Name: density gradient ultracentrifugation for investigating endocytic recycling in mammalian cells
Uploaded: 2021-06-30T13:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells at JoVE.com

इस काम को रिसर्च ग्रांट काउंसिल हांगकांग, सीयूएचके डायरेक्ट ग्रांट स्कीम, यूनाइटेड कॉलेज एंडोमेंट फंड और टीयूवाईएफ चैरिटेबल ट्रस्ट के फंड्स ने सपोर्ट किया । इस काम के आंकड़े हमारे पिछले प्रकाशन से अनुकूलित किए गए थे, "ARF6-Rac1 सिग्नलिंग-मध्यस्थता न्यूराइट आउटग्रोथ को अक्टूबर 2020 में फासेब जर्नल में प्रकाशित ARF6 और ELMO1 के माध्यम से न्यूरोनल एडाप्टर FE65 द्वारा शक्तिशाली है।

1. स्तनधारी सेल संस्कृति और ट्रांसफैक्शन
<ol><li>प्लेट 2 x 106 कोशिकाओं में एक 100 मिमी संस्कृति पकवान. प्रत्येक ट्रांसफैक्शन के लिए चार व्यंजनों का उपयोग करें। नोट: आवश्यक कोशिकाओं की संख्या विभिन्न सेल ल?...

