella membranet. Den direkta mätningen av protonströmmen genom det inre mitokondriella membranet hjälper till att identifiera och exakt karakterisera de molekylära mekanismerna som är ansvariga för mitokondriell termogenes. Denna teknik gör det inte bara möjligt att mäta protonströmmen över det inre mitokondriella membranet utan också att studera andra konduktanser som är viktiga för mitokondriell funktion, såsom kalcium eller metaboliter som adeninnukleotider.Placera den avlivade musen på ryggen och spraya alkohol för att rengöra och blöta håret. Gör sedan ett två centimeter snitt på bröstkorgen. Efter att ha tagit tag i huden med pincett, dissekera hjärtat från djurets bröstkorg och skölj det för att ta bort allt blod i en 10-milliliter bägare med fem milliliter kall isoleringslösning.När hjärtat har rensats från spår av blod, överför det till en annan 10-milliliter bägare som innehåller fem milliliter kall isoleringsbuffert och hugga upp den i tunna bitar. Överför den sedan till en iskyld 10-milliliter glashomogenisator. Använd en omrörare för att homogenisera den förskurna vävnaden på is med sex mjuka slag med en kontrollerad hastighet på 275 rotationer per minut.Överför homogenatet till ett 15-milliliter iskallt koniskt rör och centrifugera det vid 700 gånger G i 10 minuter vid fyra grader Celsius för att pelletera kärnorna och obrutna celler. Samla supernatanten i ett nytt 15-milliliter rör och lägg det på is. Centrifugera supernatanten vid 8 500 gånger G i 10 minuter vid fyra grader Celsius för att erhålla en pellet innehållande mitokondrierna.Resuspendera mitokondriell pellet i 3,8 ml iskall hypertonisk mannitolbuffert och inkubera mitokondrie suspensionen på is i 10 till 15 minuter. Fyll den mitokondriella hypertoniska mannitolsuspensionen i en kyld minitryckscell i den franska pressen. Placera sedan cellen på den franska pressen.Välj sedan det låga läget för den franska pressen och komprimera suspensionen genom minitryckscellen vid 110 på ratten för de bruna fettmitokondrierna och vid 140 för hjärtmitokondrierna, vilket säkerställer att suspensionen kommer ut ur minitryckscellen med en hastighet av ungefär en droppe per sekund. Samla dropparna i ett 15 ml iskylt koniskt rör. Centrifugera suspensionen vid 10 500 gånger G i 10 minuter vid fyra grader Celsius.Resuspendera mitoplasterna pellet i 0,5 till 2 ml iskall hypertonisk kaliumkloridbuffert och förvara suspensionen på is. Dra borosilikatglasfilamenten på inspelningsdagen med hjälp av en mikropipettdragare och ställ in ett program på avdragaren som används för att generera pipetter med hög grad av reproducerbarhet. Sätt i en glasfilament i avdragaren och dra för att få nästan två identiska lapppipetter från en borosilikatfilament.Justera programmet när pipetter blir inkonsekventa mellan dragcykler på grund av åldrandet av avdragarens värmeboxfilament. Placera pipetten inuti pipettpoleraren och placera spetsen nära glödtråden under 100X förstoring för att eldpolera den. Tryck på fotpedalen flera gånger för att värma glödtråden utan att täppa till eller skada spetskurvan.Polera tills pipetterna har ett motstånd mellan 25 och 35 megaohms erhålls när de fylls med TMA-baserad pipettlösning. Förinkubatskydd glider med 0,1% gelatin för att minska mitoplasthäftningen och skölj dem med kaliumkloridbadlösningen innan mitoplastsuspensionen deponeras. Bered en rå utspädning genom att blanda cirka 35 mikroliter av den koncentrerade mitoplastsuspensionen med 500 mikroliter av kaliumkloridbadlösningen och placera den på täckslipsarna som tidigare placerats i en brunn på en platta med fyra brunnar.Inkubera på is i 15 till 20 minuter för mitoplaster att sedimentera ner täckglidningen. Fyll badkammaren helt med cirka 50 mikroliter av kaliumkloridbadlösningen och överför en täckglidning med mitoplaster i kammaren med tunn mikrodissektionspincett med en böjd spets. Ordna täckglidningen längst ner i kammaren utan att genomfusera kammaren för att hålla mitoplasterna stabila på täckglidningen.Välj en individuell icke-självhäftande mitoplast genom att skanna täckglidningen under mikroskopet med ett 60X-mål. Ladda pipetten med pipettlösningen och placera den i pipetthållaren. Ta pipetten i badlösningen