Name: implantation of a cranial window for repeated in vivo imaging in awake mice
Uploaded: 2021-06-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice at JoVE.com

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met richtlijnen die zijn goedgekeurd door de IACUC aan het University of Nebraska Medical Center.
1. Voor de operatie
<ol><li>Bereid pipetten voor virale injecties voor. Trek borosilicaatglascapillairen met behulp van een pipettrekker en schuin de pipet in een hoek van 20°. Steriliseer de pipetten een nacht.</li>
	<li>Bereid verse stukjes steriel gelschuim door ze in kleine vierkantjes te snijden. Dompel het gelschuim onder in een sterie...

<ol>
	<li>Cichon, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branch-specific+dendritic+Ca2++spikes+cause+persistent+synaptic+plasticity.">Branch-specific dendritic Ca2+ spikes cause persistent synaptic plasticity.</a> Nature. 520 (7546), 180-185 (2015).</li><li>Goncalves, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circuit+level+defects+in+the+developing+neocortex+of+Fragile+X+mice.">Circuit level defects in the developing neocortex of Fragile X mice.</a> Nature Neuroscience. 16 (7), 903-909 (2013).</li><li>Padmashri, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+structural+and+functional+synaptic+plasticity+with+motor+skill+learning+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Altered structural and functional synaptic plasticity with motor skill learning in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 33 (50), 19715-19723 (2013).</li><li>Peters, A. J., Chen, S. X., Komiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+reproducible+spatiotemporal+activity+during+motor+learning.">Emergence of reproducible spatiotemporal activity during motor learning.</a> Nature. 510 (7504), 263-267 (2014).</li><li>Poskanzer, K. E., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+regulate+cortical+state+switching+in+vivo.">Astrocytes regulate cortical state switching in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2675-2684 (2016).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++signaling+in+astrocytes+from+Ip3r2(-/-)+mice+in+brain+slices+and+during+startle+responses+in+vivo.">Ca2+ signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo.</a> Nature Neuroscience. 18 (5), 708-717 (2015).</li><li>Takata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+calcium+signaling+transforms+cholinergic+modulation+to+cortical+plasticity+in+vivo.">Astrocyte calcium signaling transforms cholinergic modulation to cortical plasticity in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 31 (49), 18155-18165 (2011).</li><li>Yang, G., Pan, F., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stably+maintained+dendritic+spines+are+associated+with+lifelong+memories.">Stably maintained dendritic spines are associated with lifelong memories.</a> Nature. 462 (7275), 920-924 (2009).</li><li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+long-term+dendritic+spine+stability+in+diverse+regions+of+cerebral+cortex.">Development of long-term dendritic spine stability in diverse regions of cerebral cortex.</a> Neuron. 46 (2), 181-189 (2005).</li><li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain.">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).</li><li>Isshiki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+synapse+remodelling+as+a+common+phenotype+in+mouse+models+of+autism.">Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism.</a> Nature Communications. 5, 4742 (2014).</li><li>Cruz-Martin, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+stabilization+of+dendritic+spines+in+fragile+X+mice.">Delayed stabilization of dendritic spines in fragile X mice.</a> Journal of Neuroscience. 30 (23), 7793-7803 (2010).</li><li>Mostany, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+synaptic+dynamics+during+normal+brain+aging.">Altered synaptic dynamics during normal brain aging.</a> Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).</li><li>Trachtenberg, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex.">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).</li><li>Agarwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+opening+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore+induces+microdomain+calcium+transients+in+astrocyte+processes.">Transient opening of the mitochondrial permeability transition pore induces microdomain calcium transients in astrocyte processes.</a> Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).</li><li>Bindocci, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+Ca2++imaging+advances+understanding+of+astrocyte+biology.">Three-dimensional Ca2+ imaging advances understanding of astrocyte biology.