<ol>
	<li>Elkin, S. R., Lakoduk, A. M., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+pathways+and+endosomal+trafficking:+a+primer.">Endocytic pathways and endosomal trafficking: a primer.</a> Wiener Medizinische Wochenschrift. 166 (7-8), 196-204 (2016).</li><li>Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+unplugged:+multiple+ways+to+enter+the+cell.">Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell.</a> Cell Research. 20 (3), 256-275 (2010).</li><li>Naslavsky, N., Caplan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enigmatic+endosome+-+sorting+the+ins+and+outs+of+endocytic+trafficking.">The enigmatic endosome - sorting the ins and outs of endocytic trafficking.</a> Journal of Cell Science. 131 (13), (2018).</li><li>Cullen, P. J., Steinberg, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+degrade+or+not+to+degrade:+mechanisms+and+significance+of+endocytic+recycling.">To degrade or not to degrade: mechanisms and significance of endocytic recycling.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 679-696 (2018).</li><li>Weeratunga, S., Paul, B., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognising+the+signals+for+endosomal+trafficking.">Recognising the signals for endosomal trafficking.</a> Current Opinion in Cell Biology. 65, 17-27 (2020).</li><li>Khan, I., Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis:+a+pivotal+pathway+for+regulating+metastasis.">Endocytosis: a pivotal pathway for regulating metastasis.</a> British Journal of Cancer. 124 (1), 66-75 (2021).</li><li>Grant, B. D., Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+and+mechanisms+of+endocytic+recycling.">Pathways and mechanisms of endocytic recycling.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).</li><li>Maxfield, F. R., McGraw, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+recycling.">Endocytic recycling.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (2), 121-132 (2004).</li><li>McDonald, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explosion+in+the+complexity+of+membrane+protein+recycling.">Explosion in the complexity of membrane protein recycling.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (4), 483-494 (2021).</li><li>O'Sullivan, M. J., Lindsay, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Endosomal+Recycling+pathway-at+the+crossroads+of+the+cell.">The Endosomal Recycling pathway-at the crossroads of the cell.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6074 (2020).</li><li>D'Souza-Schorey, C., Li, G., Colombo, M. I., Stahl, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+role+for+ARF6+in+receptor-mediated+endocytosis.">A regulatory role for ARF6 in receptor-mediated endocytosis.</a> Science. 267 (5201), 1175-1178 (1995).</li><li>Schweitzer, J. K., Sedgwick, A. E., D'Souza-Schorey, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARF6-mediated+endocytic+recycling+impacts+cell+movement,+cell+division+and+lipid+homeostasis.">ARF6-mediated endocytic recycling impacts cell movement, cell division and lipid homeostasis.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 22 (1), 39-47 (2011).</li><li>Finicle, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipids+inhibit+endosomal+recycling+of+nutrient+transporters+by+inactivating+ARF6.">Sphingolipids inhibit endosomal recycling of nutrient transporters by inactivating ARF6.</a> Journal of Cell Science. 131 (12), (2018).</li><li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APE1+upregulates+MMP-14+via+redox-sensitive+ARF6-mediated+recycling+to+promote+cell+invasion+of+esophageal+adenocarcinoma.">APE1 upregulates MMP-14 via redox-sensitive ARF6-mediated recycling to promote cell invasion of esophageal adenocarcinoma.</a> Cancer Research. 79 (17), 4426-4438 (2019).</li><li>Qi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arf6-driven+endocytic+recycling+of+CD147+determines+HCC+malignant+phenotypes.">Arf6-driven endocytic recycling of CD147 determines HCC malignant phenotypes.</a> Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 38 (1), 471 (2019).</li><li>Crupi, M. J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GGA3-mediated+recycling+of+the+RET+receptor+tyrosine+kinase+contributes+to+cell+migration+and+invasion.">GGA3-mediated recycling of the RET receptor tyrosine kinase contributes to cell migration and invasion.</a> Oncogene. 39 (6), 1361-1377 (2020).</li><li>Gamara, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Arf6+deletion+in+PLB-985+differentiated+in+neutrophil-like+cells+and+in+mouse+neutrophils:+impact+on+adhesion+and+migration.">Assessment of Arf6 deletion in PLB-985 differentiated in neutrophil-like cells and in mouse neutrophils: impact on adhesion and migration.</a> Mediators of Inflammation. 2020, 2713074 (2020).</li><li>Santy, L. C., Ravichandran, K. S., Casanova, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DOCK180/Elmo+complex+couples+ARNO-mediated+Arf6+activation+to+the+downstream+activation+of+Rac1.">The DOCK180/Elmo complex couples ARNO-mediated Arf6 activation to the downstream activation of Rac1.</a> Current Biology. 15 (19), 1749-1754 (2005).</li><li>Wibo, M., Dumont, J. E., Brown, B. L., Marshall, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fractionation+by+centrifugation+methods.">Cell fractionation by centrifugation methods.</a> Eukaryotic Cell Function and Growth: Regulation by Intracellular Cyclic Nucleotides. , 1-17 (1976).</li><li>Kelly, E. E., Horgan, C. P., McCaffrey, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab11+proteins+in+health+and+disease.">Rab11 proteins in health and disease.</a> Biochemical Society Transactions. 40 (6), 1360-1367 (2012).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+adaptor+FE65+stimulates+Rac1-mediated+neurite+outgrowth+by+recruiting+and+activating+ELMO1.">Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).</li><li>Chan, W. W. R., Li, W., Chang, R. C. C., Lau, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARF6-Rac1+signaling-mediated+neurite+outgrowth+is+potentiated+by+the+neuronal+adaptor+FE65+through+orchestrating+ARF6+and+ELMO1.">ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (12), 16397-16413 (2020).</li><li>Huber, L. A., Pfaller, K., Vietor, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+proteomics:+implications+for+subcellular+fractionation+in+proteomics.">Organelle proteomics: implications for subcellular fractionation in proteomics.</a> Circulation Research. 92 (9), 962-968 (2003).</li><li>Fleischer, S., Kervina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+fractionation+of+rat+liver.">Subcellular fractionation of rat liver.</a> Methods in Enzymology. 31, 6-41 (1974).</li><li>Marsh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosome+and+lysosome+purification+by+free-flow+electrophoresis.">Endosome and lysosome purification by free-flow electrophoresis.</a> Methods in Cell Biology. 31, 319-334 (1989).</li><li>Stasyk, T., Huber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zooming+in:+fractionation+strategies+in+proteomics.">Zooming in: fractionation strategies in proteomics.</a> Proteomics. 4 (12), 3704-3716 (2004).</li><li>Iordachescu, A., Hulley, P., Grover, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+collection+of+nanoscopic+vesicles+from+an+organotypic+culture+model.">A novel method for the collection of nanoscopic vesicles from an organotypic culture model.</a> RSC Advances. 8 (14), 7622-7632 (2018).</li><li>Chavrier, P., vander Sluijs, P., Mishal, Z., Nagelkerken, B., Gorvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+endosome+membrane+dynamics+characterized+by+flow+cytometry.">Early endosome membrane dynamics characterized by flow cytometry.</a> Cytometry. 29 (1), 41-49 (1997).</li><li>Chasan, A. I., Beyer, M., Kurts, C., Burgdorf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+specialized,+antigen-loaded+early+endosomal+subpopulation+by+flow+cytometry.">Isolation of a specialized, antigen-loaded early endosomal subpopulation by flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 960, 379-388 (2013).</li><li>Thapa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol-3-OH+kinase+signaling+is+spatially+organized+at+endosomal+compartments+by+microtubule-associated+protein+4.">Phosphatidylinositol-3-OH kinase signaling is spatially organized at endosomal compartments by microtubule-associated protein 4.</a> Nature Cell Biology. 22 (11), 1357-1370 (2020).</li><li>Guimaraes de Araujo, M. E., Fialka, I., Huber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Endocytic Organelles: Methods For Preparation And Analysis. In eLS. , (2001).</li><li>Rickwood, D., Graham, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Centrifugation Techniques. , (2015).</li><li>Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+macrophage+early+and+late+endosomes+by+latex+bead+internalization+and+density+gradient+centrifugation.">Isolation of macrophage early and late endosomes by latex bead internalization and density gradient centrifugation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (12), (2015).</li><li>Urbanska, A., Sadowski, L., Kalaidzidis, Y., Miaczynska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+APPL+endosomes:+the+role+of+annexin+A2+in+APPL+membrane+recruitment.">Biochemical characterization of APPL endosomes: the role of annexin A2 in APPL membrane recruitment.</a> Traffic. 12 (9), 1227-1241 (2011).</li></ol>

