Name: dissection of single skeletal muscle fibers for immunofluorescent and morphometric analyses of whole-mount neuromuscular junctions
Uploaded: 2021-08-14T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions at JoVE.com

Un grand merci à la SIC et au PEDECIBA pour le soutien financier apporté à ces travaux; à Natalia Rosano pour ses corrections manuscrites; à Marcelo Casacuberta qui réalise la vidéo et à Nicolás Bolatto pour avoir prêté sa voix pour elle.

Toutes les procédures animales ont été effectuées conformément aux directives de la loi nationale n ° 18611 pour le soin des animaux utilisés à des fins expérimentales. Le protocole a été approuvé par le Comité institutionnel d’éthique (CEUA IIBCE, protocole n° 004/09/2015).
1. Dissection musculaire (Jour 1)
NOTA : Avant de commencer, faire 40 mL de paraformaldéhyde (PFA) à 0,5 %, pH 7,4 dans la solution saline phosphate (DPBS) de Dulbecco. En optio...

En cet article, nous présentons un protocole détaillé pour la dissection de deux muscles squelettiques de rat (un lent-contraction et l’autre rapide-contraction), l’isolement de muscle de fibre et la détection d’immunofluorescence des marqueurs pre et postsynaptic pour évaluer quantitativement des changements de NMJ aussi bien que des processus d’assemblage/démontage. Ce type de protocole peut être utile dans les modèlesrongeurs 41,42 pour évalue...