</a> Science. 356 (6339), (2017).</li><li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments.">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li><li>Han, S., Yang, W., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+volumetric+imaging+of+neuronal+activity+of+cortical+columns.">Two-color volumetric imaging of neuronal activity of cortical columns.</a> Cell Reports. 27 (7), 2229-2240 (2019).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo.">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li><li>Stowell, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noradrenergic+signaling+in+the+wakeful+state+inhibits+microglial+surveillance+and+synaptic+plasticity+in+the+mouse+visual+cortex.">Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Chen, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-specific+plasticity+of+inhibitory+circuits+in+motor+cortex+during+motor+learning.">Subtype-specific plasticity of inhibitory circuits in motor cortex during motor learning.</a> Nature Neuroscience. 18 (8), 1109-1115 (2015).</li><li>Stobart, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+circuit+activity+evokes+rapid+astrocyte+calcium+signals+on+a+similar+timescale+to+neurons.">Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons.</a> Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).</li><li>Matsui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+in+utero+electroporation:+controlled+spatiotemporal+gene+transfection.">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e3024 (2011).</li><li>Roth, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+synaptic+AMPA+receptor+plasticity+during+motor+learning.">Cortical synaptic AMPA receptor plasticity during motor learning.</a> Neuron. 105 (5), 895-908 (2020).</li><li>Stogsdill, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+neuroligins+control+astrocyte+morphogenesis+and+synaptogenesis.">Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis.</a> Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).</li><li>Suresh, A., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+synaptic+AMPAR+and+spine+dynamics:+impairments+in+the+FXS+mouse.">Relationship between synaptic AMPAR and spine dynamics: impairments in the FXS mouse.</a> Cerebral Cortex. 27 (8), 4244-4256 (2017).</li><li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+two-photon+imaging+of+synaptic+structures+in+the+cortex+of+awake+head-restrained+mice.">Transcranial two-photon imaging of synaptic structures in the cortex of awake head-restrained mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1010, 35-43 (2013).</li><li>Dombeck, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+large-scale+neural+activity+with+cellular+resolution+in+awake,+mobile+mice.">Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice.</a> Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).</li><li>Kislin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat-floored+air-lifted+platform:+a+new+method+for+combining+behavior+with+microscopy+or+electrophysiology+on+awake+freely+moving+rodents.">Flat-floored air-lifted platform: a new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (88), e51869 (2014).</li><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Hauglund, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meningeal+lymphangiogenesis+and+enhanced+glymphatic+activity+in+mice+with+chronically+implanted+EEG+electrodes.">Meningeal lymphangiogenesis and enhanced glymphatic activity in mice with chronically implanted EEG electrodes.</a> Journal of Neuroscience. 40 (11), 2371-2380 (2020).</li><li>De Paola, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+structural+plasticity+of+axonal+branches+and+boutons+in+the+adult+neocortex.">Cell type-specific structural plasticity of axonal branches and boutons in the adult neocortex.</a> Neuron. 49 (6), 861-875 (2006).</li><li>Cheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+two-photon+calcium+imaging+at+different+depths+with+spatiotemporal+multiplexing.">Simultaneous two-photon calcium imaging at different depths with spatiotemporal multiplexing.</a> Nature Methods. 8 (2), 139-142 (2011).</li><li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).</li><li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polished+and+reinforced+thinned-skull+window+for+long-term+imaging+of+the+mouse+brain.">A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), e3742 (2012).</li><li>Helm, P. J., Ottersen, O. P., Nase, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+optical+properties+of+the+mouse+cranium--implications+for+in+vivo+multi+photon+laser+scanning+microscopy.">Analysis of optical properties of the mouse cranium--implications for in vivo multi photon laser scanning microscopy.