Name: implantation of a cranial window for repeated in vivo imaging in awake mice
Uploaded: 2021-06-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice at JoVE.com

تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية المعتمدة من قبل IACUC في المركز الطبي بجامعة نبراسكا.
1. قبل الجراحة
<ol><li>إعداد الماصات للحقن الفيروسية. اسحب الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات باستخدام مجتذب ماصة وشطب الماصة بزاوية 20 درجة. تعقيم الماصات بين عش?...

<ol>
	<li>Cichon, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branch-specific+dendritic+Ca2++spikes+cause+persistent+synaptic+plasticity.">Branch-specific dendritic Ca2+ spikes cause persistent synaptic plasticity.</a> Nature. 520 (7546), 180-185 (2015).</li><li>Goncalves, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circuit+level+defects+in+the+developing+neocortex+of+Fragile+X+mice.">Circuit level defects in the developing neocortex of Fragile X mice.</a> Nature Neuroscience. 16 (7), 903-909 (2013).</li><li>Padmashri, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+structural+and+functional+synaptic+plasticity+with+motor+skill+learning+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Altered structural and functional synaptic plasticity with motor skill learning in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 33 (50), 19715-19723 (2013).</li><li>Peters, A. J., Chen, S. X., Komiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+reproducible+spatiotemporal+activity+during+motor+learning.">Emergence of reproducible spatiotemporal activity during motor learning.</a> Nature. 510 (7504), 263-267 (2014).</li><li>Poskanzer, K. E., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+regulate+cortical+state+switching+in+vivo.">Astrocytes regulate cortical state switching in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2675-2684 (2016).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++signaling+in+astrocytes+from+Ip3r2(-/-)+mice+in+brain+slices+and+during+startle+responses+in+vivo.">Ca2+ signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo.</a> Nature Neuroscience. 18 (5), 708-717 (2015).</li><li>Takata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+calcium+signaling+transforms+cholinergic+modulation+to+cortical+plasticity+in+vivo.">Astrocyte calcium signaling transforms cholinergic modulation to cortical plasticity in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 31 (49), 18155-18165 (2011).</li><li>Yang, G., Pan, F., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stably+maintained+dendritic+spines+are+associated+with+lifelong+memories.">Stably maintained dendritic spines are associated with lifelong memories.</a> Nature. 462 (7275), 920-924 (2009).</li><li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+long-term+dendritic+spine+stability+in+diverse+regions+of+cerebral+cortex.">Development of long-term dendritic spine stability in diverse regions of cerebral cortex.</a> Neuron. 46 (2), 181-189 (2005).</li><li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain.">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).</li><li>Isshiki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+synapse+remodelling+as+a+common+phenotype+in+mouse+models+of+autism.">Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism.</a> Nature Communications. 5, 4742 (2014).</li><li>Cruz-Martin, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+stabilization+of+dendritic+spines+in+fragile+X+mice.">Delayed stabilization of dendritic spines in fragile X mice.</a> Journal of Neuroscience. 30 (23), 7793-7803 (2010).</li><li>Mostany, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+synaptic+dynamics+during+normal+brain+aging.">Altered synaptic dynamics during normal brain aging.</a> Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).</li><li>Trachtenberg, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex.">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).</li><li>Agarwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+opening+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore+induces+microdomain+calcium+transients+in+astrocyte+processes.">Transient opening of the mitochondrial permeability transition pore induces microdomain calcium transients in astrocyte processes.</a> Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).</li><li>Bindocci, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+Ca2++imaging+advances+understanding+of+astrocyte+biology.">Three-dimensional Ca2+ imaging advances understanding of astrocyte biology.</a> Science. 356 (6339), (2017).</li><li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments.">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li><li>Han, S., Yang, W., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+volumetric+imaging+of+neuronal+activity+of+cortical+columns.">Two-color volumetric imaging of neuronal activity of cortical columns.</a> Cell Reports. 27 (7), 2229-2240 (2019).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo.">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li><li>Stowell, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noradrenergic+signaling+in+the+wakeful+state+inhibits+microglial+surveillance+and+synaptic+plasticity+in+the+mouse+visual+cortex.">Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Chen, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-specific+plasticity+of+inhibitory+circuits+in+motor+cortex+during+motor+learning.">Subtype-specific plasticity of inhibitory circuits in motor cortex during motor learning.</a> Nature Neuroscience. 