Name: dissection of single skeletal muscle fibers for immunofluorescent and morphometric analyses of whole-mount neuromuscular junctions
Uploaded: 2021-08-14T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions at JoVE.com

Muito obrigado ao CSIC e ao PEDECIBA pelo apoio financeiro dado a este trabalho; para Natalia Rosano para suas correções manuscritos; para Marcelo Casacuberta que faz o vídeo e para Nicolás Bolatto por emprestar sua voz para ele.

Todos os procedimentos animais foram realizados de acordo com as diretrizes da Lei Nacional nº 18.611 para cuidados com animais utilizados para fins experimentais. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética Institucional (CEUA IIBCE, Protocolo nº 004/09/2015).
1. Dissecção muscular (Dia 1)
NOTA: Antes de começar, faça 40 mL de paraformaldeído (PFA), pH 7,4 na solução salina fosfato de Dulbecco (DPBS). Opcionalmente, faça 20 mL de 4% pfa. Prepare 5 mL al...

Neste artigo, apresentamos um protocolo detalhado para a dissecção de dois músculos esqueléticos de ratos (um contração lenta e outro de contração rápida), isolamento muscular de fibras e detecção de imunofluorescência de marcadores pré e pós-sinápticos para avaliar quantitativamente as alterações do NMJ, bem como processos de montagem/desmontagem. Esse tipo de protocolo pode ser útil nos modelos de roedores41,42 para avaliar nmj durante process...

