Name: density gradient ultracentrifugation for investigating endocytic recycling in mammalian cells
Uploaded: 2021-06-30T13:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av midler fra Research Grants Council Hong Kong, CUHK direkte tilskuddsordning, United College legatfond og TUYF Charitable Trust. Tallene i dette arbeidet ble tilpasset fra vår forrige publikasjon, "ARF6-Rac1 signalmediert nevrittutvekst forsterkes av nevronadapteren FE65 gjennom orkestrering av ARF6 og ELMO1" publisert i FASEB Journal i oktober 2020.

1. Pattedyr cellekultur og transfeksjon
<ol><li>Plate 2 x 106 celler i en 100 mm kulturrett. Bruk fire retter for hver transfeksjon. MERK: Antall celler som kreves, kan variere for forskjellige cellelinjer. Optimalisering kan være nødvendig før du går videre til isolasjonstrinnet.</li>
	<li>Neste dag, transfekt cellene med Lipofectamine i henhold til produsentens instruksjoner.</li>
</ol>2. Cellehøst
<ol><li>Kast kulturmediet 48 timer etter transfeksjon.</li>
	<li>Vask celle...

<ol>
	<li>Elkin, S. R., Lakoduk, A. M., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+pathways+and+endosomal+trafficking:+a+primer.">Endocytic pathways and endosomal trafficking: a primer.</a> Wiener Medizinische Wochenschrift. 166 (7-8), 196-204 (2016).</li><li>Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+unplugged:+multiple+ways+to+enter+the+cell.">Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell.</a> Cell Research. 20 (3), 256-275 (2010).</li><li>Naslavsky, N., Caplan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enigmatic+endosome+-+sorting+the+ins+and+outs+of+endocytic+trafficking.">The enigmatic endosome - sorting the ins and outs of endocytic trafficking.</a> Journal of Cell Science. 131 (13), (2018).</li><li>Cullen, P. J., Steinberg, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+degrade+or+not+to+degrade:+mechanisms+and+significance+of+endocytic+recycling.">To degrade or not to degrade: mechanisms and significance of endocytic recycling.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 679-696 (2018).</li><li>Weeratunga, S., Paul, B., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognising+the+signals+for+endosomal+trafficking.">Recognising the signals for endosomal trafficking.</a> Current Opinion in Cell Biology. 65, 17-27 (2020).</li><li>Khan, I., Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis:+a+pivotal+pathway+for+regulating+metastasis.">Endocytosis: a pivotal pathway for regulating metastasis.</a> British Journal of Cancer. 124 (1), 66-75 (2021).</li><li>Grant, B. D., Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+and+mechanisms+of+endocytic+recycling.">Pathways and mechanisms of endocytic recycling.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).</li><li>Maxfield, F. R., McGraw, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+recycling.">Endocytic recycling.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (2), 121-132 (2004).</li><li>McDonald, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explosion+in+the+complexity+of+membrane+protein+recycling.">Explosion in the complexity of membrane protein recycling.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (4), 483-494 (2021).</li><li>O'Sullivan, M. J., Lindsay, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Endosomal+Recycling+pathway-at+the+crossroads+of+the+cell.">The Endosomal Recycling pathway-at the crossroads of the cell.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6074 (2020).</li><li>D'Souza-Schorey, C., Li, G., Colombo, M. I., Stahl, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+role+for+ARF6+in+receptor-mediated+endocytosis.">A regulatory role for ARF6 in receptor-mediated endocytosis.</a> Science. 267 (5201), 1175-1178 (1995).</li><li>Schweitzer, J. K., Sedgwick, A. E., D'Souza-Schorey, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARF6-mediated+endocytic+recycling+impacts+cell+movement,+cell+division+and+lipid+homeostasis.">ARF6-mediated endocytic recycling impacts cell movement, cell division and lipid homeostasis.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 22 (1), 39-47 (2011).</li><li>Finicle, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipids+inhibit+endosomal+recycling+of+nutrient+transporters+by+inactivating+ARF6.">Sphingolipids inhibit endosomal recycling of nutrient transporters by inactivating ARF6.</a> Journal of Cell Science. 131 (12), (2018).</li><li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APE1+upregulates+MMP-14+via+redox-sensitive+ARF6-mediated+recycling+to+promote+cell+invasion+of+esophageal+adenocarcinoma.">APE1 upregulates MMP-14 via redox-sensitive ARF6-mediated recycling to promote cell invasion of esophageal adenocarcinoma.</a> Cancer Research. 79 (17), 4426-4438 (2019).</li><li>Qi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arf6-driven+endocytic+recycling+of+CD147+determines+HCC+malignant+phenotypes.">Arf6-driven endocytic recycling of CD147 determines HCC malignant phenotypes.</a> Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 38 (1), 471 (2019).