Name: dissection of single skeletal muscle fibers for immunofluorescent and morphometric analyses of whole-mount neuromuscular junctions
Uploaded: 2021-08-14T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions at JoVE.com

Molte grazie al CSIC e al PEDECIBA per il sostegno finanziario dato a questo lavoro; a Natalia Rosano per le sue correzioni manoscritte; a Marcelo Casacuberta che realizza il video e a Nicolás Bolatto per aver prestato la sua voce per questo.

Tutte le procedure animali sono state eseguite secondo le linee guida della legge nazionale n. 18611 per la cura degli animali utilizzati a fini sperimentali. Il protocollo è stato approvato dal Comitato Etico Istituzionale (CEUA IIBCE, Protocollo Numero 004/09/2015).
1. Dissezione muscolare (Giorno 1)
NOTA: Prima di iniziare, fare 40 mL di paraformaldeide (PFA) allo 0,5%, pH 7,4 nella soluzione salina fosfato di Dulbecco (DPBS). Opzionalmente, fare 20 mL del 4% di P...

In questo articolo, presentiamo un protocollo dettagliato per la dissezione di due muscoli scheletrici del ratto (uno a contrazione lenta e l'altro a contrazione rapida), isolamento muscolare delle fibre e rilevamento dell'immunofluorescenza dei marcatori pre e postinaptici per valutare quantitativamente i cambiamenti nmj e i processi di assemblaggio / smontaggio. Questo tipo di protocollo può essere utile nei modelli diroditori 41,42 per valutare NMJ durante i ...

