Name: dissection of single skeletal muscle fibers for immunofluorescent and morphometric analyses of whole-mount neuromuscular junctions
Uploaded: 2021-08-14T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions at JoVE.com

Tusen takk til CSIC og PEDECIBA for den økonomiske støtten som er gitt til dette arbeidet; til Natalia Rosano for hennes manuskriptkorreksjoner; til Marcelo Casacuberta som lager videoen og til Nicolás Bolatto for å låne stemmen sin for den.

Alle dyreprosedyrer ble utført i henhold til retningslinjene i nasjonal lovgivning N° 18611 for pleie av dyr som brukes til eksperimentelle formål. Protokollen ble godkjent av Institutional Ethical Committee (CEUA IIBCE, Protokollnummer 004/09/2015).
1. Muskel disseksjon (Dag 1)
MERK: Før du begynner, lag 40 ml 0,5% paraformaldehyd (PFA), pH 7,4 i Dulbeccos fosfatsaltin (DPBS). Alternativt kan du lage 20 ml 4% PFA. Forbered 5 ml aliquots og frys ved -20 °C. På ...

I denne artikkelen presenterer vi en detaljert protokoll for disseksjon av to rotte skjelettmuskler (en langsom rykning og den andre raske rykninger), fibermuskelisolasjon og immunfluorescensdeteksjon av pre- og postsynaptiske markører for kvantitativt å vurdere NMJ-endringer samt montering / demonteringsprosesser. Denne typen protokoll kan være nyttig i gnagermodeller41,42 for å evaluere NMJ under fysiologiske eller patologiske prosesser som eksemplifisert h...