</li><li>Crupi, M. J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GGA3-mediated+recycling+of+the+RET+receptor+tyrosine+kinase+contributes+to+cell+migration+and+invasion.">GGA3-mediated recycling of the RET receptor tyrosine kinase contributes to cell migration and invasion.</a> Oncogene. 39 (6), 1361-1377 (2020).</li><li>Gamara, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Arf6+deletion+in+PLB-985+differentiated+in+neutrophil-like+cells+and+in+mouse+neutrophils:+impact+on+adhesion+and+migration.">Assessment of Arf6 deletion in PLB-985 differentiated in neutrophil-like cells and in mouse neutrophils: impact on adhesion and migration.</a> Mediators of Inflammation. 2020, 2713074 (2020).</li><li>Santy, L. C., Ravichandran, K. S., Casanova, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DOCK180/Elmo+complex+couples+ARNO-mediated+Arf6+activation+to+the+downstream+activation+of+Rac1.">The DOCK180/Elmo complex couples ARNO-mediated Arf6 activation to the downstream activation of Rac1.</a> Current Biology. 15 (19), 1749-1754 (2005).</li><li>Wibo, M., Dumont, J. E., Brown, B. L., Marshall, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fractionation+by+centrifugation+methods.">Cell fractionation by centrifugation methods.</a> Eukaryotic Cell Function and Growth: Regulation by Intracellular Cyclic Nucleotides. , 1-17 (1976).</li><li>Kelly, E. E., Horgan, C. P., McCaffrey, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab11+proteins+in+health+and+disease.">Rab11 proteins in health and disease.</a> Biochemical Society Transactions. 40 (6), 1360-1367 (2012).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+adaptor+FE65+stimulates+Rac1-mediated+neurite+outgrowth+by+recruiting+and+activating+ELMO1.">Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).</li><li>Chan, W. W. R., Li, W., Chang, R. C. C., Lau, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARF6-Rac1+signaling-mediated+neurite+outgrowth+is+potentiated+by+the+neuronal+adaptor+FE65+through+orchestrating+ARF6+and+ELMO1.">ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (12), 16397-16413 (2020).</li><li>Huber, L. A., Pfaller, K., Vietor, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+proteomics:+implications+for+subcellular+fractionation+in+proteomics.">Organelle proteomics: implications for subcellular fractionation in proteomics.</a> Circulation Research. 92 (9), 962-968 (2003).</li><li>Fleischer, S., Kervina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+fractionation+of+rat+liver.">Subcellular fractionation of rat liver.</a> Methods in Enzymology. 31, 6-41 (1974).</li><li>Marsh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosome+and+lysosome+purification+by+free-flow+electrophoresis.">Endosome and lysosome purification by free-flow electrophoresis.</a> Methods in Cell Biology. 31, 319-334 (1989).</li><li>Stasyk, T., Huber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zooming+in:+fractionation+strategies+in+proteomics.">Zooming in: fractionation strategies in proteomics.</a> Proteomics. 4 (12), 3704-3716 (2004).</li><li>Iordachescu, A., Hulley, P., Grover, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+collection+of+nanoscopic+vesicles+from+an+organotypic+culture+model.">A novel method for the collection of nanoscopic vesicles from an organotypic culture model.</a> RSC Advances. 8 (14), 7622-7632 (2018).</li><li>Chavrier, P., vander Sluijs, P., Mishal, Z., Nagelkerken, B., Gorvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+endosome+membrane+dynamics+characterized+by+flow+cytometry.">Early endosome membrane dynamics characterized by flow cytometry.</a> Cytometry. 29 (1), 41-49 (1997).</li><li>Chasan, A. I., Beyer, M., Kurts, C., Burgdorf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+specialized,+antigen-loaded+early+endosomal+subpopulation+by+flow+cytometry.">Isolation of a specialized, antigen-loaded early endosomal subpopulation by flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 960, 379-388 (2013).</li><li>Thapa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol-3-OH+kinase+signaling+is+spatially+organized+at+endosomal+compartments+by+microtubule-associated+protein+4.">Phosphatidylinositol-3-OH kinase signaling is spatially organized at endosomal compartments by microtubule-associated protein 4.</a> Nature Cell Biology. 22 (11), 1357-1370 (2020).</li><li>Guimaraes de Araujo, M. E., Fialka, I., Huber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Endocytic Organelles: Methods For Preparation And Analysis. In eLS. , (2001).</li><li>Rickwood, D., Graham, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Centrifugation Techniques. , (2015).</li><li>Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+macrophage+early+and+late+endosomes+by+latex+bead+internalization+and+density+gradient+centrifugation.">Isolation of macrophage early and late endosomes by latex bead internalization and density gradient centrifugation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (12), (2015).</li><li>Urbanska, A., Sadowski, L., Kalaidzidis, Y., Miaczynska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+APPL+endosomes:+the+role+of+annexin+A2+in+APPL+membrane+recruitment.">Biochemical characterization of APPL endosomes: the role of annexin A2 in APPL membrane recruitment.</a> Traffic. 12 (9), 1227-1241 (2011).</li></ol>