18 (8), 1109-1115 (2015).</li><li>Stobart, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+circuit+activity+evokes+rapid+astrocyte+calcium+signals+on+a+similar+timescale+to+neurons.">Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons.</a> Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).</li><li>Matsui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+in+utero+electroporation:+controlled+spatiotemporal+gene+transfection.">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e3024 (2011).</li><li>Roth, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+synaptic+AMPA+receptor+plasticity+during+motor+learning.">Cortical synaptic AMPA receptor plasticity during motor learning.</a> Neuron. 105 (5), 895-908 (2020).</li><li>Stogsdill, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+neuroligins+control+astrocyte+morphogenesis+and+synaptogenesis.">Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis.</a> Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).</li><li>Suresh, A., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+synaptic+AMPAR+and+spine+dynamics:+impairments+in+the+FXS+mouse.">Relationship between synaptic AMPAR and spine dynamics: impairments in the FXS mouse.</a> Cerebral Cortex. 27 (8), 4244-4256 (2017).</li><li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+two-photon+imaging+of+synaptic+structures+in+the+cortex+of+awake+head-restrained+mice.">Transcranial two-photon imaging of synaptic structures in the cortex of awake head-restrained mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1010, 35-43 (2013).</li><li>Dombeck, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+large-scale+neural+activity+with+cellular+resolution+in+awake,+mobile+mice.">Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice.</a> Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).</li><li>Kislin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat-floored+air-lifted+platform:+a+new+method+for+combining+behavior+with+microscopy+or+electrophysiology+on+awake+freely+moving+rodents.">Flat-floored air-lifted platform: a new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (88), e51869 (2014).</li><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Hauglund, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meningeal+lymphangiogenesis+and+enhanced+glymphatic+activity+in+mice+with+chronically+implanted+EEG+electrodes.">Meningeal lymphangiogenesis and enhanced glymphatic activity in mice with chronically implanted EEG electrodes.</a> Journal of Neuroscience. 40 (11), 2371-2380 (2020).</li><li>De Paola, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+structural+plasticity+of+axonal+branches+and+boutons+in+the+adult+neocortex.">Cell type-specific structural plasticity of axonal branches and boutons in the adult neocortex.</a> Neuron. 49 (6), 861-875 (2006).</li><li>Cheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+two-photon+calcium+imaging+at+different+depths+with+spatiotemporal+multiplexing.">Simultaneous two-photon calcium imaging at different depths with spatiotemporal multiplexing.</a> Nature Methods. 8 (2), 139-142 (2011).</li><li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).</li><li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polished+and+reinforced+thinned-skull+window+for+long-term+imaging+of+the+mouse+brain.">A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), e3742 (2012).</li><li>Helm, P. J., Ottersen, O. P., Nase, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+optical+properties+of+the+mouse+cranium--implications+for+in+vivo+multi+photon+laser+scanning+microscopy.">Analysis of optical properties of the mouse cranium--implications for in vivo multi photon laser scanning microscopy.</a> Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 316-322 (2009).</li><li>Stobart, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+calcium+imaging+of+astrocytes+reveals+distinct+cellular+compartment+responses+to+sensory+stimulation.">Long-term in vivo calcium imaging of astrocytes reveals distinct cellular compartment responses to sensory stimulation.</a> Cerebral Cortex. 28 (1), 184-198 (2018).</li><li>Pryazhnikov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+two-photon+imaging+in+somatosensory+cortex+of+behaving+mice+reveals+dendritic+spine+formation+enhancement+by+subchronic+administration+of+low-dose+ketamine.">Longitudinal two-photon imaging in somatosensory cortex of behaving mice reveals dendritic spine formation enhancement by subchronic administration of low-dose ketamine.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6464 (2018).</li><li>Thrane, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+anesthesia+selectively+disrupts+astrocyte+calcium+signaling+in+the+awake+mouse+cortex.">General anesthesia selectively disrupts astrocyte calcium signaling in the awake mouse cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (46), 18974-18979 (2012).</li><li>Paukert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norepinephrine+controls+astroglial+responsiveness+to+local+circuit+activity.">Norepinephrine controls astroglial responsiveness to local circuit activity.</a> Neuron. 82 (6), 1263-1270 (2014).</li><li>Delekate, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabotropic+P2Y1+receptor+signalling+mediates+astrocytic+hyperactivity+in+vivo+in+an+Alzheimer's+disease+mouse+model.">Metabotropic P2Y1 receptor signalling mediates astrocytic hyperactivity in vivo in an Alzheimer's disease mouse model.</a> Nature Communications. 5, 5422 (2014).</li></ol>

