Name: the use of the patch-clamp technique to study the thermogenic capacity of mitochondria
Uploaded: 2021-05-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria at JoVE.com

Dr. Yuriy Kirichok'a laboratuvarında parçası olduğum büyük bilim için ve Kirichok laboratuvarının üyelerine yararlı tartışmalar için teşekkür ederim. Ayrıca AAC1 nakavt fareleri sağladığı için Dr. Douglas C. Wallace'a teşekkür ederim. Finansman: A.M.B, Amerikan Kalp Derneği Kariyer Geliştirme Ödülü 19CDA34630062 tarafından desteklenmiştir.

Gerçekleştirilen tüm hayvan deney prosedürleri Ulusal Sağlık Enstitüleri kılavuzlarına uygundur ve Kaliforniya Üniversitesi Los Angeles Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
NOT: Mitokondriyal izolasyon prosedürü diferansiyel santrifüjlemeye dayanır ve dokudan dokuya biraz değişir. Örneğin, kahverengi yağ dokusu lipitler bakımından son derece zengin olduğundan, mitokondri toplanmadan önce hücre kalıntılarını ve organe...

<ol>
	<li>Divakaruni, A. S., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+and+physiology+of+mitochondrial+proton+leak.">The regulation and physiology of mitochondrial proton leak.</a> Physiology (Bethesda). 26 (3), 192-205 (2011).</li><li>Chouchani, E. T., Kazak, L., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+advances+in+adaptive+thermogenesis:+UCP1+and+beyond.">New advances in adaptive thermogenesis: UCP1 and beyond.</a> Cell Metabolism. 29 (1), 27-37 (2019).</li><li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue:+function+and+physiological+significance.">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).</li><li>Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hunt+for+the+molecular+mechanism+of+brown+fat+thermogenesis.">The hunt for the molecular mechanism of brown fat thermogenesis.</a> Biochimie. 134, 9-18 (2017).</li><li>Bertholet, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H(+)+transport+is+an+integral+function+of+the+mitochondrial+ADP/ATP+carrier.">H(+) transport is an integral function of the mitochondrial ADP/ATP carrier.</a> Nature. 571 (7766), 515-520 (2019).</li><li>Fedorenko, A., Lishko, P. V., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+fatty-acid-dependent+UCP1+uncoupling+in+brown+fat+mitochondria.">Mechanism of fatty-acid-dependent UCP1 uncoupling in brown fat mitochondria.</a> Cell. 151 (2), 400-413 (2012).</li><li>Bertholet, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+patch+clamp+of+beige+adipocytes+reveals+UCP1-positive+and+UCP1-negative+cells+both+exhibiting+futile+creatine+cycling.">Mitochondrial patch clamp of beige adipocytes reveals UCP1-positive and UCP1-negative cells both exhibiting futile creatine cycling.</a> Cell Metabolism. 25 (4), 811-822 (2017).</li><li>Kirichok, Y., Krapivinsky, G., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+calcium+uniporter+is+a+highly+selective+ion+channel.">The mitochondrial calcium uniporter is a highly selective ion channel.</a> Nature. 427 (6972), 360-364 (2004).</li><li>Fieni, F., Lee, S. B., Jan, Y. N., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter+varies+greatly+between+tissues.">Activity of the mitochondrial calcium uniporter varies greatly between tissues.</a> Nature Communications. 3, 1317 (2012).</li><li>Chaudhuri, D., Sancak, Y., Mootha, V. K., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCU+encodes+the+pore+conducting+mitochondrial+calcium+currents.">MCU encodes the pore conducting mitochondrial calcium currents.</a> eLife. 2, 00704 (2013).</li><li>Vais, H., Payne, R., Paudel, U., Li, C., Foskett, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+transmembrane+mechanisms+control+MCU-mediated+mitochondrial+Ca(2+)+uptake.">Coupled transmembrane mechanisms control MCU-mediated mitochondrial Ca(2+) uptake.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21731-21739 (2020).</li><li>Vais, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMRE+is+a+matrix+Ca(2+)+sensor+that+governs+gatekeeping+of+the+mitochondrial+Ca(2+)+uniporter.">EMRE is a matrix Ca(2+) sensor that governs gatekeeping of the mitochondrial Ca(2+) uniporter.</a> Cell Reports. 14 (3), 403-410 (2016).</li><li>Vais, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCUR1,+CCDC90A,+is+a+regulator+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">MCUR1, CCDC90A, is a regulator of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Cell Metabolism. 22 (4), 533-535 (2015).</li><li>Kamer, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MICU1+imparts+the+mitochondrial+uniporter+with+the+ability+to+discriminate+between+Ca(2+)+and+Mn(2+).">MICU1 imparts the mitochondrial uniporter with the ability to discriminate between Ca(2+) and Mn(2+).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 7960-7969 (2018).</li><li>Bertholet, A. M., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+analysis+of+the+mitochondrial+H(+)+leak+in+brown+and+beige+fat.">Patch-clamp analysis of the mitochondrial H(+) leak in brown and beige fat.</a> Frontiers in Physiology. 11, 326 (2020).</li><li>Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization,+identification,+and+excision+of+murine+adipose+depots.">Localization, identification, and excision of murine adipose depots.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52174 (2014).</li><li>Garg, V., Kirichok, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+analysis+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">Patch-clamp analysis of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Methods in Molecular Biology. 1925, 75-86 (2019).</li><li>Decker, G. L., Greenawalt, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+and+biochemical+studies+of+mitoplasts+and+outer+membranes+derived+from+French-pressed+mitochondria.+Advances+in+mitochondrial+subfractionation.">Ultrastructural and biochemical studies of mitoplasts and outer membranes derived from French-pressed mitochondria. Advances in mitochondrial subfractionation.</a> Journal of Ultrastructure Research. 59 (1), 44-56 (1977).</li><li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+electrical+currents+across+the+plasma+membrane+of+mammalian+sperm+cells.">Recording electrical currents across the plasma membrane of mammalian sperm cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), (2021).</li><li>Flaming, D. G., Brown, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropipette+puller+design:+form+of+the+heating+filament+and+effects+of+filament+width+on+tip+length+and+diameter.">Micropipette puller design: form of the heating filament and effects of filament width on tip length and diameter.</a> Journal of Neuroscience Methods. 6 (1-2), 91-102 (1982).</li><li>Klingenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ADP+and+ATP+transport+in+mitochondria+and+its+carrier.">The ADP and ATP transport in mitochondria and its carrier.</a> Biochimica and Biophysica Acta. 1778 (10), 1978-2021 (2008).</li></ol>