A junção neuromuscular do mamífero (NMJ) é uma grande sinapse tripartite colinérgica composta pelo nervo do neurônio motor, a membrana pós-sináptica na fibra muscular esquelética e as células schwann terminais1,2,3. Esta sinapse apresenta alta plasticidade morfológica e funcional4,5,6,7,8, mesmo durante a idade adulta, quando os NMJs podem sofrer modificações estruturais dinâmicas. Por exemplo, alguns pesquisadores têm mostrado que terminações nervosas motoras mudam continuamente sua forma na escala de micrômetros9. Também foi relatado que a morfologia do NMJ responde aos requisitos funcionais, uso alterado, envelhecimento, exercício ou variações na atividade locomotor4,10,11,12,13,14,15. Assim, o treinamento e a falta de uso representam estímulos essenciais para modificar algumas características do NMJ, como seu tamanho, comprimento, dispersão de vesículas e receptores sinápticos, bem como ramificação terminal nervoso14,16,17,18,19,20.
Além disso, foi demonstrado que qualquer alteração estrutural ou degeneração dessa junção vital poderia resultar em morte celular do neurônio motor e atrofia muscular21. Acredita-se também que a comunicação alterada entre nervos e músculos poderia ser responsável pelas alterações fisiológicas relacionadas à idade do NMJ e possivelmente por sua destruição em estados patológicos. O desmantelamento da junção neuromuscular desempenha um papel crucial no surgimento da Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA), doença neurodegenerativa que constitui um dos melhores exemplos de interação músculo-nervo prejudicada3. Apesar dos inúmeros estudos realizados sobre a disfunção do neurônio motor, ainda se debate se a deterioração observada na ELA ocorre devido ao dano direto no neurônio motor e, em seguida, estende-se às projeções cortico-espinhais22; ou se deve ser considerada como uma axonopatia distal onde a degeneração começa nas terminações nervosas e progride em direção ao neurônio motor somas23,24. Dada a complexidade da patologia da ELA, é lógico considerar que ocorre uma mistura de processos independentes. Como o NMJ é o ator central da interação fisiopatológica entre músculo e nervo, sua desestabilização representa um ponto crucial na origem da doença que é relevante a ser analisada.
O sistema neuromuscular de mamíferos é funcionalmente organizado em unidades motoras discretas, consistindo de um neurônio motor e as fibras musculares que são exclusivamente inervadas pelo seu terminal nervoso. Cada unidade motora possui fibras com propriedades estruturais e funcionais semelhantes ou idênticas25. O recrutamento seletivo do neurônio motor permite otimizar a resposta muscular às demandas funcionais. Agora está claro que os músculos esqueléticos dos mamíferos são compostos de quatro tipos diferentes de fibras. Alguns músculos são nomeados de acordo com as características de seu tipo de fibra mais abundante. Por exemplo, o soleus (um músculo posterior do membro posterior envolvido na manutenção da postura corporal) possui a maioria das unidades de contração lenta (tipo 1) e é reconhecido como um músculo lento. Em vez disso, o extensor digitorum longus (EDL) é essencialmente composto de unidades com propriedades semelhantes de contração rápida (fibras tipo 2) e é conhecido como um músculo rápido especializado para movimentos filásticos necessários para a locomoção. Em outras palavras, embora os músculos adultos sejam de natureza plástica devido às influências hormonais e neurais, sua composição de fibras determina a capacidade de realizar diferentes atividades, como visto no soleus que experimenta atividade contínua de baixa intensidade e EDL que exibe uma contração única mais rápida. Outras características que são variáveis entre diferentes tipos de fibras musculares estão relacionadas à sua estrutura (conteúdo mitocondrial, extensão do ânticulo sarcoplasmático, espessura da linha Z), teor de myosina ATPase e composição da cadeia pesada de miosina26,27,28,29.
Para os NMJs roedores, há diferenças significativas entre os músculos28,29. Análises morfométricas realizadas em soleus e EDL de ratos revelaram uma correlação positiva entre a área sináptica e o diâmetro da fibra (ou seja, a área sináptica em fibras lentas soleus é maior do que nas fibras rápidas EDL), mas a razão entre a área de NMJ e o tamanho da fibra é semelhante em ambos os músculos30,31. Além disso, em relação aos terminais nervosos, as áreas absolutas da placa endplate nas fibras tipo 1 foram menores do que nas fibras tipo 2, enquanto a normalização por diâmetro de fibras fez áreas de terminais nervosos nas fibras tipo 1 as maiores32.
No entanto, pouquíssimos estudos se concentram na análise morfométrica para mostrar as evidências de mudanças em alguns dos componentes do NMJ33,34. Assim, devido à relevância do NMJ na função do organismo, cuja morfologia e fisiologia são alteradas em diversas patologias, é importante otimizar protocolos de dissecção de diferentes tipos de músculos com qualidade suficiente para permitir a visualização de toda a estrutura do NMJ. Também é necessário avaliar a ocorrência de alterações pré ou pós-sinápticas em diferentes situações experimentais ou condições como envelhecimento ou exercício35,36,37,38. Além disso, pode ser útil evidenciar alterações mais sutis em componentes do NMJ, como a fosforilação de neurofilamento alterada nas terminações nervosas terminais terminais, conforme relatado na ALS39.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with cool light illumination</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-10A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking platform</td>
			<td>Biometra (WT 16)</td>
			<td>042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses (24 x 32 mm)</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>D102432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium (Plus) microscope slides</td>
			<td>PORLAB</td>
			<td>PC-201-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11253-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uniband LA-4C Scissors 125mm</td>
			<td>E.M.S</td>
			<td>77910-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disponsable surgical blades #10</td>
			<td>Sakira Medical</td>
			<td>1567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disponsable sterile syringe (1 ml)</td>
			<td>Sakira Medical</td>
			<td>1569</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super PAP pen</td>
			<td>E.M.S</td>
			<td>71310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;l or 200 &#956;l pipette</td>
			<td>Finnpipette</td>
			<td>9400130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 800 - AiryScan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H rats</td>
			<td>Taconic</td>
			<td>2148-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS (Dulbecco)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21600-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Bio Basic INC.</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>5092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Phosphorylated Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>801601</td>
			<td>Previously Covance # SMI 31P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Nonphosphorylated Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>801701</td>
			<td>Previously Covance # SMI-32P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Bungarotoxin, biotin-XX conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B1196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S32355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminophenylindole (DAPI)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8417</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of single skeletal muscle fibers for immunofluorescent and morphometric analyses of whole-mount neuromuscular junctions