هنا ، قدمنا بروتوكولا لزرع نوافذ الجمجمة المزمنة للتصوير في الجسم الحي للخلايا النجمية القشرية والخلايا العصبية في الفئران المستيقظة والمقيدة الرأس على قفص منزلي يتم رفعه جوا. تم تقديم أمثلة محددة لتطبيق نافذة الجمجمة لتصوير الخلايا النجمية التي تعبر عن GECIs والهياكل العصبية المتشا?...

تعد القدرة على إجراء الفحص المجهري الفلوري متعدد الفوتونات في الجسم الحي في قشرة الفئران أمرا بالغ الأهمية لدراسة الإشارات الخلوية والبنية1،2،3،4،5،6،7،8،9 ، وأمراض الأمراض10،11 ، والتطور الخلوي12،13 . مع زرع نوافذ الجمجمة المزمنة ، يكون التصوير الطولي ممكنا ، مما يسمح بالتصوير المتكرر للمناطق القشرية لأيام أو أسابيع أو أشهر13,14 في الحيوانات الحية. يعد الفحص المجهري متعدد الفوتونات مثاليا للتصوير المتكرر في الجسم الحي بسبب تحسين فحص العمق وتقليل الضرر الضوئي المرتبط بليزر الأشعة تحت الحمراء المستخدم. هذا يسمح لدراسة الديناميكيات الجزيئية والخلوية لخلايا معينة في مختلف المناطق القشرية .
تم استخدام المجهر متعدد الفوتونات في التصوير الحي للخلايا العصبية والدبقية في الفئران 15،16،17،18،19،20. يمكن تنفيذ استراتيجيات مختلفة لتسمية أنواع معينة من الخلايا ومجالات الاهتمام. أحد الأساليب الشائعة هو دفع التعبير عن البروتينات الفلورية المشفرة وراثيا بطريقة خاصة بالخلية باستخدام نظام إعادة تركيب Cre-Lox. يمكن إجراء ذلك مع الفئران المعدلة وراثيا ، على سبيل المثال ، عبور الفأر tdTomato "floxed" (Ai14) مع فأر يعبر عن Cre-recombinase تحت مروج مثير للاهتمام21. بدلا من ذلك ، يمكن تحقيق وضع العلامات الخاصة بالخلايا والموقع باستخدام الحقن الفيروسية. هنا ، يتم حقن فيروس يشفر Cre recombinase تحت محرك خاص بالخلية وفيروس يشفر جينا مفلطخا ذا أهمية في منطقة محددة. ثم تعبر أنواع الخلايا المناسبة التي تتلقى كلا الناقلين الفيروسيين عن الجين (الجينات) المطلوب. يمكن أن تكون هذه الجينات علامات هيكلية ، مثل tdTomato، لعرض التغيرات في التشكل الخلوي22 أو مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs) ، مثل GCaMP و / أو RCaMP ، لفحص ديناميكيات الكالسيوم23. يمكن تطبيق طرق إعادة التركيب الجيني بشكل فردي أو مجتمعة لتسمية نوع واحد أو أكثر من الخلايا. وهناك نهج ثالث ، لا يتطلب الفئران المعدلة وراثيا أو التركيبات الفيروسية (التي لديها قدرة تعبئة محدودة) ، هو في الرحم الكهربائي من بنى الحمض النووي24. اعتمادا على توقيت الكهربية ، يمكن استهداف أنواع مختلفة من الخلايا 25،26،27.
عند إجراء التصوير متعدد الفوتونات ، يمكن تصوير الفئران أثناء الاستيقاظ أو التخدير. يمكن إجراء تصوير الفئران المستيقظة عن طريق تأمين الماوس عبر لوحة رأس متصلة28. يتم جعل هذا النهج أقل إرهاقا من خلال السماح بحرية الحركة نسبيا للحيوان باستخدام طرق ، مثل كرات الستايروفوم29 العائمة بحرية ، أو أجهزة المشي العائمة بحرية1 ، أو نظام القفص المنزلي الذي يتم رفعه بالهواء حيث يتم تثبيت الفئران بواسطة لوحة رأس متصلة ويسمح لها بالتحرك في غرفة مفتوحة30. لكل من ظروف التصوير هذه ، سيكون من الضروري أولا تعويد الفئران على إعداد التصوير. تصف هذه الورقة إجراء التعود والتصوير باستخدام نظام قفص منزلي يتم رفعه جوا.
يصف هذا البروتوكول زرع نافذة قحفية مزمنة للتصوير الطولي في الجسم الحي في القشرة. هنا ، سنستخدم الفئران التي تعبر بشكل مشروط عن GCaMP6f في الخلايا النجمية لمراقبة ديناميكيات إشارات الكالسيوم. علاوة على ذلك ، تصف هذه الورقة إجراء الحقن الفيروسية باستخدام tdTomato كتسمية للخلايا العصبية. هذا يسمح بتحديد التغيرات في البنية المشبكية العصبية و / أو التوافر كعلامة هيكلية تمكن من التصوير المتكرر لنفس الخلايا النجمية. وخلال البروتوكول، سيتم تسليط الضوء على الخطوات الحاسمة لضمان أفضل جودة ممكنة للصور التي يتم الحصول عليها من الفحص المجهري متعدد الفوتونات.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15o Pointed Blade</td>
			<td>Surgistar</td>
			<td>6500</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19 G Needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305186</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV1-CAG-FLEX-tdTomato</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>28306-AAV1</td>
			<td>Viral Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV1-CaMKII-0-4-Cre</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>105558-AAV1</td>
			<td>Viral Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acteone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A16P4</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol Prep Pads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Covidien 5750</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beveler</td>
			<td>Narishige</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbide Burs</td>
			<td>SS White Dental</td>
			<td>14717</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen (Rimadyl), 50 mg/mL</td>
			<td>Zoetis Mylan Institutional, LLC.</td>
			<td></td>