Pattedyret neuromuskulært kryss (NMJ) er en stor kolinrgisk trepartssynapse som består av motorisk nevronnervenden, den postsynaptiske membranen på skjelettmuskulaturfiberen og de terminale Schwann-cellene1,2,3. Denne synapsen viser høy morfologisk og funksjonell plastisitet4,5,6,7,8, selv under voksen alder når NMJs kan gjennomgå dynamiske strukturelle modifikasjoner. For eksempel har noen forskere vist at motoriske nerveender kontinuerlig endrer form på mikrometerskalaen9. Det er også rapportert at morfologien til NMJ svarer på funksjonelle krav, endret bruk, aldring, trening eller variasjoner i lokomotorisk aktivitet4,10,11,12,13,14,15. Dermed representerer trening og mangel på bruk essensiell stimulans for å endre noen egenskaper ved NMJ, for eksempel størrelse, lengde, spredning av synaptiske vesikler og reseptorer, samt nerveterminalgrening14,16,17,18,19,20.
Videre har det vist seg at enhver strukturell endring eller degenerasjon av dette vitale krysset kan føre til motorisk nevroncelledød og muskelatrofi21. Det antas også at endret kommunikasjon mellom nerver og muskler kan være ansvarlig for de fysiologiske aldersrelaterte NMJ-endringene og muligens for ødeleggelsen i patologiske tilstander. Neuromuscular kryss demontering spiller en avgjørende rolle i utbruddet av amyotrofisk lateral sklerose (ALS), en nevrodegenerativ sykdom som utgjør et av de beste eksemplene på nedsatt muskel-nerve samspill3. Til tross for de mange studiene som utføres på motorisk nevron dysfunksjon, er det fortsatt diskutert om forverringen observert i ALS oppstår på grunn av direkte skade på motornevronen og deretter strekker seg til kortiko-spinal projeksjonene22; eller hvis det skal betraktes som en distal axonopati der degenerasjon begynner i nerveendene og utvikler seg mot motornevronen somas23,24. Gitt kompleksiteten i ALS-patologi, er det logisk å vurdere at en blanding av uavhengige prosesser oppstår. Siden NMJ er den sentrale aktøren i det fysiopatiske samspillet mellom muskel og nerve, representerer destabiliseringen et sentralt punkt i opprinnelsen til sykdommen som er relevant for å bli analysert.
Pattedyrets nevromuskulære system er funksjonelt organisert i diskrete motorenheter, bestående av en motorisk nevron og muskelfibrene som utelukkende er innervated av nerveterminalen. Hver motorenhet har fibre med lignende eller identiske strukturelle og funksjonelle egenskaper25. Motor neuron selektiv rekruttering gjør det mulig å optimalisere muskelrespons på funksjonelle krav. Nå er det klart at pattedyr skjelettmuskulaturen består av fire forskjellige fibertyper. Noen muskler er navngitt i henhold til egenskapene til deres mest tallrike fibertype. For eksempel bærer soleus (en bakre muskel i bakre lem involvert i vedlikehold av kroppsstillingen) et flertall av langsomme rykninger (type 1) og er anerkjent som en langsom muskel. I stedet er extensor digitorum longus (EDL) i hovedsak sammensatt av enheter med lignende raske rykninger (type 2 fibre) og er kjent som en rask muskel spesialisert for fasiske bevegelser som trengs for bevegelse. Med andre ord, selv om voksne muskler er plastiske i naturen på grunn av hormonelle og nevrale påvirkninger, bestemmer fibersammensetningen kapasiteten til å utføre forskjellige aktiviteter, sett i soleus som opplever kontinuerlig lavintensitetsaktivitet og EDL som viser en raskere enkelt rykning. Andre funksjoner som er variable blant forskjellige typer muskelfibre er relatert til deres struktur (mitokondrieinnhold, utvidelse av sarkoplasmisk retikulum, tykkelsen på Z-linjen), myosin ATPaseinnhold og myosin tung kjedesammensetning26,27,28,29.
For gnager NMJs er det betydelige forskjeller mellom muskler28,29. Morfometriske analyser utført i soleus og EDL fra rotter avslørte en positiv sammenheng mellom synaptisk område og fiberdiameter (dvs. synaptisk område i soleus langsomme fibre er større enn i EDL raske fibre), men forholdet mellom NMJ-området og fiberstørrelsen er lik i begge musklene30,31. Også i forhold til nerveterminalene var endeplaten absolutte områder i type 1 fibre lavere enn i type 2 fibre, mens normaliseringen med fiberdiameter gjorde områder av nerveterminaler i type 1 fibre de største32.
Imidlertid fokuserer svært få studier på morfometrisk analyse for å vise tegn på endringer i noen av NMJ-komponentene33,34. På grunn av relevansen av NMJ i organismens funksjon, hvis morfologi og fysiologi endres i ulike patologier, er det viktig å optimalisere disseksjonsprotokoller av forskjellige typer muskler med kvalitet nok til å tillate visualisering av hele NMJ-strukturen. Det er også nødvendig å evaluere forekomsten av pre- eller postsynaptiske endringer i forskjellige eksperimentelle situasjoner eller forhold som aldring eller trening35,36,37,38. I tillegg kan det være nyttig å bevise mer subtile endringer i NMJ-komponenter som endret nevrofilamentfosforylering i terminale nerveender som rapportert i ALS39.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with cool light illumination</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-10A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking platform</td>
			<td>Biometra (WT 16)</td>
			<td>042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses (24 x 32 mm)</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>D102432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium (Plus) microscope slides</td>
			<td>PORLAB</td>
			<td>PC-201-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11253-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uniband LA-4C Scissors 125mm</td>
			<td>E.M.S</td>
			<td>77910-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disponsable surgical blades #10</td>
			<td>Sakira Medical</td>
			<td>1567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disponsable sterile syringe (1 ml)</td>
			<td>Sakira Medical</td>
			<td>1569</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super PAP pen</td>
			<td>E.M.S</td>
			<td>71310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;l or 200 &#956;l pipette</td>
			<td>Finnpipette</td>
			<td>9400130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 800 - AiryScan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H rats</td>
			<td>Taconic</td>
			<td>2148-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS (Dulbecco)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21600-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Bio Basic INC.</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>5092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Phosphorylated Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>801601</td>
			<td>Previously Covance # SMI 31P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Nonphosphorylated Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>801701</td>
			<td>Previously Covance # SMI-32P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Bungarotoxin, biotin-XX conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B1196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S32355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminophenylindole (DAPI)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8417</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of single skeletal muscle fibers for immunofluorescent and morphometric analyses of whole-mount neuromuscular junctions

