Name: density gradient ultracentrifugation for investigating endocytic recycling in mammalian cells
Uploaded: 2021-06-30T13:15:00
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この研究は、研究助成金評議会香港、CUHK直接助成金制度、ユナイテッド・カレッジ・エンダウメント・ファンド、TUYF慈善信託からの資金によって支えられました。この研究の数字は、2020年10月にFASEBジャーナルに掲載された「ARF6-Rac1シグナル伝達性神経突起伸長は、ARF6とELMO1のオーケストレーションを通じてニューロンアダプタFE65によって増強される」と述べた。

哺乳類細胞培養とトランスフェクション
<ol><li>100mm培養皿に2 x106 細胞をプレート。トランスフェクションごとに4つの料理を使用してください。 注: 必要なセルの数は、セルの行によって異なる場合があります。分離の手順に進む前に最適化が必要な場合があります。</li>
	<li>翌日, メーカーの指示に従ってリポフェクタミンで細胞をトランスフェクト.</li>
</ol>2. 細...

<ol>
	<li>Elkin, S. R., Lakoduk, A. M., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+pathways+and+endosomal+trafficking:+a+primer.">Endocytic pathways and endosomal trafficking: a primer.</a> Wiener Medizinische Wochenschrift. 166 (7-8), 196-204 (2016).</li><li>Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+unplugged:+multiple+ways+to+enter+the+cell.">Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell.</a> Cell Research. 20 (3), 256-275 (2010).</li><li>Naslavsky, N., Caplan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enigmatic+endosome+-+sorting+the+ins+and+outs+of+endocytic+trafficking.">The enigmatic endosome - sorting the ins and outs of endocytic trafficking.</a> Journal of Cell Science. 131 (13), (2018).</li><li>Cullen, P. J., Steinberg, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+degrade+or+not+to+degrade:+mechanisms+and+significance+of+endocytic+recycling.">To degrade or not to degrade: mechanisms and significance of endocytic recycling.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 679-696 (2018).</li><li>Weeratunga, S., Paul, B., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognising+the+signals+for+endosomal+trafficking.">Recognising the signals for endosomal trafficking.</a> Current Opinion in Cell Biology. 65, 17-27 (2020).</li><li>Khan, I., Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis:+a+pivotal+pathway+for+regulating+metastasis.">Endocytosis: a pivotal pathway for regulating metastasis.</a> British Journal of Cancer. 124 (1), 66-75 (2021).</li><li>Grant, B. D., Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+and+mechanisms+of+endocytic+recycling.">Pathways and mechanisms of endocytic recycling.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).</li><li>Maxfield, F. R., McGraw, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+recycling.">Endocytic recycling.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (2), 121-132 (2004).</li><li>McDonald, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explosion+in+the+complexity+of+membrane+protein+recycling.">Explosion in the complexity of membrane protein recycling.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (4), 483-494 (2021).</li><li>O'Sullivan, M. J., Lindsay, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Endosomal+Recycling+pathway-at+the+crossroads+of+the+cell.">The Endosomal Recycling pathway-at the crossroads of the cell.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6074 (2020).</li><li>D'Souza-Schorey, C., Li, G., Colombo, M. I., Stahl, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+role+for+ARF6+in+receptor-mediated+endocytosis.">A regulatory role for ARF6 in receptor-mediated endocytosis.</a> Science. 267 (5201), 1175-1178 (1995).</li><li>Schweitzer, J. K., Sedgwick, A. E., D'Souza-Schorey, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARF6-mediated+endocytic+recycling+impacts+cell+movement,+cell+division+and+lipid+homeostasis.">ARF6-mediated endocytic recycling impacts cell movement, cell division and lipid homeostasis.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 22 (1), 39-47 (2011).</li><li>Finicle, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipids+inhibit+endosomal+recycling+of+nutrient+transporters+by+inactivating+ARF6.">Sphingolipids inhibit endosomal recycling of nutrient transporters by inactivating ARF6.</a> Journal of Cell Science. 131 (12), (2018).</li><li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APE1+upregulates+MMP-14+via+redox-sensitive+ARF6-mediated+recycling+to+promote+cell+invasion+of+esophageal+adenocarcinoma.">APE1 upregulates MMP-14 via redox-sensitive ARF6-mediated recycling to promote cell invasion of esophageal adenocarcinoma.</a> Cancer Research. 79 (17), 4426-4438 (2019).</li><li>Qi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arf6-driven+endocytic+recycling+of+CD147+determines+HCC+malignant+phenotypes.">Arf6-driven endocytic recycling of CD147 determines HCC malignant phenotypes.</a> Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 38 (1), 471 (2019).</li><li>Crupi, M. J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GGA3-mediated+recycling+of+the+RET+receptor+tyrosine+kinase+contributes+to+cell+migration+and+invasion.">GGA3-mediated recycling of the RET receptor tyrosine kinase contributes to cell migration and invasion.</a> Oncogene. 39 (6), 1361-1377 (2020).