Ovennevnte protokoll skisserer prosedyrene for å isolere resirkuleringsdosomer fra dyrkede celler ved ultracentrifugation. Påliteligheten til denne metoden har blitt demonstrert av den nyeste publikasjonen22, som viser at resirkulering av endosomer er vellykket isolert fra andre organeller (figur 1), for eksempel Golgi-apparatet og mitokondrier. Noen kritiske trinn må tas hensyn til for å oppnå et godt separasjonsresultat. Mens du forbereder sukroseløsningene, a...

Endosomal trafficking er en viktig fysiologisk prosess som impliserer ulike biologiske hendelser1, for eksempel transport av signalreseptorer, ionkanaler og vedheftsmolekyler. Proteiner lokalisert ved plasmamembranen internaliseres ved endokytose2. De internaliserte proteinene sorteres deretter etter tidlig endosom3. Noen av proteinene er rettet mot lysosomer for nedbrytning4. Imidlertid resirkuleres en betydelig mengde proteiner tilbake til celleoverflaten ved rask resirkulering og langsomme resirkuleringsprosesser. Ved rask resirkulering forlater proteiner de tidlige endosomene og går direkte tilbake til plasmamembranen. Omvendt, i langsom resirkulering, blir proteiner først sortert til det endokytiske resirkuleringsrommet og deretter transportert tilbake til plasmamembranen. Ulike lastproteiner, for eksempel klarin, retromerkompleks, retrieverkompleks og Wiskott-Aldrich syndromprotein og SCAR Homologue (WASH) -kompleks, deltar i slike membrangjenvinningsprosesser4,5,6,7,8,9. Balansen mellom endokytose og resirkulering er avgjørende for celleoverlevelse og bidrar til ulike cellulære hendelser10, for eksempel celleadhesjon, cellemigrasjon, cellepolaritet og signaltransduksjon.
ARF6, en liten GTPase, er en rapportert regulator for endokytisk menneskehandel7,11,12. Av interesse har ulike forskningsgrupper illustrert betydningen av ARF6 i endokytisk resirkulering13,14,15,16,17. Studien tar sikte på å undersøke forholdet mellom ARF6-mediert nevrittutvekst og endokytisk resirkulering. Den forrige rapporten antyder at aktiveringen av ARF6 er oppstrøms til Rac1-aktivitet gjennom å handle på ELMO1-dedikator av cytokinesis 1 (DOCK180) kompleks18. Men hvordan ARF6 utløser ELMO1-DOCK180 mediert Rac1-signalering er fortsatt uklart. Tetthet gradient ultracentrifugation ble brukt til å undersøke rollen som ARF6-mediert endokytisk resirkulering i en slik prosess. Ved å bruke det ble resirkuleringen endosomholdig brøkdel hentet fra cellelysene19. Fraksjonen ble utsatt for vestlig blotting for proteininnholdsanalyse. Immunoblotresultatene viste at under tilstedeværelsen av FE65, et hjerneberiket adapterprotein, økte aktiv ARF6 betydelig nivået av ELMO1 i resirkuleringsbelagt brøkdel. Følgende protokoll inkluderer prosedyrene for (1) transfekterende pattedyrceller; (2) forberede prøver og tetthet gradient kolonner; og (3) få resirkulering endosomeholdig brøkdel.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube, 11 x 34 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>347287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm tissue culture dish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>20100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>C14277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Sample Buffer</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>MB01015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COX IV (3E11) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4850S</td>
			<td>Rabbit monoclonal antibody for detecting COX IV.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Tissue Grinder, 7 mL</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>357542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) with low glucose</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30021.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELMO1 antibody (B-7)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-271519</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody for detecting ELMO1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FE65 antibody (E-20)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-19751</td>
			<td>Goat polyclonal antibody for detecting FE65.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Research Grade</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30160.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH Monoclonal Antibody (6C5)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM4300</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody for detecting GAPDH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageLab Software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>Measurement of band intensity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-&#946;-COP antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6160</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody for detecting &#946;-COP.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myc-tag (9B11) mouse mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2276S</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody for detecting myc tagged proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniPur EDTA, Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>4010-OP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-100 XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>392050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima MAX-TL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A95761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Tablets</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosSTOP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4906845001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAB11A-Specific Polyclonal antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>20229-1-AP</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody for detecting Rab11.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>AAJ21931A4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLA-120.2 Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>362046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