La giunzione neuromuscolare del mammifero (NMJ) è una grande sinapsi tripartita colinergica composta dalla terminazione nervosa del motoneurone, dalla membrana postssinaptica sulla fibra muscolare scheletrica e dalle cellule terminali di Schwann1,2,3. Questa sinapsi presenta un'elevata plasticità morfologica e funzionale4,5,6,7,8,anche durante l'età adulta quando gli MN possono subire modifiche strutturali dinamiche. Ad esempio, alcuni ricercatori hanno dimostrato che le terminazioni nervose motorie cambiano continuamente la loro forma alla scala micrometrica9. È stato anche riferito che la morfologia della NMJ risponde a requisiti funzionali, uso alterato, invecchiamento, esercizio fisico o variazioni nell'attivitàlocomotoria 4,10,11,12,13,14,15. Pertanto, l'allenamento e la mancanza di utilizzo rappresentano uno stimolo essenziale per modificare alcune caratteristiche della NMJ, come le sue dimensioni, lunghezza, dispersione di vescicole sinaptiche e recettori, così come la ramificazione terminalenervosa 14,16,17,18,19,20.
Inoltre, è stato dimostrato che qualsiasi cambiamento strutturale o degenerazione di questa giunzione vitale potrebbe causare la morte delle cellule dei motoneuroni e l'atrofiamuscolare 21. Si pensa anche che la comunicazione alterata tra nervi e muscoli potrebbe essere responsabile dei fisiologici cambiamenti di NMJ legati all'età e possibilmente della sua distruzione in stati patologici. Lo smantellamento della giunzione neuromuscolare gioca un ruolo cruciale nell'insorgenza della sclerosi laterale amiotrofica (SLA), una malattia neurodegenerativa che costituisce uno dei migliori esempi di interazione muscolo-nervosa compromessa3. Nonostante i numerosi studi condotti sulla disfunzione dei motoneuroni, si discute ancora se il deterioramento osservato nella SLA si verifichi a causa del danno diretto al motoneurone e poi si estenda alle proiezioni cortico-spinali22; o se deve essere considerato come un'assonopatia distale in cui la degenerazione inizia nelle terminazioni nervose e progredisce verso il somasdel motoneurone 23,24. Data la complessità della patologia della SLA, è logico considerare che si verifica un mix di processi indipendenti. Poiché nmj è il protagonista dell'interazione fisiopatologica tra muscolo e nervo, la sua destabilizzazione rappresenta un punto cardne dell'origine della malattia che è rilevante per essere analizzata.
Il sistema neuromuscolare dei mammiferi è funzionalmente organizzato in unità motorie discrete, costituite da un motoneurone e dalle fibre muscolari che sono esclusivamente innervate dal suo terminale nervoso. Ogni unità motore ha fibre con proprietà strutturali e funzionali simili o identiche25. Il reclutamento selettivo dei motoneuroni consente di ottimizzare la risposta muscolare alle esigenze funzionali. Ora è chiaro che i muscoli scheletrici dei mammiferi sono composti da quattro diversi tipi di fibre. Alcuni muscoli sono nominati in base alle caratteristiche del loro tipo di fibra più abbondante. Ad esempio, il soleo (un muscolo posteriore dell'arto posteriore coinvolto nel mantenimento della postura del corpo) porta la maggior parte delle unità a contrazione lenta (tipo 1) ed è riconosciuto come un muscolo lento. Invece, l'estensore digitorum longus (EDL) è essenzialmente composto da unità con proprietà simili a contrazione rapida (fibre di tipo 2) ed è noto come muscolo veloce specializzato per i movimenti fasici necessari per la locomozione. In altre parole, sebbene i muscoli adulti siano di natura plastica a causa delle influenze ormonali e neurali, la sua composizione in fibra determina la capacità di svolgere diverse attività, come si vede nel soleus che sperimenta un'attività continua a bassa intensità e L'EDL che mostra una singola contrazione più rapida. Altre caratteristiche che sono variabili tra i diversi tipi di fibre muscolari sono correlate alla loro struttura (contenuto mitocondriale, estensione del reticolo sarcoplasmatico, spessore della linea Z), contenuto di miosina ATPasi e composizione della catena pesante della miosina26,27,28,29.
Per i NMJ roditori, ci sono differenze significative tra imuscoli 28,29. Le analisi morfometriche eseguite in soleus ed EDL dai ratti hanno rivelato una correlazione positiva tra l'area sinaptica e il diametro delle fibre (cioè, l'area sinaptica nelle fibre lente soleus è maggiore che nelle fibre veloci EDL) ma il rapporto tra l'area NMJ e la dimensione della fibra è simile in entrambi imuscoli 30,31. Inoltre, in relazione ai terminali nervosi, le aree assolute della piastra terminale nelle fibre di tipo 1 erano inferiori rispetto alle fibre di tipo 2, mentre la normalizzazione per diametro delle fibre ha reso le aree dei terminali nervosi nelle fibre di tipo 1 lepiù grandi 32.
Tuttavia, pochissimi studi si concentrano sull'analisi morfometrica per mostrare l'evidenza dei cambiamenti in alcuni dei componentiNMJ 33,34. Pertanto, a causa della rilevanza della NMJ nella funzione dell'organismo, la cui morfologia e fisiologia sono alterate in varie patologie, è importante ottimizzare i protocolli di dissezione di diversi tipi di muscoli con qualità sufficiente a consentire la visualizzazione dell'intera struttura NMJ. È inoltre necessario valutare il verificarsi di cambiamenti pre o postinaptici in diverse situazioni o condizioni sperimentali come l'invecchiamento ol'esercizio fisico 35,36,37,38. Inoltre, può essere utile evidenzare alterazioni più sottili nei componenti NMJ come la fosforilazione del neurofilamento alterato nelle terminazioni nervose terminali come riportato nella SLA39.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with cool light illumination</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-10A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking platform</td>
			<td>Biometra (WT 16)</td>
			<td>042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses (24 x 32 mm)</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>D102432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium (Plus) microscope slides</td>
			<td>PORLAB</td>
			<td>PC-201-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11253-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uniband LA-4C Scissors 125mm</td>
			<td>E.M.S</td>
			<td>77910-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disponsable surgical blades #10</td>
			<td>Sakira Medical</td>
			<td>1567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disponsable sterile syringe (1 ml)</td>
			<td>Sakira Medical</td>
			<td>1569</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super PAP pen</td>
			<td>E.M.S</td>
			<td>71310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;l or 200 &#956;l pipette</td>
			<td>Finnpipette</td>
			<td>9400130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 800 - AiryScan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H rats</td>
			<td>Taconic</td>
			<td>2148-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS (Dulbecco)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21600-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Bio Basic INC.</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>5092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Phosphorylated Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>801601</td>
			<td>Previously Covance # SMI 31P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Nonphosphorylated Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>801701</td>
			<td>Previously Covance # SMI-32P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Bungarotoxin, biotin-XX conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B1196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S32355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminophenylindole (DAPI)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8417</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of single skeletal muscle fibers for immunofluorescent and morphometric analyses of whole-mount neuromuscular junctions