</li><li>Gamara, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Arf6+deletion+in+PLB-985+differentiated+in+neutrophil-like+cells+and+in+mouse+neutrophils:+impact+on+adhesion+and+migration.">Assessment of Arf6 deletion in PLB-985 differentiated in neutrophil-like cells and in mouse neutrophils: impact on adhesion and migration.</a> Mediators of Inflammation. 2020, 2713074 (2020).</li><li>Santy, L. C., Ravichandran, K. S., Casanova, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DOCK180/Elmo+complex+couples+ARNO-mediated+Arf6+activation+to+the+downstream+activation+of+Rac1.">The DOCK180/Elmo complex couples ARNO-mediated Arf6 activation to the downstream activation of Rac1.</a> Current Biology. 15 (19), 1749-1754 (2005).</li><li>Wibo, M., Dumont, J. E., Brown, B. L., Marshall, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fractionation+by+centrifugation+methods.">Cell fractionation by centrifugation methods.</a> Eukaryotic Cell Function and Growth: Regulation by Intracellular Cyclic Nucleotides. , 1-17 (1976).</li><li>Kelly, E. E., Horgan, C. P., McCaffrey, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab11+proteins+in+health+and+disease.">Rab11 proteins in health and disease.</a> Biochemical Society Transactions. 40 (6), 1360-1367 (2012).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+adaptor+FE65+stimulates+Rac1-mediated+neurite+outgrowth+by+recruiting+and+activating+ELMO1.">Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).</li><li>Chan, W. W. R., Li, W., Chang, R. C. C., Lau, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARF6-Rac1+signaling-mediated+neurite+outgrowth+is+potentiated+by+the+neuronal+adaptor+FE65+through+orchestrating+ARF6+and+ELMO1.">ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (12), 16397-16413 (2020).</li><li>Huber, L. A., Pfaller, K., Vietor, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+proteomics:+implications+for+subcellular+fractionation+in+proteomics.">Organelle proteomics: implications for subcellular fractionation in proteomics.</a> Circulation Research. 92 (9), 962-968 (2003).</li><li>Fleischer, S., Kervina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+fractionation+of+rat+liver.">Subcellular fractionation of rat liver.</a> Methods in Enzymology. 31, 6-41 (1974).</li><li>Marsh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosome+and+lysosome+purification+by+free-flow+electrophoresis.">Endosome and lysosome purification by free-flow electrophoresis.</a> Methods in Cell Biology. 31, 319-334 (1989).</li><li>Stasyk, T., Huber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zooming+in:+fractionation+strategies+in+proteomics.">Zooming in: fractionation strategies in proteomics.</a> Proteomics. 4 (12), 3704-3716 (2004).</li><li>Iordachescu, A., Hulley, P., Grover, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+collection+of+nanoscopic+vesicles+from+an+organotypic+culture+model.">A novel method for the collection of nanoscopic vesicles from an organotypic culture model.</a> RSC Advances. 8 (14), 7622-7632 (2018).</li><li>Chavrier, P., vander Sluijs, P., Mishal, Z., Nagelkerken, B., Gorvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+endosome+membrane+dynamics+characterized+by+flow+cytometry.">Early endosome membrane dynamics characterized by flow cytometry.</a> Cytometry. 29 (1), 41-49 (1997).</li><li>Chasan, A. I., Beyer, M., Kurts, C., Burgdorf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+specialized,+antigen-loaded+early+endosomal+subpopulation+by+flow+cytometry.">Isolation of a specialized, antigen-loaded early endosomal subpopulation by flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 960, 379-388 (2013).</li><li>Thapa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol-3-OH+kinase+signaling+is+spatially+organized+at+endosomal+compartments+by+microtubule-associated+protein+4.">Phosphatidylinositol-3-OH kinase signaling is spatially organized at endosomal compartments by microtubule-associated protein 4.</a> Nature Cell Biology. 22 (11), 1357-1370 (2020).</li><li>Guimaraes de Araujo, M. E., Fialka, I., Huber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Endocytic Organelles: Methods For Preparation And Analysis. In eLS. , (2001).</li><li>Rickwood, D., Graham, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Centrifugation Techniques. , (2015).</li><li>Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+macrophage+early+and+late+endosomes+by+latex+bead+internalization+and+density+gradient+centrifugation.">Isolation of macrophage early and late endosomes by latex bead internalization and density gradient centrifugation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (12), (2015).</li><li>Urbanska, A., Sadowski, L., Kalaidzidis, Y., Miaczynska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+APPL+endosomes:+the+role+of+annexin+A2+in+APPL+membrane+recruitment.">Biochemical characterization of APPL endosomes: the role of annexin A2 in APPL membrane recruitment.</a> Traffic. 12 (9), 1227-1241 (2011).</li></ol>