density gradient ultracentrifugation for investigating endocytic recycling in mammalian cells

Endosomal menneskehandel er en viktig cellulær prosess som regulerer et bredt spekter av biologiske hendelser. Proteiner internaliseres fra plasmamembranen og transporteres deretter til de tidlige endosomene. De internaliserte proteinene kan overføres til lysosomet for nedbrytning eller resirkuleres tilbake til plasmamembranen. En robust endokytisk resirkuleringsvei er nødvendig for å balansere fjerning av membranmaterialer fra endokytose. Ulike proteiner rapporteres å regulere banen, inkludert ADP-ribosyleringsfaktor 6 (ARF6). Tetthet gradient ultracentrifugation er en klassisk metode for cellefraksjonering. Etter sentrifugeringen sedimenteres organeller på deres isopykliske overflate. Brøkene samles inn og brukes til andre nedstrømsapplikasjoner. Beskrevet her er en protokoll for å få en resirkulering endosomholdig brøkdel fra transfekterte pattedyrceller ved hjelp av tetthet gradient ultracentrifugation. De isolerte fraksjonene ble utsatt for standard vestlig blotting for å analysere proteininnholdet. Ved å bruke denne metoden identifiserte vi at plasmamembranen rettet mot engulfment og cellemotilitet 1 (ELMO1), et Ras-relatert C3 botulinumtoksinsubstrat 1 (Rac1) guanin nukleotidutvekslingsfaktor, er gjennom ARF6-mediert endokytisk resirkulering.

Etter fraksjonering av de utransfected HEK293 cellene ved tetthet gradient ultracentrifugation, 12 brøker ble samlet fra toppen av gradienten. De høstede fraksjonene ble fortynnet med fortynningsbufferen i et 1:1-forhold og utsatt for en andre runde sentrifugering. Prøvene ble deretter utsatt for vestlig blotting for å analysere proteininnholdet. Som vist i figur 1,oppdages resirkuleringsmarkøren Rab11 i brøkdel 720. Andre subcellulære markører, inkludert β-C...

Watch this Scientific Journal Video about Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells at JoVE.com

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Dette dokumentet tar sikte på å presentere en protokoll for å forberede resirkulering endosomer fra pattedyrceller ved hjelp av sukrose tetthet gradient ultracentrifugation.

Tetthet gradient ultracentrifugation for å undersøke endokytisk resirkulering i pattedyrceller