Bu yöntem makalesi, mitokondriyal termojenezden sorumlu İBB aracılığıyla H + sızıntısını doğrudan incelemek için yeni bir yaklaşım olan mitokondriye yakın zamanda uygulanan yama-kelepçe tekniğini sunmayı amaçlamaktadır 5,6,7,15. Bu teknik dokularla sınırlı değildir ve HAP1, COS7, C2C12 ve MEF hücreleri gibi farklı standart insan ve hücre modellerinde İBB'...

Mitokondri, hücrenin güç merkezi olmasıyla ünlüdür. Aslında, kimyasal enerjinin ana kaynağı olan ATP'dirler. Daha az bilinen şey, mitokondrinin de ısı ürettiğidir. Aslında, her mitokondri sürekli olarak iki tür enerji (ATP ve ısı) üretir ve iki enerji formu arasındaki ince bir denge metabolik hücre homeostazını tanımlar (Şekil 1). Mitokondrinin ATP ve ısı arasında enerjiyi nasıl dağıttığı, biyoenerjetik alanındaki en temel sorudur, ancak hala büyük ölçüde bilinmemektedir. Mitokondriyal ısı üretimini arttırmanın (mitokondriyal termojenez olarak adlandırılır) ve sonuç olarak ATP üretimini azaltmanın enerji harcamasını artırdığını biliyoruz ve bu, metabolik sendromla mücadele etmenin en iyi yollarından biridir1.
Mitokondriyal termogenez, iç mitokondriyal membran (IMM) boyunca H + sızıntısından kaynaklanır ve substrat oksidasyonunun ve ATP sentezinin ısı üretimi ile ayrılmasına yol açar, bu nedenle "mitokondriyal ayrışma"1 adı verilir (Şekil 1). Bu H + sızıntısı, ayrışma proteinleri (UCP'ler) adı verilen mitokondriyal taşıyıcılara bağlıdır. UCP1, tanımlanan ilk UCP'dir. Sadece termojenik dokularda, kahverengi yağda ve mitokondrinin ısı üretimi için uzmanlaşmış olduğu bej yağda ifade edilir 2,3,4. İskelet kası, kalp ve karaciğer gibi yağ olmayan dokularda UCP'nin kimliği tartışmalı kalmıştır. Bu dokulardaki mitokondri, ısıya dönüştürülen toplam mitokondriyal enerjinin yaklaşık% 25'ine sahip olabilir ve bu da tüm vücudun fizyolojisini önemli ölçüde etkileyebilir1. Çekirdek vücut ısısını korumanın yanı sıra, mitokondriyal termogenez ayrıca kalorileri azaltarak diyete bağlı obeziteyi de önler. Ek olarak, hücreleri oksidatif hasardan korumak için mitokondri ile reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimini azaltır1. Bu nedenle, mitokondriyal termogenez normal yaşlanma, yaşa bağlı dejeneratif bozukluklar ve iskemi-reperfüzyon gibi oksidatif stres içeren diğer durumlarda rol oynar. Bu nedenle, mitokondriyal termogenez, hücresel metabolizmanın güçlü bir düzenleyicisidir ve bu temel sürecin mekanik bir anlayışı, mitokondriyal disfonksiyonla ilişkili birçok patolojiyle mücadele etmek için terapötik stratejilerin geliştirilmesini teşvik edecektir.
Mitokondriyal solunum, mitokondriyal termogenezin hücresel metabolizmadaki önemli rolünü ortaya koyan ilk tekniktir ve hala toplumda en popüler olanıdır1. Bu teknik, mitokondriyal H + sızıntısı aktive edildiğinde artan mitokondriyal elektron taşıma zinciri (ETC) tarafından oksijen tüketiminin ölçülmesine dayanmaktadır. Bu teknik, enstrümantal olmasına rağmen, İBB1'deki mitokondriyal H + sızıntısını doğrudan inceleyemez, böylece özellikle ısı üretiminin ATP üretimine kıyasla ikincil olduğu yağ dışı dokularda, bundan sorumlu proteinlerin kesin olarak tanımlanmasını ve karakterizasyonunu zorlaştırır. Son zamanlarda, mitokondriye uygulanan yama-kelepçe tekniğinin geliştirilmesi, çeşitli dokularda tüm İBB'de H + sızıntısının ilk doğrudan çalışmasını sağlamıştır 5,6,7.