			<td>Drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed Air</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-022-523</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tip Applicators</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>836-WC NO BINDER</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass, No. 1 thickness, 3 mm/5 mm</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0720, 64-0700</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Drill</td>
			<td>Aseptico</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone, 4 mg/mL</td>
			<td>Mylan Institutional, LLC.</td>
			<td></td>
			<td>Drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duralay Liquid&#160; (dental cement liquid)</td>
			<td>Patterson Dental</td>
			<td>602-8518</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duralay Powder&#160; (dental cement powder)</td>
			<td>Patterson Dental</td>
			<td>602-7932</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrofloxacin, 2.27%</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td>Drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>17033-211-38</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Lite High Intensity Illuminator</td>
			<td>Dolan-Jenner Industries</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (Large)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14099</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (Small)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501764</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCaMP6f B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Stock No: 024105</td>
			<td>Mouse line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Germinator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Stock No: 012586</td>
			<td>Mouse Line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headplate</td>
			<td>Neurotar</td>
			<td>Model 1, Model 3</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501705</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holder for 15o Pointed Blade</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501247</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holder for Scalpel Blades</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500236</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine Prep Pads</td>
			<td>Avantor</td>
			<td>15648-926</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal</td>
			<td></td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane table top system with Induction Box</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Vaporizer</td>
			<td>SurgiVet</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>KG517</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite 401</td>
			<td>Henkel</td>
			<td>40140</td>
			<td>fast-curing instant adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite 454</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9194415</td>
			<td>cyanoacrylate adhesive gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen</td>
			<td>Matheson</td>
			<td>NI M200</td>
			<td>Gas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen</td>
			<td>Matheson</td>
			<td>OX M250</td>
			<td>Gas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer</td>
			<td>Parker</td>
			<td></td>
			<td>intracellular microinjection dispense system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014340</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Hair Trimmer</td>
			<td>Wahl</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline (0.9% Sodium Chloride)</td>
			<td>Med Vet International</td>
			<td>RX0.9NACL-30BAC</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades, Size 11</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4-111</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503667</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic Instrument</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugi Sponge Strips (sponge strips)</td>
			<td>Kettenbach Dental</td>
			<td>31002</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SURGIFOAM (gel foam)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>1972</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe with 26 G Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>309625</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T5648-1G</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti:Sapphire Laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Blanket</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylocaine MPF with Epinephrine (1:200,000), 10 mg/mL</td>
			<td>Fresenius Kabi USA</td>
			<td></td>
			<td>Drug</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implantation of a cranial window for repeated in vivo imaging in awake mice