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Denne protokollen bidrar til å isolere resirkulerings endosomer som inneholder brøkdel fra transfekterte pattedyrceller for å lette undersøkelsen av proteinhandel via endokytisk menneskehandel. Denne teknikken er enkel å håndtere og gjelder både vevs- og celleprøver. Å demonstrere prosedyren vil være Miss Zhai Yu Qi, en ph.d.-student fra Dr.Lao's Laboratory.Til å begynne med, plate 2 ganger 10 til 6 celler i en 100 millimeter kulturrett. Neste dag transfekterer du cellene med Lipofectamine i henhold til produsentens instruksjoner. For å høste cellene, kast kulturmediet 48 timer etter transfeksjon og vask cellene to ganger med iskald PBS.Tilsett deretter en milliliter iskald PBS supplert med 0,5X proteasehemmercocktail i 0,5X fosfatasehemmercocktail til hver tallerken. Deretter samler du cellene ved hjelp av en celleskraper og overfører celleopphenget til et 15 milliliter sentrifugerør. cellene ved sentrifugering ved hjelp av en svingbøtterotor.Kast supernatanten og resuspend cellepellet forsiktig i fem milliliter homogeniseringsbuffer. Samle cellene igjen ved sentrifugering og resuspend cellepellet i en milliliter homogenisering buffer. Homogeniser cellene med en Dounce Homogenizer ved hjelp av 15 til 20 slag.Overfør deretter homogonatet til et to milliliter sentrifugeringsrør. Tilsett 700 mikroliter homogeniseringsbuffer i homogonatet. Deretter snurrer du den fortynnede homogonate og samler 1,5 milliliter av supernatanten.Spinn den innsamlede supernatanten igjen, samle deretter 1,4 milliliter av supernatanten og merk den som post-kjernefysisk supernatant. For å forberede tetthetsgradientkolonnen, overfør 1,2 milliliter av post-nukleær supernatant til et ultracentrifuge rør. Tilsett deretter en milliliter 62% sukroseløsning i prøven og bland godt ved skånsom pipettering.Deretter legger du forsiktig til 3,3 milliliter 35% sukroseløsning på toppen av prøven, etterfulgt av 2,2 milliliter 25% sukroseløsning på toppen av 35% sukroseløsningen. Til slutt fyller du ultracentrifuge-røret til toppen med homogeniseringsbuffer. Sentrifuger tetthetsgradientkolonnen og samle forsiktig 12 fraksjoner på 1 milliliter hver, fra toppen av gradienten.Deretter fortynner du alle fraksjonene med en milliliter fortynningsbuffer og sentrifugerer de fortynnede prøvene. Etter sentrifugering aspirerer du supernatanten og tilsetter 50 mikroliter 1X prøvebuffer for å høste fraksjonene. Resirkuleringsmarkøren Rab11 ble påvist i brøkdel syv.Andre subcellulære markører, inkludert beta COP, COX IV, GAPDH, EEA1, Rab 7 og Lamp1 ble også undersøkt. Det ble også påvist et positivt EØS1-signal i brøkdel syv. De målte båndintensitetene til GAPDH, Cox IV og Rab11 i både Fraction seven og post-nuclear supernatant er vist her.Etter å ha transektert HEC293-celler med enten ELMO1, ELMO1 ARF6Q67L eller ELMO1 ARF6Q67L FE65, ble det ikke funnet noen endringer i ELMO1-distribusjon med ARF6Q67L og FE65 overekspression. ELMO1-nivået i brøkdel syv ble sammenlignet mellom ulike transfeksjoner og funnet å være forhøyet etter cotransfection av ARF6Q67L. Det ble observert en ytterligere økning da både ARF6Q67L og FE65 ble sam-uttrykt.Derimot reduserte utslag fe65 ARF6 mediert Elmo1 berikelse i brøkdel syv. Brøken som er oppnådd, kan brukes til senere analyse. For eksempel, vestlig blotting for å visualisere proteinnivåendringer i fraksjonen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

Isolering av high-density lipoproteiner for Non-koding små RNA Kvantifisering

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Protein Complex Affinity Capture fra Cryomilled pattedyrceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Toeprinting analyse av oversettelse innvielsen komplekse formasjon på pattedyr mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry å studere Binding dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til Solid-støttet Lipid Bilayers bruker et Quartz-Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Analyse av Endocytic opptak og retrograd Transport til Trans-Golgi nettverket med Functionalized Nanobodies i kulturperler celler

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Atomic absorbansen spektroskopi å måle intracellulære zinc Pools i pattedyrceller

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation

Isolasjon og analyse av plasmalipoproteiner ved ultracentrifugation

Analysis of plasma lipoproteins and apolipoproteins is an essential part for the diagnosis of dyslipidemia and studies of lipid metabolism and ...

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

Cellefraksjonering av U937-celler ved isopycnic tetthetsgradientrensing

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Polysomprofilering uten gradientopprettere eller fraksjoneringssystemer

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

Efficient and Scalable Production of Full-length Human Huntingtin Variants in Mammalian Cells using a Transient Expression System

Full-length huntingtin (FL HTT) is a large (aa 1-3,144), ubiquitously expressed, polyglutamine (polyQ)-containing protein with a mass of approximately 350 ...