上記のプロトコルは、超遠心分離によって培養細胞から培養された細胞から循環性の内生体を単離するための手順を概説する。この方法の信頼性は最新の刊行22によって実証されており、リサイクル用のエンドーソームがゴルジ装置やミトコンドリアなどの他のオルガネラ(図1)から正常に分離されていることを証明している。いくつかの重要なステッ?...

内経性の人身売買は、様々な生物学的事象1、例えば、シグナル伝達受容体、イオンチャネル、および接着分子の輸送を含む必須の生理学的プロセスである。血漿膜に局在するタンパク質は、エンドサイトーシス2によって内在化される。その後、内部化されたタンパク質は初期の内期3によってソートされる。タンパク質の一部は分解のためにリソソームを標的としている。しかし、大量のタンパク質は、高速リサイクルと低速リサイクルプロセスによって細胞表面にリサイクルされます。高速リサイクルでは、タンパク質は初期の子宮体を離れ、原形質膜に直接戻ります。逆に、遅いリサイクルでは、タンパク質はまずエンドサイトリサイクルコンパートメントに分類され、次に形質膜に戻されます。種々のカーゴタンパク質は、例えば、クラトリン、レトロマー複合体、レトリバー複合体及びウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質、及びSCARホモローグ(WASH)複合体、4、5、6、7、8、9等の膜リサイクルプロセスに関与する。エンドサイトーシスとリサイクルイベントのバランスは、細胞の生存に不可欠であり、例えば、細胞接着、細胞移動、細胞極性、およびシグナル伝達などの様々な細胞事象10に寄与する。
ARF6は、小さなGTPaseで、内視鏡7、11、12の報告されたレギュレータです。関心のある研究グループは、内視鏡リサイクルにおけるARF6の重要性を図示しています13,14,15,16, 17.この研究は、ARF6媒介性神経突起成長とエンドサイトリサイクルとの関係を調査することを目的としている。前の報告は、ARF6の活性化がサイトカネシス1(DOCK180)複合体18のELMO1-ディディケーターに作用してRac1活性に上流であることを示唆している。しかし、ARF6がどのようにELMO1-DOCK180仲介Rac1シグナリングを引き起こすかは不明です。このような過程におけるARF6媒介型エントサイトリサイクルの役割を調査するために、密度勾配超遠心分離が採用された。それを用いることによって、細胞ライセート19から循環性のendosome含有分率が得られた。分画を、タンパク質含量分析用のウェスタンブロッティングを行った。免疫ブロットの結果は、脳に富んだアダプタータンパク質であるFE65の存在下で、活性ARF6が、エンドーソーム含有分率のリサイクルにおけるELMO1のレベルを実質的に増加させたことを明らかにした。以下のプロトコルには、(1)哺乳類細胞をトランスフェクトするための手順が含まれています。(2) サンプルと密度勾配列の準備(3)循環性のendosome含有分率を得る。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube, 11 x 34 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>347287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm tissue culture dish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>20100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>C14277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Sample Buffer</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>MB01015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COX IV (3E11) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4850S</td>
			<td>Rabbit monoclonal antibody for detecting COX IV.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Tissue Grinder, 7 mL</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>357542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) with low glucose</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30021.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELMO1 antibody (B-7)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-271519</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody for detecting ELMO1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FE65 antibody (E-20)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-19751</td>
			<td>Goat polyclonal antibody for detecting FE65.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Research Grade</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30160.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH Monoclonal Antibody (6C5)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM4300</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody for detecting GAPDH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageLab Software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>Measurement of band intensity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-&#946;-COP antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6160</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody for detecting &#946;-COP.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myc-tag (9B11) mouse mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2276S</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody for detecting myc tagged proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniPur EDTA, Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>4010-OP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-100 XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>392050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima MAX-TL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A95761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Tablets</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosSTOP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4906845001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAB11A-Specific Polyclonal antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>20229-1-AP</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody for detecting Rab11.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>AAJ21931A4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLA-120.2 Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>362046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