لفهم الفسيولوجيا الخلوية للخلايا العصبية والدبقية في الحيوانات التي تتصرف بشكل كامل ، من الضروري تصور مورفولوجيتها وتسجيل نشاطها في الجسم الحي في الفئران التصرف. تصف هذه الورقة طريقة لزرع نافذة جمجمة مزمنة للسماح بالتصوير الطولي لخلايا الدماغ في الفئران المستيقظة المقيدة الرأس. بالاقتران مع الاستراتيجيات الجينية والحقن الفيروسية ، من الممكن تسمية خلايا ومناطق محددة ذات أهمية بعلامات هيكلية أو فسيولوجية. يوضح هذا البروتوكول كيفية الجمع بين الحقن الفيروسية لتسمية الخلايا العصبية بالقرب من الخلايا النجمية المعبرة عن GCaMP6 في القشرة للتصوير المتزامن لكلتا الخليتين من خلال نافذة الجمجمة. يمكن إجراء التصوير متعدد الفوتونات لنفس الخلايا لأيام أو أسابيع أو أشهر في الحيوانات المستيقظة التي تتصرف. يوفر هذا النهج للباحثين طريقة لعرض الديناميكيات الخلوية في الوقت الفعلي ويمكن تطبيقها للإجابة على عدد من الأسئلة في علم الأعصاب.

يمكن تقييم جودة نافذة الجمجمة من خلال مدى وضوح الهياكل العصبية. في نافذة جيدة ، تكون الأشواك المتغصنة مرئية بوضوح (الشكل 1). مع تخزين البيانات الهيكلية والموضعية ، يمكن تصوير نفس الحيوان بشكل متكرر لأيام أو أسابيع أو أشهر لفحص نفس الخلايا (الشكل 1). تم الحصول ?...

Watch this Scientific Journal Video about Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice at JoVE.com

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

يظهر هنا بروتوكول لزرع نافذة جمجمة مزمنة للتصوير الطولي لخلايا الدماغ في الفئران المستيقظة المقيدة الرأس.

زرع نافذة جمجمية للتصوير المتكرر في الجسم الحي في الفئران المستيقظة

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...