La giunzione neuromuscolare (NMJ) è un punto di contatto specializzato tra il nervo motorio e il muscolo scheletrico. Questa sinapsi periferica presenta un'elevata plasticità morfologica e funzionale. In numerosi disturbi del sistema nervoso, nmj è un bersaglio patologico precoce con conseguente fallimento della neurotrasmissione, debolezza, atrofia e persino nella morte delle fibre muscolari. A causa della sua rilevanza, la possibilità di valutare quantitativamente alcuni aspetti della relazione tra i componenti NMJ può aiutare a comprendere i processi associati al suo assemblaggio / smontaggio. Il primo ostacolo quando si lavora con i muscoli è quello di acquisire l'esperienza tecnica per identificare e sezionare rapidamente senza danneggiare le loro fibre. La seconda sfida consiste nell'utilizzare metodi di rilevamento di alta qualità per ottenere immagini NMJ che possono essere utilizzate per eseguire analisi quantitative. Questo articolo presenta un protocollo passo-passo per sezionare i muscoli extensor digitorum longus e soleus dai ratti. Spiega anche l'uso dell'immunofluorescenza per visualizzare elementi pre e postinaptici di NMJs a montaggio intero. I risultati ottenuti dimostrano che questa tecnica può essere utilizzata per stabilire l'anatomia microscopica della sinapsi e identificare sottili cambiamenti nello stato di alcuni dei suoi componenti in condizioni fisiologiche o patologiche.

Questo protocollo offre un metodo semplice per isolare e immunostain fibre muscolari da due diversi tipi di muscoli (muscoli a contrazione rapida e lenta, vedi Figura 1). Utilizzando i marcatori e/o le sonde corretti, i componenti NMJ possono essere rilevati e valutati poiché un punto di vista quantitativo per valutare alcuni dei cambiamenti morfologici che possono verificarsi come conseguenza della progressione della malattia o di uno specifico trattamento farmacologico. Nel presente studi...

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Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

La capacità di rilevare con precisione i componenti della giunzione neuromuscolare è fondamentale per valutare le modifiche nella sua architettura a causa di processi patologici o di sviluppo. Qui presentiamo una descrizione completa di un metodo semplice per ottenere immagini di alta qualità di giunzioni neuromuscolari a montaggio intero che possono essere utilizzate per eseguire misurazioni quantitative.

Dissezione di fibre muscolari scheletriche singole per analisi immunofluorescenti e morfometriche di giunzioni neuromuscolari a montaggio intero

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...