density gradient ultracentrifugation for investigating endocytic recycling in mammalian cells

内皮の人身売買は、生物学的事象の広い範囲を調節する不可欠な細胞プロセスです。タンパク質は、原形質膜から内在化し、初期の子宮間体に輸送されます。インターロナイズされたタンパク質は、分解のためにリソソームに通過したり、細胞膜にリサイクルすることができます。エンドサイトーシスからの膜材料の除去のバランスをとるためには、堅牢なエンドサイト循環型の循環経路が必要です。ADP-リボシル化因子6(ARF6)を含む様々なタンパク質が経路を調節すると報告されている。密度勾配超遠心分離は、細胞分画の古典的な方法である。遠心分離後、オルガネラはイソピクセンの表面で沈み込む。分数は収集され、他のダウンストリーム・アプリケーションに使用されます。ここで説明するプロトコルは、密度勾配超遠心分離を用いて、トランスフェクションされた哺乳動物細胞からendosome含有分率をリサイクルして得るプロトコルである。単離された分画を、それらのタンパク質内容物を分析するための標準的なウエスタンブロッティングを行った。この方法を用いることで、Ras関連C3ボツリヌス毒素基質1(Rac1)グアニンヌクレオチド交換因子である巻込みおよび細胞運動性1(ELMO1)の細胞膜ターゲティングが、ARF6媒介性エンドサイトリサイクルを介してであることを同定した。

非トランスフェクトされたHEK293細胞を密度勾配超遠心分離により分画した後、勾配の上から12個の画分を採取した。収穫された分率を希釈し、希釈バッファーを1:1比で希釈し、第2回遠心分離を行った。その後、サンプルを、タンパク質の内容物を分析するためのウェスタンブロットを行った。 図1に示すように、循環型の気になるマーカーRab11が分画720...

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Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