Tüm İBB'nin mitokondriyal yama kelepçesi ilk olarak Kirichok ve ark.8 tarafından tekrarlanabilir bir şekilde kurulmuştur. 2004 yılında mitokondriyal kalsiyum uniporter (MCU) akımlarının ilk doğrudan ölçümünü, COS-7 hücre hatlarından mitoplastlar kullanarak tanımladılar8. Daha sonra, Kirichok laboratuvarı, fare 9 ve Drosophila dokuları9'un IMM'lerinden kalsiyum akımları gösterdi. Diğer laboratuvarlar şimdi MCU10,11,12,13,14'ün biyofiziksel özelliklerini incelemek için bu tekniği rutin olarak kullanmaktadır. Potasyum ve klorür iletkenliğinin tüm İBB yama-kelepçe analizi de mümkündür ve birkaç makalede bahsedilmiştir, ancak henüz bir yayının ana konusu olmamıştır 6,7,9. İBB'deki H + akımlarının ilk ölçümü 2012 yılında fare kahverengi yağ mitokondrisi6'dan ve 2017'de fare bej yağ mitokondrisinden7 bildirilmiştir. Bu akım, termojenik dokuların spesifik ayrışma proteini UCP1 6,7'den kaynaklanmaktadır. 2019'da yayınlanan son çalışmalar, AAC'yi kalp ve iskelet kası gibi yağ dışı dokularda mitokondriyal H + sızıntısından sorumlu ana protein olarak nitelendirdi5.
Bu benzersiz yaklaşım şimdi mitokondriyal iyon kanallarının ve mitokondriyal termojenezden sorumlu taşıyıcıların doğrudan yüksek çözünürlüklü fonksiyonel analizine izin vermektedir. Yöntemin genişlemesini kolaylaştırmak ve mitokondriyal solunum gibi diğer çalışmaları tamamlamak için, UCP1 ve AAC tarafından taşınan H + akımlarını ölçmek için aşağıda ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. Üç önemli adım açıklanmaktadır: 1) AAC'ye bağımlı H + akımını analiz etmek için fare kahverengi yağından mitokondriyal izolasyon ve AAC'ye bağımlı H + akımını analiz etmek için kalpten mitokondriyal izolasyon, 2) dış mitokondriyal membranın (OMM) mekanik rüptürü için bir Fransız Basını ile mitoplastların hazırlanması, 3) UCP1 ve AAC'ye bağımlı H + akımlarının yama-kelepçe kayıtları.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% gelatin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60X water immersion objective, numerical aperture 1.20</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO60XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF150-86-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1550B Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Press</td>
			<td>Glen Mills</td>
			<td>5500-000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inversed Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71 or IX73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Forge</td>
			<td>(Narishige)</td>
			<td>MF-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanupulator MPC-385</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>FG-MPC325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode holder for agar bridge</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH3F4515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>(Sutter Instruments)</td>
			<td>P97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Cell for French Press</td>
			<td>Glen Mills</td>
			<td>5500-FA-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIXER IKA 6-2000RPM</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-50705-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 100X magnification</td>
			<td>Nikon&#160; lens</td>
			<td>MPlan 100/0.80 ELWD 210/0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pClamp 10</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-24E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>358039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75 009 521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table</td>
			<td>Newport</td>
			<td>VIS3036-SG2-325A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-gluconic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>M4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>3777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>60128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>63068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>331635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisBase</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisCl</td>
			<td>&#160;Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of the patch-clamp technique to study the thermogenic capacity of mitochondria