La jonction neuromusculaire du mammifère (NMJ) est une grande synapse cholinergique tripartite composée de la terminaison nerveuse du motoneurone, de la membrane postsynaptique sur la fibre musculaire squelettique et des cellules terminales de Schwann1,2,3. Cette synapse présente une plasticité morphologique etfonctionnelle élevée4,5,6,7,8,même à l’âge adulte lorsque les NMJ peuvent subir des modifications structurelles dynamiques. Par exemple, certains chercheurs ont montré que les terminaisons nerveuses motrices changent continuellement de forme à l’échelle micrométrique9. Il a également été rapporté que la morphologie du NMJ répond aux exigences fonctionnelles, à l’utilisation altérée, au vieillissement, à l’exercice ou aux variations de l’activité locomoteur4,10,11,12,13,14,15. Ainsi, l’entraînement et le manque d’utilisation représentent un stimulus essentiel pour modifier certaines caractéristiques du NMJ, telles que sa taille, sa longueur, la dispersion des vésicules synaptiques et des récepteurs, ainsi que la branche terminale nerveuse14,16,17,18,19,20.
En outre, il a été démontré que tout changement structurel ou dégénérescence de cette jonction vitale pourrait entraîner la mort cellulaire des motoneurones et l’atrophie musculaire21. On le pense également que la communication changée entre les nerfs et les muscles pourrait être responsable des changements physiologiques relatifs à l’âge nmj et probablement de sa destruction dans des états pathologiques. Le démantèlement de la jonction neuromusculaire joue un rôle crucial dans l’apparition de la sclérose latérale amyotrophique (SLA), une maladie neurodégénérative qui constitue l’un des meilleurs exemples d’interaction muscle-nerf altérée3. Malgré les nombreuses études menées sur le dysfonctionnement des motoneurones, on débat encore si la détérioration observée dans la SLA se produit en raison des dommages directs dans le motoneurone puis s’étend aux projections cortico-spinales22; ou si elle doit être considérée comme une axonopathie distale où la dégénérescence commence dans les terminaisons nerveuses et progresse vers les somas des motoneurones23,24. Compte tenu de la complexité de la pathologie de la SLA, il est logique de considérer qu’un mélange de processus indépendants se produit. Comme NMJ est l’acteur central de l’interaction physiopathologique entre le muscle et le nerf, sa déstabilisation représente un point pivot dans l’origine de la maladie qui est pertinent à analyser.
Le système neuromusculaire du mammifère est fonctionnellement organisé en unités motrices discrètes, composées d’un motoneurone et des fibres musculaires qui sont exclusivement innervées par sa borne nerveuse. Chaque unité motrice possède des fibres ayant des propriétés structurelles et fonctionnelles similaires ou identiques25. Le recrutement sélectif des motoneurones permet d’optimiser la réponse musculaire aux exigences fonctionnelles. Maintenant, il est clair que les muscles squelettiques des mammifères sont composés de quatre types de fibres différents. Certains muscles sont nommés en fonction des caractéristiques de leur type de fibre le plus abondant. Par exemple, le soleus (un muscle postérieur du membre postérieur impliqué dans le maintien de la posture du corps) porte une majorité d’unités à contraction lente (type 1) et est reconnu comme un muscle lent. Au lieu de cela, extenseur digitorum longus (EDL) est essentiellement composé d’unités avec des propriétés de contraction rapide similaires (fibres de type 2) et est connu comme un muscle rapide spécialisé pour les mouvements phasiques nécessaires à la locomotion. En d’autres termes, bien que les muscles adultes soient plastiques dans la nature en raison des influences hormonales et neurales, sa composition en fibres détermine la capacité d’effectuer différentes activités, comme on le voit dans le soleus qui connaît une activité continue de faible intensité et l’EDL qui présente une contraction unique plus rapide. D’autres caractéristiques qui sont variables parmi les différents types de fibres musculaires sont liées à leur structure (contenu mitochondrial, extension du réticulum sarcoplasmique, épaisseur de la ligne Z), teneur en atpase de myosine, et la composition de la chaîne lourde de myosine26,27,28,29.
Pour les NMJ de rongeurs, il existe des différences significatives entre les muscles28,29. Les analyses morphométriques réalisées dans le soleus et l’EDL chez le rat ont indiqué une corrélation positive entre le secteur synaptique et le diamètre de fibre (c.-à-d., le secteur synaptique dans les fibres lentes de soleus est plus grand que dans les fibres rapides EDL) mais le rapport entre le secteur NMJ et la taille de fibre est semblable dans les deux muscles30,31. En outre, en ce qui concerne les bornes nerveuses, les zones absolues de la plaque d’extrémité dans les fibres de type 1 étaient plus faibles que dans les fibres de type 2, tandis que la normalisation par diamètre de la fibre a fait des zones de bornes nerveuses dans les fibres de type 1 les plus grandes32.
Cependant, très peu d’études se concentrent sur l’analyse morphométrique pour montrer la preuve de changements dans certaines des composantes NMJ33,34. Ainsi, en raison de la pertinence du NMJ dans la fonction de l’organisme, dont la morphologie et la physiologie sont altérées dans diverses pathologies, il est important d’optimiser les protocoles de dissection de différents types de muscles avec une qualité suffisante pour permettre la visualisation de l’ensemble de la structure NMJ. Il est également nécessaire d’évaluer l’apparition de changements pré ou postsynaptiques dans différentes situations ou conditions expérimentales telles que le vieillissement ou l’exercice35,36,37,38. En outre, il peut être utile de mettre en évidence des altérations plus subtiles des composants nmj tels que la phosphorylation altérée de neurofilament dans les terminaisons nerveuses terminales comme indiqué dans la SLA39.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with cool light illumination</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-10A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking platform</td>
			<td>Biometra (WT 16)</td>
			<td>042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses (24 x 32 mm)</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>D102432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium (Plus) microscope slides</td>
			<td>PORLAB</td>
			<td>PC-201-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11253-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uniband LA-4C Scissors 125mm</td>
			<td>E.M.S</td>
			<td>77910-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disponsable surgical blades #10</td>
			<td>Sakira Medical</td>
			<td>1567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disponsable sterile syringe (1 ml)</td>
			<td>Sakira Medical</td>
			<td>1569</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super PAP pen</td>
			<td>E.M.S</td>
			<td>71310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;l or 200 &#956;l pipette</td>
			<td>Finnpipette</td>
			<td>9400130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 800 - AiryScan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H rats</td>
			<td>Taconic</td>
			<td>2148-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS (Dulbecco)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21600-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Bio Basic INC.</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>5092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Phosphorylated Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>801601</td>
			<td>Previously Covance # SMI 31P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Nonphosphorylated Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>801701</td>
			<td>Previously Covance # SMI-32P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Bungarotoxin, biotin-XX conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B1196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S32355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminophenylindole (DAPI)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8417</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of single skeletal muscle fibers for immunofluorescent and morphometric analyses of whole-mount neuromuscular junctions