उपरोक्त प्रोटोकॉल अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन द्वारा सुसंस्कृत कोशिकाओं से रीसाइक्लिंग एंडोसोम को अलग करने की प्रक्रियाओं को रेखांकित करता है। इस विधि की विश्वसनीयता को नवीनतम प्रकाशन22द्वार?...

एंडोसोमल ट्रैफिकिंग एक आवश्यक शारीरिक प्रक्रिया है जो विभिन्न जैविक घटनाओं को फंसाती है1,उदाहरण के लिए, सिग्नलिंग रिसेप्टर्स, आयन चैनल और आसंजन अणुओं का परिवहन। प्लाज्मा झिल्ली पर स्थानीय प्रोटीन एंडोसाइटोसिस2द्वारा आंतरिक होते हैं। इसके बाद आंतरिक प्रोटीन को प्रारंभिक एंडोसोम 3 द्वारा छांटाजाताहै । कुछ प्रोटीन ों को4गिरावट के लिए लाइसोसोम्स करने का लक्ष्य रखा गया है । हालांकि, प्रोटीन की एक महत्वपूर्ण राशि तेजी से रीसाइक्लिंग और धीमी रीसाइक्लिंग प्रक्रियाओं द्वारा सेल की सतह पर वापस पुनर्नवीनीकरण कर रहे हैं । फास्ट रीसाइक्लिंग में प्रोटीन शुरुआती एंडोसोम्स को छोड़ देते हैं और सीधे प्लाज्मा झिल्ली में लौट जाते हैं। इसके विपरीत, धीमी रीसाइक्लिंग में, प्रोटीन को पहले एंडोसाइटिक रीसाइक्लिंग डिब्बे में हल किया जाता है और फिर प्लाज्मा झिल्ली में वापस ले जाया जाता है। उदाहरण के लिए, विभिन्न कार्गो प्रोटीन, क्लैथ्रिन, रेट्रोमर कॉम्प्लेक्स, कुत्ता जटिल और विस्कोट-एल्ड्रिच सिंड्रोम प्रोटीन, और निशान होमोलॉग (वॉश) परिसर, ऐसी झिल्ली रीसाइक्लिंग प्रक्रियाओं में भाग लेते हैं4,5,6,7,8,9। एंडोसाइटोसिस और रीसाइक्लिंग इवेंट का संतुलन सेल अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है और विभिन्न सेलुलर घटनाओं10में योगदान देता है, उदाहरण के लिए, सेल आसंजन, सेल माइग्रेशन, सेल पोलरिटी और सिग्नल ट्रांसडक्शन।
ARF6, एक छोटा जीटीपीए,एंडोसाइटिक ट्रैफिकिंग7,11,12का एक सूचित नियामक है। रुचि के साथ, विभिन्न शोध समूहों ने एंडोसाइटिक रीसाइक्लिंग13 , 14, 15,16,17में ARF6केमहत्व को दर्शाया है। इस अध्ययन का उद्देश्य ARF6-मध्यस्थता न्यूराइट आउटग्रोथ और एंडोसाइटिक रीसाइक्लिंग के बीच संबंधों की जांच करना है । पिछली रिपोर्ट से पता चलता है कि ARF6 की सक्रियता CYTOkinesis 1 (DOCK180) जटिल 18 के ELMO1-समर्पित पर अभिनय के माध्यम सेRac1गतिविधि के लिए अपस्ट्रीम है । हालांकि, कैसे ARF6 ELMO1-DOCK180 मध्यस्थता Rac1 संकेत से चलाता है अस्पष्ट रहता है । इस तरह की प्रक्रिया में ARF6-मध्यस्थता एंडोसाइटिक रीसाइक्लिंग की भूमिका की जांच करने के लिए घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन नियोजित किया गया था। इसका उपयोग करके, रीसाइक्लिंग एंडोसोम युक्त अंश को सेल लाइसेट्स19से प्राप्त किया गया था। अंश प्रोटीन सामग्री विश्लेषण के लिए पश्चिमी दाग के अधीन था । इम्यूनोब्लॉट परिणामों से पता चला है कि FE65 की उपस्थिति के तहत, एक मस्तिष्क समृद्ध एडाप्टर प्रोटीन, सक्रिय ARF6 ने रीसाइक्लिंग एंडोसोम युक्त अंश में ELMO1 के स्तर को काफी बढ़ा दिया। निम्नलिखित प्रोटोकॉल में स्तनधारी कोशिकाओं को स्थानांतरित करने वाली (1) के लिए प्रक्रियाएं शामिल हैं; (2) नमूने और घनत्व ढाल कॉलम तैयार करना; और (3) रीसाइक्लिंग एंडोसोम युक्त अंश प्राप्त करना।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube, 11 x 34 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>347287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm tissue culture dish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>20100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>C14277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Sample Buffer</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>MB01015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COX IV (3E11) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4850S</td>
			<td>Rabbit monoclonal antibody for detecting COX IV.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Tissue Grinder, 7 mL</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>357542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) with low glucose</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30021.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELMO1 antibody (B-7)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-271519</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody for detecting ELMO1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FE65 antibody (E-20)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-19751</td>
			<td>Goat polyclonal antibody for detecting FE65.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Research Grade</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30160.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH Monoclonal Antibody (6C5)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM4300</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody for detecting GAPDH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageLab Software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>Measurement of band intensity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-&#946;-COP antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6160</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody for detecting &#946;-COP.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myc-tag (9B11) mouse mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2276S</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody for detecting myc tagged proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniPur EDTA, Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>4010-OP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-100 XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>392050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima MAX-TL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A95761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Tablets</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosSTOP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4906845001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAB11A-Specific Polyclonal antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>20229-1-AP</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody for detecting Rab11.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>AAJ21931A4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLA-120.2 Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>362046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