Mitokondriyal termogenez (mitokondriyal ayrılma olarak da bilinir), metabolik sendromla mücadele etmek için enerji harcamasını artırmak için en umut verici hedeflerden biridir. Kahverengi ve bej yağlar gibi termojenik dokular, ısı üretimi için oldukça uzmanlaşmış mitokondri geliştirir. Öncelikle ATP üreten diğer dokuların mitokondrileri, toplam mitokondriyal enerji üretiminin% 25'ini ısıya dönüştürür ve bu nedenle tüm vücudun fizyolojisi üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. Mitokondriyal termojenez sadece vücut ısısını korumak için gerekli değildir, aynı zamanda diyete bağlı obeziteyi önler ve hücreleri oksidatif hasardan korumak için reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimini azaltır. Mitokondriyal termogenez, hücresel metabolizmanın önemli bir düzenleyicisi olduğundan, bu temel sürecin mekanik bir anlayışı, mitokondriyal disfonksiyonla ilişkili birçok patolojiyle mücadele etmek için terapötik stratejilerin geliştirilmesine yardımcı olacaktır. Önemli olarak, mitokondride termojenezin akut aktivasyonunu kontrol eden hassas moleküler mekanizmalar zayıf bir şekilde tanımlanmıştır. Bu bilgi eksikliği, büyük ölçüde, ayrıştırıcı proteinlerin doğrudan ölçümü için yöntemlerin eksikliğinden kaynaklanmaktadır. Mitokondriye uygulanan yama-kelepçe metodolojisinin son zamanlardaki gelişimi, ilk kez, mitokondriyal termogenezin kökenindeki fenomenin doğrudan incelenmesini, İBB'den H + sızıntısını ve bundan sorumlu mitokondriyal taşıyıcıların ilk biyofiziksel karakterizasyonunu, kahverengi ve bej yağlara özgü ayrışma proteini 1'i (UCP1) ve diğer tüm dokular için ADP / ATP taşıyıcısını (AAC) mümkün kılmıştır. Bu benzersiz yaklaşım, H + sızıntısını ve mitokondriyal termojenezi kontrol eden mekanizmalara ve metabolik sendromla mücadele için nasıl hedeflenebileceklerine dair yeni bilgiler sağlayacaktır. Bu makalede, İBB aracılığıyla H + akımlarını doğrudan ölçerek termojenik kapasitelerini incelemek için mitokondrilere uygulanan yama kelepçesi metodolojisi açıklanmaktadır.