La jonction neuromusculaire (NMJ) est un point de contact spécialisé entre le nerf moteur et le muscle squelettique. Cette synapse périphérique présente une plasticité morphologique et fonctionnelle élevée. Dans de nombreux désordres de système nerveux, NMJ est une cible pathologique tôt ayant pour résultat l’échec de neurotransmission, la faiblesse, l’atrophie, et même dans la mort de fibre musculaire. En raison de sa pertinence, la possibilité d’évaluer quantitativement certains aspects de la relation entre les composants NMJ peut aider à comprendre les processus associés à son assemblage / démontage. Le premier obstacle lorsque vous travaillez avec les muscles est d’acquérir l’expertise technique pour identifier et disséquer rapidement sans endommager leurs fibres. Le deuxième défi consiste à utiliser des méthodes de détection de haute qualité pour obtenir des images NMJ qui peuvent être utilisées pour effectuer des analyses quantitatives. Cet article présente un protocole étape par étape pour disséquer le longus de digitorum d’extenseur et les muscles de soleus des rats. Il explique également l’utilisation de l’immunofluorescence pour visualiser les éléments pré et postsynaptiques des NMJs à montage entier. Les résultats obtenus démontrent que cette technique peut être utilisée pour établir l’anatomie microscopique de la synapse et identifier des changements subtils dans le statut de certains de ses composants dans des conditions physiologiques ou pathologiques.

Ce protocole offre une méthode simple pour isoler et immunostain fibres musculaires de deux types différents de muscles (muscles à contraction rapide et lente, voir figure 1). En utilisant les marqueurs et /ou sondes corrects, les composants NMJ peuvent être détectés et évalués depuis un point de vue quantitatif pour évaluer certains des changements morphologiques qui peuvent survenir à la suite de la progression de la maladie ou d’un traitement médicamenteux spécifique. Dans l...

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions at JoVE.com

Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

La capacité de détecter avec précision les composants neuromusculaires de jonction est cruciale en évaluant les modifications de son architecture en raison des processus pathologiques ou développementaux. Nous présentons ici une description complète d’une méthode simple pour obtenir des images de haute qualité de jonctions neuromusculaires à montage entier qui peuvent être utilisées pour effectuer des mesures quantitatives.

Dissection des fibres musculaires squelettiques simples pour les analyses immunofluorescentes et morphométriques des jonctions neuromusculaires de mont entier

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...