يصف البروتوكول كيفية إجراء الحقن الفيروسية وزرع نافذة جمجمة لتصوير خلايا الدماغ في الفئران المستيقظة والمقيدة الرأس. ميزة هذه الطريقة هي أنه يمكن تصوير بنية ونشاط الخلايا العصبية والخلايا النجمية بشكل متكرر على مدى جلسات متعددة. يمكن استخدام هذا النهج لتحديد كيفية تغيير الخلايا العصبية في نماذج من اضطرابات النمو العصبي ، أو الاضطرابات العصبية التنكسية ، أو ما إذا كانت اللدونة المعتمدة على التجربة ضعيفة.ابدأ بتثبيت ماوس مخدر على إطار مجسمة باستخدام مشبك الخطم وقضبان الأذن. باستخدام أدوات جراحية معقمة ، قم بقص وإزالة الجلد من الغرز الأمامية الأمامية إلى البريجما إلى الخلف إلى لامدا. باستخدام شفرة جراحية معقمة بحجم 11 من الفولاذ الكربوني ، قم بكشط جميع الأنسجة الضامة بلطف من الجمجمة.بمساعدة مثقاب الأسنان ، قم بحفر عظم الجمجمة تدريجيا على طول مخطط الفتحة في دوائر متحدة المركز لتسهيل حتى ترقق العظام. بعد كل تمريرة متحدة المركز ، أضف قطرة أو قطرتين من المياه المالحة إلى المنطقة المحفورة ، واسمح للمحلول الملحي بالجلوس لمدة 10 ثوان على الأقل قبل استئناف الحفر. ادفع بلطف على المنطقة المركزية من عظم الجمجمة باستخدام ملقط ناعم للتحقق من أن الجمجمة رقيقة بشكل كاف وتتحرك.تأكد من أن الأوعية الدموية الأساسية التي حدث فيها الحفر سليمة ، وأن العظم غير متصدع. أدخل بعناية شفرة مدببة مصغرة بزاوية 15 درجة في العظم الرقيق وقم بقص واستخدام رغوة الجل المنقوعة في محلول ملحي لوقف أي نزيف قد يحدث. باستخدام الملقط ، ارفع العظام وأزلها بعناية ، مع الحرص على عدم إتلاف الأم الجافية.للحقن ، املأ ماصة زجاجية مشطوفة معقمة بطرف 20 ميكرومتر بخليط الفيروس. ثم اخفض الماصة للمس سطح الدماغ ، واستمر في الانخفاض لمدة 200 إلى 300 ميكرومتر إضافي لحقن الطبقة 2/3. باستخدام نظام توزيع الحقن المجهري داخل الخلايا ، يقوم الضغط بحقن النظام من 12 إلى 15 مرة على مدار دقيقتين.لزرع نافذة الجمجمة ، ضع زجاج الغطاء فوق الفتحة في الجمجمة. استخدم الملقط للتأكد من تدفق الزجاج فوق الفتحة. لإغلاق حواف النافذة الزجاجية على الجمجمة ، ضع هلام لاصق سيانو أكريليت حول محيط السطح الزجاجي.فوق الجل اللاصق ، ضع طبقة من الغراء. ثم أضف طبقة من سائل أسمنت الأسنان. عندما يصلب أسمنت الأسنان ، ضع طبقة رقيقة من الغراء حول الفتحة المركزية للوحة رأس نوع المروحية ، وضع لوحة رأس من نوع المروحية بالحجم المناسب فوق زجاج الغطاء.اترك الغراء حتى يجف. أضف مسحوق أسمنت الأسنان في أنبوب ميكروفوج سعة 1.5 ملليلتر حتى علامة 0.1 ملليلتر. امزج سبع إلى ثماني قطرات من المادة اللاصقة الفورية سريعة المعالجة في المسحوق ، واسحب الخليط الناتج في حقنة سعة ملليلتر واحد مع إبرة قياس 19 التي تم قطعها لإنشاء فتحة أكبر.حقن خليط المسحوق من خلال الثقوب الجانبية لشريط طائرة هليكوبتر حتى يتسرب من كلا الجانبين. ضع خليط لاصق أسمنت الأسنان على بقية الجمجمة المكشوفة لربط صفيحة الرأس بالجمجمة. لف الماوس بقطعة قماش ، وقم بتثبيته عبر لوحة رأسه إلى ذراع تثبيت الرأس في القفص المنزلي المنقول جوا ، ثم اترك القفص المنزلي معرضا للضوء.بعد وقت التعود لمدة 15 دقيقة ، قم بإزالة الماوس من القفص المنزلي. باستخدام وضع المجال الواسع للمجهر ، حدد موقعين إلى ثلاثة مواضع من الأوعية الدموية التي يمكن التعرف عليها بسهولة. احفظ صور الأوعية الدموية، وسجل إحداثيات x و y التي تظهر على وحدة التحكم في المحرك.صورة الهياكل المشبكية للخلايا العصبية، ونشاط GCaMP6f في الخلايا النجمية. في التحليل التمثيلي ، تم تقييم جودة نافذة الجمجمة من خلال التصوير المتكرر للتشعبات والخلايا النجمية المعبرة عن GCaMP6f على مدار أيام. في نافذة جيدة ، بدت الهياكل العصبية هشة مع أشواك تغصنية مرئية بوضوح.ظهر عمودان فقريان جديدان في اليوم الثاني من التصوير. استمر عمود فقري واحد فقط وكان مرئيا في اليوم الخامس. تمت دراسة نشاط الكالسيوم في الخلايا النجمية التي تعبر عن GCaMP6f في نقاط زمنية مختلفة.وشهد حدث عالمي شمل الخلية بأكملها خلال نوبة حركية. الخطوتان الحاسمتان لهذا البروتوكول هما أن العظم يحتاج إلى ترقق كاف قبل إزالة العظم ، ووضع زجاج الغطاء بشكل صحيح فوق الفتحة. يمكن الجمع بين التصوير والتحليل السلوكي ، إما أثناء التصوير ، أو ما بعد السلوك ، مثل تعلم مهارة حركية جديدة ، لتحديد كيفية تعديل بنية الخلايا العصبية والخلايا النجمية ووظيفتها عن طريق التعلم.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