Mitokondriye uygulanan yama kelepçesi metodolojisinin geliştirilmesi, İBB ve bundan sorumlu olan mitokondriyal taşıyıcılar, UCP1 ve AAC yoluyla H + sızıntısının ilk doğrudan çalışmasını sağlamıştır. UCP1 ve AAC'ye bağımlı H + sızıntılarının elektrofizyolojik analizi, mitokondrinin termojenik kapasitesine ilk bakışı sağlayabilir. Sonuçlar bölümünde, UCP1 ve AAC aracılığıyla H + sızıntısını ölçmek için standart prosedürler açıklanmaktadı...

Watch this Scientific Journal Video about The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria at JoVE.com

The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria

Bu yöntem makalesi, mitokondrinin termojenik kapasitesini incelemek için yeni bir yaklaşım olan yama-kelepçe tekniği ile iç mitokondriyal membran boyunca H + sızıntısını ölçmedeki ana adımları detaylandırmaktadır.

Mitokondrinin Termojenik Kapasitesini İncelemek için Yama-Kelepçe Tekniğinin Kullanımı

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat ...

Bu protokol, yama kelepçesi tekniğinin, iç mitokondriyal membran boyunca mitokondriyal proton sızıntısını doğrudan ölçerek mitokondrinin termojenik kapasitesini incelemek için nasıl kullanılabileceğini açıklamaktadır. Proton akımının iç mitokondriyal membrandan doğrudan ölçülmesi, mitokondriyal termogenezden sorumlu moleküler mekanizmaların tanımlanmasına ve hassas bir şekilde karakterize edilmesine yardımcı olur. Bu teknik sadece iç mitokondriyal membran boyunca proton akımını ölçmekle kalmaz, aynı zamanda kalsiyum veya adenin nükleotidleri gibi metabolitler gibi mitokondriyal fonksiyon için önemli olan diğer iletkenlikleri de incelemeye izin verir.Ötenazi fareyi sırtına yerleştirin ve saçları temizlemek ve ıslatmak için alkol püskürtün. Ardından, toraks üzerinde iki santimetrelik bir kesi yapın. Cildi cımbızla kavradıktan sonra, kalbi hayvanın göğsünden disseke edin ve tüm kanı beş mililitre soğuk izolasyon çözeltisi ile 10 mililitrelik bir beherde çıkarmak için durulayın.Kalp kan izlerinden temizlendikten sonra, beş mililitre soğuk izolasyon tamponu içeren başka bir 10 mililitrelik beher'e aktarın ve ince parçalar halinde doğrayın. Ardından, buzla soğutulmuş 10 mililitrelik bir cam homojenizatöre aktarın. Buz üzerindeki önceden kesilmiş dokuyu dakikada 275 rotasyonluk kontrollü bir hızda altı yumuşak vuruşla homojenize etmek için bir baş üstü karıştırıcı kullanın.Homojenatı 15 mililitrelik buz gibi soğuk konik bir tüpe aktarın ve çekirdekleri ve kırılmamış hücreleri peletlemek için dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 700 kez G'de santrifüj yapın. Süpernatantı 15 mililitrelik taze bir tüpte toplayın ve buzun üzerine yerleştirin. Mitokondri içeren bir pelet elde etmek için süpernatantı 8.500 kez G'de dört santigrat derecede 10 dakika boyunca santrifüj yapın.Mitokondriyal peleti 3.8 mililitre buz gibi soğuk hipertonik mannitol tamponunda yeniden askıya alın ve mitokondriyal süspansiyonu buz üzerinde 10 ila 15 dakika inkübe edin. Mitokondriyal hipertonik mannitol süspansiyonunu Fransız basınının soğutulmuş bir mini basınç hücresine doldurun. Ardından, hücreyi Fransız basınına yerleştirin.Ardından, Fransız basınının düşük modunu seçin ve süspansiyonu kahverengi yağ mitokondrisi için kadran üzerinde 110'da ve kalp mitokondrisi için 140'ta mini basınç hücresinden sıkıştırarak süspansiyonun