density gradient ultracentrifugation for investigating endocytic recycling in mammalian cells

एंडोसोमल तस्करी एक आवश्यक सेलुलर प्रक्रिया है जो जैविक घटनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला को नियंत्रित करती है। प्रोटीन प्लाज्मा झिल्ली से आंतरिक होते हैं और फिर शुरुआती एंडोसोम्स में ले जाया जाता है। आंतरिक प्रोटीन को गिरावट के लिए लाइसोसोम में ले जाया जा सकता है या प्लाज्मा झिल्ली में वापस पुनर्नवीनीकरण किया जा सकता है। एंडोसाइटोसिस से झिल्ली सामग्री को हटाने को संतुलित करने के लिए एक मजबूत एंडोसाइटिक रीसाइक्लिंग मार्ग की आवश्यकता होती है। पाथवे को विनियमित करने के लिए विभिन्न प्रोटीन की सूचना दी जाती है, जिसमें एडीपी-रिबोसिलेशन फैक्टर 6 (ARF6) शामिल है । घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन कोशिका अंश के लिए एक शास्त्रीय विधि है। अपकेंद्रित्र के बाद, ऑर्गेनेल्स को उनकी आइसोपिक सतह पर तलछट किया जाता है। अंश एकत्र किए जाते हैं और अन्य डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए उपयोग किए जाते हैं। यहां वर्णित घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन का उपयोग करके संक्रमित स्तनधारी कोशिकाओं से रीसाइक्लिंग एंडोसोम युक्त अंश प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल है। अलग अंशों को उनके प्रोटीन सामग्री का विश्लेषण करने के लिए मानक पश्चिमी ब्लॉटिंग के अधीन किया गया था। इस विधि को नियोजित करके, हमने पहचान की कि चपेट और सेल मोटिविटी 1 (ELMO1), एक रास से संबंधित C3 बोटुलिनम टॉक्सिन सब्सट्रेट 1 (Rac1) ग्वानाइन न्यूक्लियोटाइड एक्सचेंज फैक्टर का प्लाज्मा झिल्ली लक्ष्यीकरण, ARF6-मध्यस्थता एंडोसाइटिक रीसाइक्लिंग के माध्यम से होता है।

घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन द्वारा असंक्रमित HEK293 कोशिकाओं को अलग करने के बाद, ढाल के ऊपर से शुरू 12 अंश एकत्र किए गए थे। काटे गए अंशों को 1:1 अनुपात में कमजोर पड़ने वाले बफर के साथ पतला किया गया था और दू?...

Watch this Scientific Journal Video about Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells at JoVE.com

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

इस पेपर का उद्देश्य सुक्रोज घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन का उपयोग करके स्तनधारी कोशिकाओं से रीसाइक्लिंग एंडोसोम तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करना है।

स्तनधारी कोशिकाओं में एंडोसाइटिक रीसाइक्लिंग की जांच के लिए घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

यह प्रोटोकॉल एंडोसाइटिक तस्करी के माध्यम से प्रोटीन तस्करी की जांच को सुगम बनाने के लिए संक्रमित स्तनधारी कोशिकाओं से अंश वाले रीसाइक्लिंग एंडोसोम को अलग करने में मदद करता है । इस तकनीक को संभालना आसान है और ऊतक और सेल नमूनों दोनों पर लागू होता है। प्रक्रिया का प्रदर्शन मिस Zhai यू क्यूई, डॉ लाओ प्रयोगशाला से पीएचडी के छात्र होगा ।शुरू करने के लिए, प्लेट 2 बार 100 मिलीमीटर संस्कृति पकवान में 6 कोशिकाओं को। अगले दिन, निर्माता के निर्देशों के अनुसार लिपोफोक्टामाइन के साथ कोशिकाओं को स्थानांतरित करें। कोशिकाओं को फसल करने के लिए, संस्कृति माध्यम को 48 घंटे के बाद ट्रांसफैक्शन त्यागें और कोशिकाओं को बर्फ ठंडे पीबीएस के साथ दो बार धोएं।फिर प्रत्येक डिश में 0.5X फॉस्फेट अवरोधक कॉकटेल में 0.5X प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल के साथ पूरक बर्फ ठंड पीबीएस का एक मिलीलीटर जोड़ें। इसके बाद, सेल स्क्रैपर का उपयोग करके, कोशिकाओं को इकट्ठा करें और सेल निलंबन को 15 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें। झूले बाल्टी रोटर का उपयोग करके अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाएं।सुपरनेट को त्यागें और सेल पेलेट को धीरे-धीरे समरूपता बफर के पांच मिलीलीटर में फिर से रखें। कोशिकाओं को फिर से अपकेंद्रित्र द्वारा एकत्र करें और होमोजेनाइजेशन बफर के एक मिलीलीटर में सेल पेलेट को फिर से रीसल्पेंड करें। 15 से 20 स्ट्रोक का उपयोग करके एक Dounce होमोजेनाइजर के साथ कोशिकाओं को समरूप।फिर होमोगोनेट को दो मिलीलीटर सेंट्रलाइजिंग ट्यूब में स्थानांतरित करें। होमोगोनेट में समरूपता बफर के 700 माइक्रोलीटर जोड़ें। फिर पतला होमोगोनेट स्पिन करें और सुपरनेट के 1.5 मिलीलीटर एकत्र करें।एकत्र किए गए सुपरनैट को फिर से स्पिन करें, फिर सुपरनेट के 1.4 मिलीलीटर एकत्र करें और इसे पोस्ट-न्यूक्लियर सुपरनैंट के रूप में लेबल करें। घनत्व ढाल कॉलम तैयार करने के लिए, एक अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूब के लिए परमाणु सुपरनेट के बाद के १.२ मिलीलीटर स्थानांतरित करें । फिर नमूने में 62% सुक्रोज समाधान का एक मिलीलीटर जोड़ें और कोमल पिपटिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।इसके बाद, ध्यान से नमूने के शीर्ष पर 35% सुक्रोज समाधान के 3.3 मिलीलीटर जोड़ें, इसके बाद 35% सुक्रोज समाधान के शीर्ष पर 25% सुक्रोज समाधान के 2.2 मिलीलीटर हैं। अंत में, अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूब को समरूपता बफर के साथ शीर्ष पर भरें। घनत्व ढाल स्तंभ को अपकेंद्रित्र करें और ग्रेडिएंट के ऊपर से शुरू करते हुए 1 मिलीलीटर प्रत्येक के 12 अंशों को सावधानीपूर्वक एकत्र करें।इसके बाद, कमजोर बफर के एक मिलीलीटर के साथ सभी अंशों को पतला करें और पतला नमूनों को अपकेंद्रित्र करें। अपकेंद्रित्र के बाद, सुपरनेट को एस्पिरेट करें और अंशों को फसल करने के लिए 1X नमूना बफर के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें। रिसाइकिलिंग एंडोसोम मार्कर Rab11 अंश सात में पाया गया था ।बीटा सीओपी, कॉक्स चतुर्थ, गपध, ईईए1, आरएबी 7 और लैंप1 सहित अन्य उपकोशिकीय मार्कर की भी जांच की गई । अंश सात में एक सकारात्मक EEA1 संकेत भी पाया गया था । गैपध, कॉक्स चतुर्थ, और Rab11 दोनों अंश सात और परमाणु के बाद सुपरनाटेंट में मापा बैंड तीव्रता यहां दिखाया गया है ।ELMO1, ELMO1 ARF6Q67L, या ELMO1 ARF6Q67L FE65 के साथ HEC293 कोशिकाओं को पार करने के बाद, ARF6Q67L और FE65 अतिउपत्ति के साथ ELMO1 वितरण में कोई परिवर्तन नहीं पाया गया । अंश सात में ELMO1 स्तर की तुलना विभिन्न ट्रांसफैक्शन के बीच की गई थी और ARF6Q67L के सहसंचरण के बाद ऊंचा पाया गया था। एक और वृद्धि तब देखी गई जब ARF6Q67L और FE65 दोनों को सह-व्यक्त किया गया ।इसके विपरीत, बाहर दस्तक FE65 अंश सात में ARF6 मध्यस्थता Elmo1 संवर्धन कम । प्राप्त अंश का उपयोग बाद के विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, अंश में प्रोटीन स्तर में परिवर्तन की कल्पना करने के लिए पश्चिमी ब्लॉटिंग।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