Dissection des fibres musculaires squelettiques simples pour des analyses immunofluorescentes et morphométriques des jonctions neuromusculaires de entier-montage. Cette vidéo démontrera un protocole pour disséquer efficacement et sûrement les muscles EDL et soleus avec une approche reproductible. Cette vidéo enseignera également comment obtenir des jonctions neuromusculaires à montage entier dans le but de reconnaître les composants synaptiques avec intégrité 3D pour permettre une analyse morphométrique précise.Pour disséquer les muscles, ces instruments chirurgicaux sont nécessaires. Pour commencer la procédure, placez l’animal avec l’abdomen tourné vers le haut. Faites une incision initiale à l’aide d’une lame chirurgicale entre les orteils vers les membres postérieurs.Décollez la peau, en tirant vers le haut jusqu’à ce que le genou droit soit exposé. Pour trouver le CARE, suivez les tendons du pied jusqu’au ligament annulaire. Ce ligament entoure deux tendons.Coupez le ligament avec les ciseaux Uniband entre les deux tendons. Identifiez le tendon EDL en soulevant les deux et en voyant lequel fait bouger les toteils vers le haut. Couper le tendon avec des ciseaux.Tout en tenant le tendon avec une pince à épiler biologique, commencez à séparer lentement le muscle EDL des autres muscles des membres postérieurs. La séparation du muscle sans causer de dommages peut être faite en faisant diverses coupes sur le reste des muscles latéraux pour ouvrir un chemin entre eux, tout en maintenant et en soulevant le muscle de la section de division du tendon EDL. Pour isoler complètement le muscle, coupez le tendon attaché au genou du rat à l’aide de ciseaux Uniband.Plongez le muscle disséqué dans la solution fixatrice et laissez-le pendant 24 heures à quatre degrés Celsius. En général, il est utile d’avoir un muscle allongé. Pour ce faire, utilisez du carton et des agrafes pour fixer le muscle pour la fixation.Pour isoler le muscle soleus, retournez l’animal. À travers la peau, coupez le tendon calcanéal à l’aide d’une lame chirurgicale. Avec l’aide de la pince à épiler biologique et des ciseaux Uniband, séparez le muscle gastrocnémien des os, créant ainsi un couvercle musculaire.Le soleus sera sur le côté interne du couvercle musculaire. Il peut être identifié parce qu’il est rouge et plat. Avec une paire de pinces biologiques, atteignez et soulevez le tendon du soleus qui se trouve au-dessus du gastrocnémien.Coupez le tendon avec des ciseaux Uniband. Soulevez tout le muscle tout en coupant certains des points d’attache faibles. Enfin, pour libérer complètement le muscle soleus, coupez la vésicule du soleus qui forme le tendon calcanéal.Répétez l’étape de fixation comme cela a été fait avec le muscle EDL. Pour utiliser cette méthode, il est important de fixer les agrafes aux tendons et non au muscle. Une fois la période de fixation de 24 heures écoulée, rincez les muscles dans une solution de DPBS avant de commencer à isoler les fibres musculaires.Afin d’isoler les fibres, tenez doucement l’un des tendons avec une paire de pinces biologiques. Ensuite, avec l’autre paire de pinces biologiques, commencez à pincer lentement le tendon pour séparer les fibres musculaires. Pour isoler les fibres, tirez lentement vers le haut vers le tendon musculaire opposé.Il sera nécessaire de répéter cette action plusieurs fois jusqu’à obtenir plusieurs petits faisceaux isolés. Une fois séparés en petits faisceaux isolés, placez-les soigneusement dans une lame silanisée prétrâturée. Il est nécessaire de garder toutes les fibres ordonnées afin qu’elles ne se chevauchent pas.À ce stade, les fibres peuvent être laissées à sécher à l’air pendant 24 heures. Après 24 heures, commencez l’immunomarquage. Pour créer une barrière étanche, utilisez un stylo PAP pour encercler les fibres musculaires isolées dans la lame prétraitée.C’est un exemple d’une image confocale haute résolution qui peut être obtenue suivant le protocole décrit ici. En haut à gauche, l’élément post-synaptique est représenté, et en haut à droite, l’élément pré-synaptique, tandis que les images du bas montrent les composants synaptiques schématisés afin d’illustrer les paramètres qui seront utilisés pour l’analyse morphométrique. La deuxième diapositive montre la fusion des signaux pré-et post-synaptiques avec la tache des noyaux de l’API.Les différences entre les jonctions neuromusculaires des animaux transgéniques et des animaux non transgéniques sont clairement visibles. L’analyse morphométrique des jonctions neuromusculaires montre l’évidence du signal poteau-synaptique chez les animaux transgéniques et semble être plus compacte, principalement en raison de la zone totale réduite de jonction neuromusculaire. Comme indiqué ici, la zone pré-synaptique de jonction neuromusculaire de l’animal transgénique est réduite.Le plus petit détecté était celui trouvé avec le signal de neurofilament anti-phosphorylé, comme le montre l’image B, par exemple. La dernière image montre les résultats relatifs à l’état des jonctions neuromusculaires de montage entier. Utilisant l’index de couverture, on l’a établi que les jonctions neuromusculaires transgéniques se sont avérées être partiellement énervées.En outre, il pourrait déterminer que la couverture et le lien du neurofilament phosphorylé sont inférieurs à ceux obtenus lorsqu’un neurofilament non phosphorylé est détecté. Le protocole proposé permet d’obtenir des préparations de jonction neuromusculaire de haute qualité à partir de fibres musculaires lentes et rapides. Des composants neuromusculaires pré-et poteau-synaptiques de jonction ont été identifiés par des sondes ou des anticorps spécifiques, et puis es imaged dans la microscopie confocale confocale ou de super-résolution, permettant l’analyse morphométrique à une échelle micrométrique.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Dissection d&#39;un oeil de la souris pour un mont entiers de l&#39;épithélium pigmentaire rétinien

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Recherche

Neurosciences

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

Simple Drosophile Dissection ommatidie et imagerie

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Analyses morphométriques des sections rétiniennes

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Reproductible écrasement du nerf sciatique de souris et l&#39;évaluation subséquente de la régénération par l&#39;analyse du Mont muscle entier

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Mont entiers immunofluorescence de la rétine de souris néonatal chargé d&#39;enquêter sur l&#39;angiogenèse<em&gt; In vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection du muscle Transversus Abdominis pour l’analyse de jonction neuromusculaire à montage entier

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Mont entiers Dissection et immunofluorescence de la cochlée de souris adultes

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

Une seule étape simple protocole Dissection pour Whole-mount Préparation des adultes<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

Isolement de cellules endothéliales microvasculaires primaires murines Muscle squelettique

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Muscle Velocity Recovery Cycles to Examine Muscle Membrane Properties

Cycles de récupération de la vitesse musculaire pour examiner les propriétés de la membrane musculaire

Although conventional nerve conduction studies (NCS) and electromyography (EMG) are suitable for the diagnosis of neuromuscular disorders, they provide ...