本論文は、ショ糖密度勾配超遠心化を用いて哺乳動物細胞からの子宮体をリサイクルする方法を提示することを目的とする。

哺乳類細胞におけるエンドサイトリサイクルを調べた密度勾配超遠心分離

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

このプロトコルは、感染した哺乳類細胞からの分画を含むリサイクルエンドソームを分離し、エンドサイト人身売買によるタンパク質の密売の調査を容易にするのに役立ちます。この技術は扱いやすく、組織および細胞サンプルの両方に適用可能である。この手順のデモンストレーションは、ラオス博士の研究室の博士課程の学生、ミス・ザイ・ユー・チーです。まず、100ミリメートル培養皿中の6細胞に2回10を10回プレートする。翌日, メーカーの指示に従ってリポフェクタミンで細胞をトランスフェクト.細胞を収穫するために、培養後48時間培養液を廃棄し、氷冷PBSで細胞を2回洗浄する。その後、各皿に0.5Xホスファターゼ阻害剤カクテルで0.5Xプロテアーゼ阻害剤カクテルを補った氷冷PBSの1ミリリットルを追加します。次に、細胞スクレーパーを用いて、細胞を回収し、細胞懸濁液を15ミリリットル遠心管に移す。スイングバケットローターを用いた遠心分離による細胞。上清を捨て、細胞ペレットを5ミリリットルの均質化バッファーに穏やかに再懸濁します。遠心分離によって細胞を再び収集し、均質化バッファーの1ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁します。15~20ストロークを使用して、Dounceホモジナイザーで細胞を均質化します。次にホモゴネートを2ミリリットル遠心チューブに移します。ホモゴネートに700マイクロリットルの均質化バッファーを加えます。その後、希釈したホモゴネートを回転させ、上清の1.5ミリリットルを集める。収集した上清を再び回転させ、1.4ミリリットルの上清を集め、核後上清としてラベルを付けます。密度勾配カラムを作成するには、核後上清の1.2ミリリットルを超遠心チューブに移します。その後、サンプルに62%スクロース溶液の1ミリリットルを追加し、穏やかなピペットによってよく混ぜます。次に、サンプルの上に35%スクロース溶液の3.3ミリリットルを慎重に加え、35%スクロース溶液の上に2.2ミリリットルの25%スクロース溶液を加えます。最後に、超遠心チューブを均質化バッファーで上部に充填します。密度勾配列を遠心分離し、勾配の上から始めて、それぞれ12分の1ミリリットルを慎重に収集します。次に、希釈バッファーの1ミリリットルですべての分画を希釈し、希釈したサンプルを遠心分離します。遠心分離後、上清を吸引し、50マイクロリットルの1Xサンプルバッファーを加えて分画を収穫する。リサイクル内粉マーカーRab11は、フラクション7で検出された。他の細胞下マーカーは、ベータCOP、COX IV、GAPDH、EEA1、ラブ7、およびLamp1を含む、また、プローブされた。正のEEA1シグナルもFraction 7で検出されました。クオーター7とポスト核上清の両方でGAPDH、コックスIV、およびRab11の測定されたバンド強度をここに示します。ELMO1、ELMO1 ARF6Q67L、またはELMO1 ARF6Q67L FE65のいずれかを有するHEC293細胞を転移した後、ARF6Q67LおよびFE65過剰発現を有するELMO1分布に変化は見つからなかった。フラクション7のELMO1レベルを異なるトランスフェクション間で比較し、ARF6Q67Lのコトランスフェクション後に上昇することが判明した。ARF6Q67LとFE65の両方が共発現した場合、さらなる増加が認められた。逆に、FE65をノックアウトすると、ARF6仲介Elmo1エンリッチメントが分数7で減少しました。得られた分数は、その後の分析に使用することができます。例えば、分画中のタンパク質レベル変化を可視化するウェスタンブロッティング。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

非コード小型RNA定量化のための高密度リポタンパク質の単離

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Cryomilled哺乳動物細胞からのタンパク質複合体の親和性のキャプチャ

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

哺乳類の Mrna の翻訳開始複合体形成の Toeprinting 分析

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

散逸の Microgravimetry 結合タンパク質アネキシン A2 への水晶振動子を用いた固相担脂質膜リン脂質の結合動態を研究するには

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

取り込みと培養細胞における機能性 Nanobodies を用いたトランスゴルジ ネットワークへの逆行性輸送の解析

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

哺乳類細胞内の細胞内亜鉛プールを測定するための原子吸光度分光法

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation

超遠心分離による血漿リポタンパク質の単離と分析

Analysis of plasma lipoproteins and apolipoproteins is an essential part for the diagnosis of dyslipidemia and studies of lipid metabolism and ...

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

等密度勾配精製によるU937細胞の細胞分画

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

グラジエントメーカーまたは分画システムを使用しないポリソームプロファイリング

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

Efficient and Scalable Production of Full-length Human Huntingtin Variants in Mammalian Cells using a Transient Expression System

Full-length huntingtin (FL HTT) is a large (aa 1-3,144), ubiquitously expressed, polyglutamine (polyQ)-containing protein with a mass of approximately 350 ...