med en mikromanipulator och flytta den strax ovanför den valda mitoplasten för att komma nära IMM.Håll membranpotentialen vid noll millivolt och applicera 10 millivoltpulser med membrantestkommandot i förstärkarprogrammet. Applicera ett litet undertryck för att snabbt skapa en gigaseal med IMM. Höj pipetten med mitoplasten fäst för att hålla dem borta från täckglidningen för att undvika tätningsbrott på grund av pipettdrift under experimentet.Kompensera de herrelösa kapacitanstransienstransienterna med membrantestkommandot i förstärkarprogrammet innan du testar hela mitoplastkonfigurationen för att få en korrekt kapacitansmätning för mitoplastmembranet efter inbrottet. Applicera kortvariga spänningspulser med förstärkarprogrammet för att bryta membranplåstret under glaspipetten och uppnå hela mitoplastkonfigurationen. Efter inbrottet, montera kapacitanstransienstransienserna med förstärkarprogrammets membrantestalternativ för att bedöma membrankapacitansen och dess åtkomstmotstånd.Omedelbart efter inbrottet, byt ut kaliumkloridbadlösningen mot en HEPES-badlösning via perfusion. Applicera ett rampprotokoll på 850 millisekunder med förstärkarprogrammet. Tillämpning av spänningsrampprotokollet inducerar en protonström med stor amplitud över IMM av brunt fett utan tillsats av exogena fettsyror, de nödvändiga aktivatorerna för UCP.Efter perfusion av antingen UCP1-hämmare guanosindifosfat eller 10-millimolär metyl beta-cyklodextrin för extraktion av endogen membranfettsyra används restströmmen för att bestämma amplituden för UCP1-strömmarna, som försvinner helt i IMM hos UCP1-bristfälliga möss. Till skillnad från brunt fett utvecklar IMM av icke-fettvävnader, såsom skelettmuskulatur och hjärta, inte en mätbar protonström omedelbart efter inbrottet. För att inducera en mätbar protonström genom AAC är det viktigt att applicera HEPES-badlösningen som innehåller en till två mikromolar av exogena fettsyror.För att bekräfta att den uppmätta protonströmmen bärs av AAC är det viktigt att applicera specifika hämmare, karboxytractyloside, som nästan helt hämmar protonströmmen som visas i IMM hos AAC1-bristfälliga möss. En konstant men aldrig fullständig hämning av protonläckage uppnås endast när ADP finns på båda sidor av membranet för att generera ett aktivt nukleotidutbyte via AAC. Kvaliteten på mitoplastpreparatet kommer att påverka framgångsgraden för att uppnå konfigurationen för hela mitoplasten.Det är viktigt att optimera det. När den molekylära mekanismen för mitokondriell termogenes dissekeras med patchklämtekniken kommer mätning av mitokondriell syreförbrukning att visa vikten av protonström och termogenes i intakta mitokondrier. Denna teknik öppnar vägen för forskare att utforska alla typer av konduktanser, joner och metaboliter som är viktiga för mitokondriernas funktion.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testa Visual Känsligheten för hastighet och rörelseriktning i Ödlor

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Datorgenererade djurmodell Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

Metoder för Kapacitans Patch Clamp inspelningar från Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Tryck-polering Pipetter för förbättrad patch-clamp-inspelning

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

Flera parametrar Mätning av permeabiliteten Transition poröppning i isolerade mus hjärta mitokondrier

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

En-kanals Cell-ansluten Patch-clamp inspelning

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

Bedöma Sekretorisk Kapacitet på bukspottskörteln acinarceller

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Isolering av mitokondrier från minimala kvantiteter av mus skelettmuskulatur för hög genomströmning Microandnings Mätningar

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Användningen av<em&gt; Ex vivo</em&gt; Hela organ Imaging och Kvantitativ Tissue histologi att bestämma Bio-fördelningen av fluorescerande molekyler

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Isolering av musinterstitiella ventilceller för att studera förkalkningen av aortaventilen in vitro

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) ...