mini basınç hücresinden saniyede yaklaşık bir damla oranında çıkmasını sağlayın. Damlaları 15 mililitrelik buzla soğutulmuş konik bir tüpte toplayın. Süspansiyonu dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 10, 500 kez G'de santrifüj yapın.Mitoplast peletini 0,5 ila 2 mililitre buz gibi soğuk hipertonik potasyum klorür tamponunda yeniden askıya alın ve süspansiyonu buz üzerinde saklayın. Borosilikat cam filamentleri kayıt gününde bir mikropipet çektirici kullanarak çekin ve yüksek derecede tekrarlanabilirliğe sahip pipetler üretmek için kullanılan çektirme makinesine bir program ayarlayın. Çektirme makinesinin içine bir cam filaman yerleştirin ve bir borosilikat filamentten neredeyse iki özdeş yama pipeti elde etmek için çekin.Pipetler, çektirmenin ısıtma kutusu filamentinin eskimesi nedeniyle çekme döngüleri arasında tutarsız hale geldiğinde programı ayarlayın. Pipetleri pipet parlatıcısının içine yerleştirin ve yakmak için ucu filamentin yakınına 100X büyütme altında yerleştirin. Filamenti tıkanmadan veya uç eğrisine zarar vermeden ısıtmak için ayak pedalına birkaç kez basın.Pipetler 25 ila 35 megaohm arasında bir dirence sahip olana kadar cilalanarak TMA bazlı pipet çözeltisi ile doldurulduğunda elde edilir. Mitoplast yapışmasını azaltmak için% 0.1 jelatin ile ön inkübasyon kapağı kaymaları ve mitoplast süspansiyonunu biriktirmeden önce potasyum klorür banyo çözeltisi ile durulayın. Yaklaşık 35 mikrolitre konsantre mitoplast süspansiyonu 500 mikrolitre potasyum klorür banyosu çözeltisi ile karıştırarak ham bir seyreltme hazırlayın ve daha önce dört delikli bir plakanın kuyucuğuna yerleştirilmiş kapak fişlerine yerleştirin.Mitoplastların örtü kaymasından aşağı doğru tortu oluşturması için 15 ila 20 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Banyo odasını yaklaşık 50 mikrolitre potasyum klorür banyosu çözeltisi ile tamamen doldurun ve bükülmüş uçlu ince mikrodiseksiyon cımbızları kullanarak oda içinde mitoplastlı bir kapak kayması aktarın. Mitoplastları kapak kayması üzerinde sabit tutmak için odayı delmeden kapak kaymasını odanın dibinde düzenleyin.Kapak kaymasını mikroskop altında 60X hedefle tarayarak yapışkan olmayan bireysel bir mitoplast seçin. Pipete pipet çözeltisini yükleyin ve pipet tutucuya yerleştirin. Pipetleri bir mikromanipülatör ile banyo çözeltisine getirin ve İBB'ye yaklaşmak için seçilen mitoplastın hemen üzerine taşıyın.Membran potansiyelini sıfır milivoltta tutun ve amplifikatör programındaki membran test komutunu kullanarak 10 milivolt darbeler uygulayın. İBB ile hızlı bir şekilde gigaseal oluşturmak için hafif bir negatif basınç uygulayın. Deney sırasında pipet sürüklenmesi nedeniyle conta kırılmasını önlemek amacıyla pipeti kapak kaymasından uzak tutmak için mitoplast takılı olarak pipeti kaldırın.Kopma sonrası mitoplast membran için doğru bir kapasitans ölçümü elde etmek için tüm mitoplast konfigürasyonunu test etmeden önce amplifikatör programındaki membran test komutu ile başıboş kapasitans geçicilerini telafi edin. Cam pipetin altındaki membran yamasını yırtmak ve tüm mitoplast konfigürasyonunu elde etmek için amplifikatör programı ile kısa süreli voltaj darbeleri uygulayın. Kırılmadan sonra, membran kapasitansını ve erişim direncini değerlendirmek için kapasitans geçicilerini amplifikatör programının membran