Det nevromuskulære krysset (NMJ) er et spesialisert kontaktpunkt mellom motornerven og skjelettmuskelen. Denne perifere synapsen utviser høy morfologisk og funksjonell plastisitet. I mange nervesystemforstyrrelser er NMJ et tidlig patologisk mål som resulterer i nevrotransmisjonssvikt, svakhet, atrofi og til og med i muskelfiberdød. På grunn av sin relevans kan muligheten til kvantitativt å vurdere visse aspekter av forholdet mellom NMJ-komponenter bidra til å forstå prosessene knyttet til montering / demontering. Det første hinderet når du arbeider med muskler er å få den tekniske kompetansen til raskt å identifisere og dissekere uten å skade fibrene. Den andre utfordringen er å bruke deteksjonsmetoder av høy kvalitet for å få NMJ-bilder som kan brukes til å utføre kvantitativ analyse. Denne artikkelen presenterer en trinnvis protokoll for dissekering av ekstensor digitorum longus og soleus muskler fra rotter. Det forklarer også bruken av immunfluorescens for å visualisere pre- og postsynaptiske elementer av helmonterte NMJs. Oppnådde resultater viser at denne teknikken kan brukes til å etablere den mikroskopiske anatomien til synapsen og identifisere subtile endringer i statusen til noen av komponentene under fysiologiske eller patologiske forhold.

Denne protokollen tilbyr en enkel metode for å isolere og immunopprette muskelfibre fra to forskjellige typer muskler (raske og langsomme muskler, se figur 1). Ved hjelp av de riktige markørene og /eller sondene kan NMJ-komponenter oppdages og evalueres siden et kvantitativt synspunkt for å vurdere noen av de morfologiske endringene som kan oppstå som følge av sykdomsprogresjon eller en bestemt legemiddelbehandling. I den nåværende studien ble presynaptiske og postsynaptiske komponent...

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions at JoVE.com

Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

Evnen til å nøyaktig oppdage nevromuskulære koblingskomponenter er avgjørende for å evaluere modifikasjoner i arkitekturen på grunn av patologiske eller utviklingsmessige prosesser. Her presenterer vi en komplett beskrivelse av en enkel metode for å oppnå bilder av høy kvalitet av helmonterte nevromuskulære veikryss som kan brukes til å utføre kvantitative målinger.

Disseksjon av enkle skjelettmuskulaturfibre for immunfluorescerende og morfometriske analyser av hel-mount nevromuskulære veikryss

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...