A junção neuromuscular (NMJ) é um ponto de contato especializado entre o nervo motor e o músculo esquelético. Esta sinapse periférica exibe alta plasticidade morfológica e funcional. Em numerosos distúrbios do sistema nervoso, nMJ é um alvo patológico precoce resultando em falha de neurotransmissão, fraqueza, atrofia e até mesmo na morte da fibra muscular. Devido à sua relevância, a possibilidade de avaliar quantitativamente certos aspectos da relação entre os componentes do NMJ pode ajudar a compreender os processos associados à sua montagem/desmontagem. O primeiro obstáculo ao trabalhar com músculos é obter a expertise técnica para identificar e dissecar rapidamente sem danificar suas fibras. O segundo desafio é utilizar métodos de detecção de alta qualidade para obter imagens NMJ que possam ser usadas para realizar análise quantitativa. Este artigo apresenta um protocolo passo-a-passo para dissecar extensor digitorum longus e soleus músculos de ratos. Também explica o uso da imunofluorescência para visualizar elementos pré e postingaptáticos de NMJs de montagem integral. Os resultados obtidos demonstram que essa técnica pode ser usada para estabelecer a anatomia microscópica da sinapse e identificar alterações sutis no status de alguns de seus componentes em condições fisiológicas ou patológicas.

Este protocolo oferece um método simples para isolar e imunostain fibras musculares de dois tipos diferentes de músculos (músculos de contração rápida e lenta, ver Figura 1). Utilizando os marcadores e/ou sondas corretos, os componentes do NMJ podem ser detectados e avaliados, uma vez que um ponto de vista quantitativo para avaliar algumas das alterações morfológicas que podem ocorrer como consequência da progressão da doença ou de um tratamento medicamentoso específico. No pres...

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Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

A capacidade de detectar com precisão componentes de junção neuromuscular é crucial na avaliação de modificações em sua arquitetura devido a processos patológicos ou de desenvolvimento. Aqui apresentamos uma descrição completa de um método simples para obter imagens de alta qualidade de junções neuromusculares de montagem inteira que podem ser usadas para realizar medições quantitativas.

Dissecção de fibras musculares esqueléticas únicas para análises imunofluorescentes e morfométricas de junções neuromusculares de monte inteiro

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...