test seçeneğiyle eşleştirin.Kırılmadan hemen sonra, potasyum klorür banyosu çözeltisini perfüzyon yoluyla bir HEPES banyo çözeltisi ile değiştirin. Amplifikatör programı ile 850 milisaniyelik bir rampa protokolü uygulayın. Voltaj rampası protokolünün uygulanması, UCP'lerin gerekli aktivatörleri olan eksojen yağ asitlerinin eklenmesi olmadan, kahverengi yağın IMM'si boyunca büyük genlikli bir proton akımı indükler.Endojen membran yağ asidi ekstraksiyonu için UCP1 inhibitörü guanozin difosfat veya 10 milimolar metil beta siklodekstrin tarafından perfüzyondan sonra, artık akım, UCP1 eksikliği olan farelerin IMM'sinde tamamen kaybolan UCP1 akımlarının genliğini belirlemek için kullanılır. Kahverengi yağın aksine, iskelet kası ve kalp gibi yağ olmayan dokuların IMM'si, kırılmadan hemen sonra ölçülebilir bir proton akımı geliştirmez. AAC yoluyla ölçülebilir bir proton akımını indüklemek için, bir ila iki mikromolar eksojen yağ asidi içeren HEPES banyo çözeltisinin uygulanması esastır.Ölçülen proton akımının AAC tarafından taşındığını doğrulamak için, AAC1 eksikliği olan farelerin IMM'sinde gösterilen proton akımını neredeyse tamamen inhibe eden spesifik inhibitörler, karboksiyatrilosit uygulamak önemlidir. Proton sızıntısının sabit ama asla tam bir inhibisyonu ancak AAC yoluyla aktif bir nükleotid değişimi oluşturmak için membranın her iki tarafında ADP mevcut olduğunda elde edilir. Mitoplast preparatının kalitesi, tüm mitoplast konfigürasyonuna ulaşmadaki başarı oranını etkileyecektir.Bunu optimize etmek çok önemlidir. Mitokondriyal termogenezin moleküler mekanizması yama kelepçesi tekniği ile diseke edildikten sonra, mitokondriyal oksijen tüketiminin ölçülmesi, bozulmamış mitokondride proton akımının ve termojenezin önemini gösterecektir. Bu teknik, araştırmacıların mitokondrinin işleyişi için önemli olan her türlü iletkenliği, iyonu ve metaboliti keşfetmelerinin yolunu açar.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Kertenkeleler Hareket Hız ve Yön Visual Hassasiyet Test

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Bilgisayar oluşturuldu Hayvan Modeli Uyaranlar

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

Kaliks Patch Kelepçe Kapasitans Kayıtlar Yöntemleri

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Geliştirilmiş Patch-kelepçe kayıt için Basınç-parlatma Pipetler

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

Mitokondri İzole Fare Heart Geçirgenliği Geçiş Gözenek Açma Multi-parametre ölçümü

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Tek kanallı bir hücre-bağlı Patch-clamp kayıt

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

, Pankreatik acinar hücreleri ve salgı kapasitesinin değerlendirilmesi

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Yüksek Verimli Mikroplate Solunum Ölçümler için Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen Mitokondri İzolasyonu

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Kullanımı<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Tüm organ Görüntüleme ve Kantitatif Doku Histoloji floresan etiketli Moleküllerin Biyo-dağılımını belirlemek için

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Aort Kapak In Vitro Kalsifikasyonu Çalışmak için Fare Interstisyel Kapak Hücrelerinin İzolasyonu

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) ...