गैर-कोडिंग लघु शाही सेना मात्रा के लिए उच्च घनत्व लिपो प्रोटीन का अलगाव

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Cryomilled स्तनधारी कोशिकाओं से प्रोटीन जटिल संबंध कब्जा

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

स्तनधारी mRNAs पर अनुवाद दीक्षा परिसर गठन का Toeprinting विश्लेषण

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

अपव्यय Microgravimetry फॉस्फोलिपिड बाइंडिंग प्रोटीन की बाइंडिंग गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए Annexin A2 करने के लिए ठोस-समर्थित लिपिड Bilayers एक क्वार्ट्ज प्रतिध्वनि का उपयोग

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

संपोषित कोशिकाओं में प्रकार्यीकृत नैनोबॉडीज का उपयोग करते हुए ट्रांस-गोल्गी नेटवर्क में एन्डोसिटिक के उत्थान और प्रतिगामी परिवहन का विश्लेषण

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

परमाणु अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी स्तनधारी कोशिकाओं में Intracellular जस्ता पूल को मापने के लिए

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation

अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन द्वारा प्लाज्मा लिपोप्रोटीन का अलगाव और विश्लेषण

Analysis of plasma lipoproteins and apolipoproteins is an essential part for the diagnosis of dyslipidemia and studies of lipid metabolism and ...

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

आइसोपिनिक घनत्व ढाल शुद्धिकरण द्वारा यू 937 कोशिकाओं का सेल फ्रैक्शनेशन

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

ग्रेडिएंट मेकर्स या फ्रैक्शनेशन सिस्टम के बिना पॉलीसोम प्रोफाइलिंग

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

Efficient and Scalable Production of Full-length Human Huntingtin Variants in Mammalian Cells using a Transient Expression System

Full-length huntingtin (FL HTT) is a large (aa 1-3,144), ubiquitously expressed, polyglutamine (polyQ)-containing protein with a mass of approximately 350 ...