تقنية نافذة رقيقة الجمجمة لالمزمنة ثنائي الفوتون في الجسم الحي التصوير من الخلايا الدبقية الصغيرة في الفئران نماذج من Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

التصوير المتعدد الوسائط من زرع الخلايا الجذعية في الجهاز العصبي المركزي من الفئران

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

تصوير الأعصاب وظيفية عن طريق الموجات فوق الصوتية تعطيل حاجز الدم في الدماغ والتصوير بالرنين المغناطيسي المنغنيز معززة لل

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

ضعفت-الجمجمة وتقنيات النافذة القشرية لل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; البصرية بالاتساق التصوير المقطعي التصوير

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

تمكين إعداد النافذة الجانبية المزمنة الجمجمة<em&gt; في فيفو</em&gt; الملاحظة التالية القاصي الأوسط الشلل انسداد الشريان في الفئران

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of ...

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal (PHASOR): A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal PHASOR: A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

بيزو عالية الدقة العظام الاستئصال الجراحي (مطوار): تقنية لتحسين الإطار الجمجمة جراحة في الفئران

Multiphoton microscopy has been widely adapted for imaging neurons in vivo. Repeated imaging requires implantation of a cranial window or repeated ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

استئصال الصفيحة الفقرية وغرس نافذه الحبل الشوكي في الماوس

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

في فيفو اثنين-فوتون تصوير الخلايا العصبية القشرية في الفئران حديثي الولادة

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

في الجسم الحي تصوير الكالسيوم في الزيتون السفلي الماوس

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Construction and Implementation of Carbon Fiber Microelectrode Arrays for Chronic and Acute In Vivo Recordings

Construction and Implementation of Carbon Fiber Microelectrode Arrays for Chronic and Acute In Vivo Recordings

بناء وتنفيذ صفائف الألياف الكربونية Microelectrode للتسجيلات المزمنة والحادة في فيفو

Multichannel electrode arrays offer insight into the working brain and serve to elucidate neural processes at the single-cell and circuit levels. ...