Dissecção de fibras musculares esqueléticas únicas para análises imunofluorescentes e morfométricas de junções neuromusculares de montagem inteira. Este vídeo demonstrará um protocolo para dissecar os músculos EDL e soleus de forma eficaz e segura com uma abordagem repetível. Este vídeo também ensinará como obter junções neuromusculares de montagem total com o objetivo de reconhecer componentes sinápticos com integridade 3D para permitir uma análise morfométrica precisa.Para dissecar os músculos, esses instrumentos cirúrgicos são necessários. Para iniciar o procedimento, coloque o animal com o abdômen voltado para cima. Faça uma incisão inicial usando uma lâmina cirúrgica entre os dedos dos dedos dos membros traseiros.Retire a pele, puxando para cima até que o joelho direito seja exposto. Para encontrar o EDL, siga os tendões do pé até o ligamento anular. Este ligamento circunda dois tendões.Corte o ligamento com a tesoura Uniband entre os dois tendões. Identifique o tendão edl levantando ambos e vendo qual deles faz os dedos se moverem para cima. Corte o tendão com uma tesoura.Enquanto segura o tendão com pinças biológicas, comece a separar lentamente o músculo EDL dos outros músculos do membro traseiro. A separação do músculo sem causar danos pode ser feita fazendo vários cortes no resto dos músculos laterais para abrir um caminho entre eles, enquanto segura e levanta o músculo da parte de divisão do tendão edl. Para isolar completamente o músculo, corte o tendão que está preso ao joelho do rato usando uma tesoura Uniband.Mergulhe o músculo dissecado na solução fixativa, e deixe-o por 24 horas a quatro graus Celsius. Em geral, é útil ter um músculo alongado. Para isso, use papelão e grampos para fixar o músculo para fixação.Para isolar o músculo soleus, vire o animal. Através da pele, corte o tendão calcâneo usando uma lâmina cirúrgica. Com a ajuda da pinça biológica e da tesoura Uniband, separe o músculo gastrocnemius dos ossos, criando uma tampa muscular.O soleus estará no lado interno da tampa muscular. Pode ser identificado porque é vermelho e plano. Com um par de pinças biológicas, alcance e levante o tendão do soleus que fica acima do gastrocnemius.Corte o tendão com uma tesoura Uniband. Levante todo o músculo enquanto corta alguns dos pontos fracos de fixação. Finalmente, para libertar completamente o músculo soleus, corte a vesícula soleus que forma o tendão calcâneo.Repita a etapa de fixação como feito com o músculo EDL. Para usar este método, é importante fixar os grampos nos tendões e não no músculo. Uma vez passado o período de fixação de 24 horas, enxágue os músculos na solução DPBS antes de começar a isolar as fibras musculares.Para isolar as fibras, segure suavemente um dos tendões com um par de pinças biológicas. Em seguida, com o outro par de pinças biológicas, comece a lentamente beliscar o tendão para separar as fibras musculares. Para isolar as fibras, puxe lentamente para cima em direção ao tendão muscular oposto.Será necessário repetir essa ação várias vezes até obter múltiplos, pequenos e isolados pacotes. Uma vez separados em pequenos feixes isolados, coloque-os cuidadosamente em um slide silanizado pré-tratado. É necessário manter todas as fibras ordenadas para que elas não se sobreponham.Neste ponto, as fibras podem ser deixadas para secar ao ar por 24 horas. Depois de 24 horas, comece a imunossuagem. Para criar uma barreira impermeável, use uma caneta PAP para cercar as fibras musculares isoladas no slide pré-tratado.Este é um exemplo de uma imagem confocal de alta resolução que pode ser obtida seguindo o protocolo descrito aqui. No canto superior esquerdo, o elemento pós-sináptico é mostrado, e no canto superior direito, o elemento pré-sináptico, enquanto as imagens inferiores mostram os componentes sinápticos esquematizados a fim de ilustrar os parâmetros que serão usados para análise morfométrica. O segundo slide mostra a fusão dos sinais pré e pós-sinápticos com a mancha de núcleo da API.As diferenças entre as junções neuromusculares de animais transgênicos e animais não transgênicos são claramente visíveis. A análise morfométrica das junções neuromusculares mostra evidências do sinal pós-sináptico em animais transgênicos e parece ser mais compacta, principalmente devido à redução da área total da junção neuromuscular. Como mostrado aqui, a junção neuromuscular área pré-sináptica do animal transgênico é reduzida.O menor detectado foi o encontrado com sinal de neurofilamento antifosforylated, como mostrado na imagem B, por exemplo. A última imagem mostra os resultados relativos ao estado das junções neuromusculares de montagem total. Utilizando o índice de cobertura, foi estabelecido que as junções neuromusculares transgênicas foram encontradas parcialmente denervadas.Além disso, pode determinar que a cobertura e o nexo do neurofilamento fosfoilado é menor do que o obtido quando um neurofilamento não fosfoilado é detectado. O protocolo proposto permite obter preparações de junção neuromuscular de alta qualidade a partir de fibras musculares lentas e rápidas. Os componentes de junção neuromuscular pré e pós-sináptica foram identificados por sondas ou anticorpos específicos e, em seguida, retratados em microscopia confocal ou super-resolução, permitindo a análise morfométrica em escala micrométrica.

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