Disseksjon av enkle skjelettmuskulaturfibre for immunfluoreserende og morfometriske analyser av helmonterte nevromuskulære veikryss. Denne videoen vil demonstrere en protokoll for effektivt og sikkert dissekere EDL og soleus muskler med en repeterbar tilnærming. Denne videoen vil også lære å oppnå helmonterte nevromuskulære veikryss med sikte på å gjenkjenne synaptiske komponenter med 3D-integritet for å tillate en nøyaktig morfometrisk analyse.For å dissekere musklene, er disse kirurgiske instrumentene nødvendige. For å starte prosedyren, plasser dyret med magen vendt oppover. Lag et innledende snitt ved hjelp av et kirurgisk blad mellom tærne mot bakre lemmer.Skrell av huden, trekk oppover til høyre kne er utsatt. For å finne EDL, følg fot sener til ringformet ligament. Dette ligamentet sirkler rundt to sener.Klipp ligamentet med Uniband-saksen mellom de to senene. Identifiser EDL-senen ved å løfte begge og se hvilken som får tåene til å bevege seg oppover. Klipp senen med saks.Mens du holder senen med biologiske pinsett, begynner du sakte å skille EDL-muskelen fra de andre bakre lemmusklene. Separasjon av muskelen uten å forårsake skade kan gjøres ved å gjøre ulike kutt på resten av laterale muskler for å åpne en bane mellom dem, mens du holder og løfter muskelen fra splitting delen av EDL senen. For å isolere muskelen helt, kutt senen som er festet til rotte kneet ved hjelp av Uniband saks.Senk den dissekerte muskelen i den fixative løsningen, og la den stå i 24 timer ved fire grader Celsius. Generelt er det nyttig å ha en langstrakt muskel. For å gjøre dette, bruk papp og stifter for å feste muskelen for fiksering.For å isolere soleusmuskelen, snu dyret. Gjennom huden, kutt calcaneal senen ved hjelp av et kirurgisk blad. Ved hjelp av de biologiske pinsettene og Uniband saks, skille gastrocnemius muskelen fra beinene, skape et muskuløst lokk.Sålen vil være på innsiden av muskellokket. Det kan identifiseres fordi det er rødt og flatt. Med et par biologiske pinsett, nå og løft soleus senen som ligger over over gastrocnemius.Klipp senen med Uniband saks. Løft hele muskelen mens du kutter noen av de svake festepunktene. Til slutt, for å frigjøre soleusmuskelen helt, kutt sålen vesicle som danner calcaneal senen.Gjenta fikseringstrinnet som gjort med EDL-muskelen. For å bruke denne metoden er det viktig å sikre stiftene til senene og ikke til muskelen. Når den 24-timers fikseringsperioden har gått, skyll musklene i DPBS-løsningen før du begynner å isolere muskelfibrene.For å isolere fibrene, hold forsiktig en av senene med ett par biologiske pinsett. Deretter med det andre paret biologiske pinsett, begynner å sakte klemme senen for å skille muskelfibrene. For å isolere fibrene, trekk sakte oppover mot motsatt muskelsenne.Det vil være nødvendig å gjenta denne handlingen flere ganger til du får flere, små, isolerte bunter. Når de er separert i små isolerte bunter, plasser dem forsiktig i en forhåndsbehandlet silanisert lysbilde. Det er nødvendig å holde alle fibrene ryddig slik at de ikke overlapper.På dette tidspunktet kan fibrene bli igjen for å lufttørke i 24 timer. Etter 24 timer, begynn immunstaining. For å lage en vanntett barriere, bruk en PAP-penn for å omringe de isolerte muskelfibrene i det forhåndsbehandlede lysbildet.Dette er et eksempel på et konfokalt bilde med høy oppløsning som kan hentes ved å følge protokollen som er beskrevet her. Øverst til venstre vises det postsynaptiske elementet, og øverst til høyre vises det presynaptiske elementet, mens de nederste bildene viser de synaptiske komponentene skjematisert for å illustrere parametrene som skal brukes til morfometrisk analyse. Det andre lysbildet viser sammenslåingen av pre- og postsynaptiske signaler med kjernen i API-et.Forskjeller mellom nevromuskulære kryss av transgene dyr og ikke-transgene dyr er tydelig synlige. Den morfometriske analysen av nevromuskulære veikryss viser bevis på det postsynaptiske signalet hos transgene dyr og ser ut til å være mer kompakt, hovedsakelig på grunn av redusert nevromuskulært kryss totalareal. Som vist her, reduseres det nevromuskulære krysset presynaptisk område av det transgene dyret.Den minste som ble oppdaget var den som ble funnet med anti-fosforylatert nevrofilamentsignal, som vist i bilde B, for eksempel. Det siste bildet viser resultatene knyttet til statusen til helmonterte nevromuskulære veikryss. Ved hjelp av dekningsindeksen ble det fastslått at de transgene nevromuskulære kryssene ble funnet delvis denervated.Det kan også bestemme at dekningen og nexus av fosforylatert nevrofilament er lavere enn oppnådd når en ikke-fosforilert nevrofilament oppdages. Den foreslåtte protokollen gjør det mulig å oppnå nevromuskulære knutepunktpreparater av høy kvalitet fra langsomme og raske muskelfibre. Pre- og postsynaptiske nevromuskulære koblingskomponenter ble identifisert av spesifikke sonder eller antistoffer, og deretter avbildet i konfokal eller superoppløselig konfokal mikroskopi, noe som muliggjør morfometrisk analyse i mikrometrisk skala.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morfometriske Analyser av netthinnens Seksjoner

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Reproduserbar Mouse hoftenervene Crush og påfølgende vurdering av Regeneration av Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Hele Mount Immunofluorescent Farging av Neonatal Mouse Retina å etterforske Angiogenesis<em&gt; In vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Disseksjon av Transversus Abdominis Muscle for hel-mount Neuromuscular Junction Analyse

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Hele Mount Dissection og Immunfluorescens av Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

En enkel ett-trinns Dissection Protokoll for Whole-mount Utarbeidelse av Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

Isolering av primære Murine Skjelettmuskel mikrovaskulær endotelceller

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Muscle Velocity Recovery Cycles to Examine Muscle Membrane Properties

Muskel hastighet recovery sykluser for å undersøke muskelmembran egenskaper

Although conventional nerve conduction studies (NCS) and electromyography (EMG) are suitable for the diagnosis of neuromuscular disorders, they provide ...