Dissezione di singole fibre muscolari scheletriche per analisi immunofluorescenti e morfometriche di giunzioni neuromuscolari a montaggio intero. Questo video dimostrerà un protocollo per sezionare in modo efficace e sicuro i muscoli EDL e soleus con un approccio ripetibile. Questo video insegnerà anche come ottenere giunzioni neuromuscolari a montaggio intero con l'obiettivo di riconoscere componenti sinaptici con integrità 3D per consentire un'accurata analisi morfometrica.Per sezionare i muscoli, sono necessari questi strumenti chirurgici. Per iniziare la procedura, posizionare l'animale con l'addome rivolto verso l'alto. Effettuare un'incisione iniziale utilizzando una lama chirurgica tra le dita dei piedi verso gli arti posteriori.Staccare la pelle, tirando verso l'alto fino a quando il ginocchio destro non è esposto. Per trovare l'EDL, seguire i tendini del piede fino al legamento anulare. Questo legamento circonda due tendini.Tagliare il legamento con le forbici Uniband tra i due tendini. Identificare il tendine EDL sollevando entrambi e vedendo quale fa muovere le dita dei piedi verso l'alto. Tagliare il tendine con le forbici.Tenendo il tendine con pinzette biologiche, inizia a separare lentamente il muscolo EDL dagli altri muscoli degli arti posteriori. La separazione del muscolo senza causare danni può essere fatta facendo vari tagli sul resto dei muscoli laterale per aprire un percorso tra di loro, tenendo e sollevando il muscolo dalla sezione di scissione del tendine EDL. Per isolare completamente il muscolo, tagliare il tendine attaccato al ginocchio del topo usando le forbici Uniband.Immergere il muscolo sezionato nella soluzione fissante e lasciarlo per 24 ore a quattro gradi Celsius. In generale, è utile avere un muscolo allungato. Per fare questo, utilizzare cartone e graffette per attaccare il muscolo per la fissazione.Per isolare il muscolo soleo, capovolgere l'animale. Attraverso la pelle, tagliare il tendine calcaneale usando una lama chirurgica. Con l'aiuto delle pinzette biologiche e delle forbici Uniband, separare il muscolo gastrocnemio dalle ossa, creando un coperchio muscolare.Il soleo sarà sul lato interno del coperchio muscolare. Può essere identificato perché è rosso e piatto. Con un paio di pinzette biologiche, raggiungere e sollevare il tendine soleo che si trova sopra il gastrocnemio sopra.Tagliare il tendine con le forbici Uniband. Sollevare l'intero muscolo mentre si tagliano alcuni dei punti di attacco deboli. Infine, per liberare completamente il muscolo soleo, tagliare la vescicola del soleo che forma il tendine calcaneale.Ripetere la fase di fissazione come fatto con il muscolo EDL. Per utilizzare questo metodo, è importante fissare le graffette ai tendini e non al muscolo. Una volta superato il periodo di fissazione di 24 ore, sciacquare i muscoli nella soluzione DPBS prima di iniziare a isolare le fibre muscolari.Per isolare le fibre, tenere delicatamente uno dei tendini con un paio di pinzette biologiche. Quindi, con l'altra coppia di pinzette biologiche, inizia a pizzicare lentamente il tendine per separare le fibre muscolari. Per isolare le fibre, tirare lentamente verso l'alto verso il tendine muscolare opposto.Sarà necessario ripetere questa azione più volte fino a ottenere più, piccoli bundle isolati. Una volta separati in piccoli fasci isolati, posizionarli con cura in uno scivolo silanizzato pretrattato. È necessario mantenere tutte le fibre in ordine in modo che non si sovrappongano.A questo punto, le fibre possono essere lasciate asciugare all'aria per 24 ore. Dopo 24 ore, inizia l'immunosocienza. Per creare una barriera impermeabile, utilizzare una penna PAP per circondare le fibre muscolari isolate nello scivolo pretrattato.Questo è un esempio di un'immagine confocale ad alta risoluzione che può essere ottenuta seguendo il protocollo descritto qui. In alto a sinistra, viene mostrato l'elemento post-sinaptico, e in alto a destra, l'elemento presinaptico, mentre le immagini in basso mostrano i componenti sinaptici schematizzati al fine di illustrare i parametri che verranno utilizzati per l'analisi morfometrica. La seconda diapositiva mostra l'unione dei segnali pre e post-sinaptici con la macchia dei nuclei dell'API.Le differenze tra le giunzioni neuromuscolari di animali transgenici e animali non transgenici sono chiaramente visibili. L'analisi morfometrica delle giunzioni neuromuscolari mostra prove del segnale post-sinaptico negli animali transgenici e sembra essere più compatta, principalmente a causa della ridotta area totale della giunzione neuromuscolare. Come mostrato qui, l'area pre-sinaptica della giunzione neuromuscolare dell'animale transgenico è ridotta.Il più piccolo rilevato è stato quello trovato con segnale di neurofilamento anti-fosforilato, come mostrato nell'immagine B, per esempio. L'ultima immagine mostra i risultati relativi allo stato delle giunzioni neuromuscolari a montaggio intero. Utilizzando l'indice di copertura, è stato stabilito che le giunzioni neuromuscolari transgeniche sono state trovate parzialmente denervate.Inoltre, potrebbe determinare che la copertura e il nesso del neurofilamento fosforilato è inferiore a quello ottenuto quando viene rilevato un neurofilamento non fosforilato. Il protocollo proposto consente di ottenere preparati di giunzione neuromuscolare di alta qualità da fibre muscolari lente e veloci. I componenti di giunzione neuromuscolare pre e post-sinaptica sono stati identificati da sonde o anticorpi specifici, e quindi immagini in microscopia confocale o confocale a super-risoluzione, consentendo l'analisi morfometrica su scala micrometrica.

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