</a> Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 316-322 (2009).</li><li>Stobart, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+calcium+imaging+of+astrocytes+reveals+distinct+cellular+compartment+responses+to+sensory+stimulation.">Long-term in vivo calcium imaging of astrocytes reveals distinct cellular compartment responses to sensory stimulation.</a> Cerebral Cortex. 28 (1), 184-198 (2018).</li><li>Pryazhnikov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+two-photon+imaging+in+somatosensory+cortex+of+behaving+mice+reveals+dendritic+spine+formation+enhancement+by+subchronic+administration+of+low-dose+ketamine.">Longitudinal two-photon imaging in somatosensory cortex of behaving mice reveals dendritic spine formation enhancement by subchronic administration of low-dose ketamine.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6464 (2018).</li><li>Thrane, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+anesthesia+selectively+disrupts+astrocyte+calcium+signaling+in+the+awake+mouse+cortex.">General anesthesia selectively disrupts astrocyte calcium signaling in the awake mouse cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (46), 18974-18979 (2012).</li><li>Paukert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norepinephrine+controls+astroglial+responsiveness+to+local+circuit+activity.">Norepinephrine controls astroglial responsiveness to local circuit activity.</a> Neuron. 82 (6), 1263-1270 (2014).</li><li>Delekate, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabotropic+P2Y1+receptor+signalling+mediates+astrocytic+hyperactivity+in+vivo+in+an+Alzheimer's+disease+mouse+model.">Metabotropic P2Y1 receptor signalling mediates astrocytic hyperactivity in vivo in an Alzheimer's disease mouse model.</a> Nature Communications. 5, 5422 (2014).</li></ol>

Hier hebben we een protocol gepresenteerd voor de implantatie van chronische schedelvensters voor in vivo beeldvorming van corticale astrocyten en neuronen in wakkere, hoofdbezorgde muizen op een luchtgelifte thuiskooi. Er zijn specifieke voorbeelden gegeven van de craniale venstertoepassing voor het afbeelden van astrocyten die GECI's en neuronale synaptische structuren tot expressie brengen. Met behulp van multifotonenmicroscopie kunnen astrocytische calciumsignaleringsdynamiek en structurele synaptische dynam...

Het vermogen om in vivo multifotonenfluorescentiemicroscopie uit te voeren in de cortex van muizen is van het grootste belang voor de studie van cellulaire signalering en structuur 1,2,3,4,5,6,7,8,9, ziektepathologie 10,11 en cellulaire ontwikkeling12,13 . Met de implantatie van chronische schedelvensters is longitudinale beeldvorming mogelijk, waardoor herhaalde beeldvorming van corticale gebieden gedurende dagen, weken of maanden mogelijk is13,14 bij levende dieren. Multifotonenmicroscopie is ideaal voor in vivo, herhaalde beeldvorming vanwege verbeterde diepte-tastering en verminderde fotoschade in verband met de gebruikte infraroodlaser. Dit maakt de studie van moleculaire en cellulaire dynamica van specifieke cellen in verschillende corticale regio's mogelijk.
Multifotonenmicroscopie is gebruikt voor in vivo beeldvorming van neuronale en gliacellen bij muizen 15,16,17,18,19,20. Verschillende strategieën kunnen worden geïmplementeerd om bepaalde celtypen en interessegebieden te labelen. Een veel voorkomende aanpak is om de expressie van genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten op een celspecifieke manier te stimuleren met behulp van het Cre-Lox-recombinatiesysteem. Dit kan worden uitgevoerd met genetisch gemodificeerde muizen, bijvoorbeeld het kruisen van tdTomato "floxed" muis (Ai14) met een muis die Cre-recombinase tot expressie brengt onder een promotor van belang21. Als alternatief kan cel- en plaatsspecifieke etikettering worden bereikt met virale injecties. Hier worden een virus dat codeert voor Cre-recombinase onder een celspecifieke promotor en een virus dat codeert voor een gevlokt gen van belang geïnjecteerd in een gedefinieerd gebied. Geschikte celtypen die beide virale vectoren ontvangen, zullen dan het gewenste gen (en) tot expressie brengen. Deze genen kunnen structurele markers zijn, zoals tdTomato, om veranderingen in cellulaire morfologie22 of genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECI's), zoals GCaMP en / of RCaMP, te bekijken om calciumdynamiek23 te onderzoeken. Methoden van genetische recombinatie kunnen individueel of in combinatie worden toegepast om een of meer celtypen te labelen. Een derde benadering, waarvoor geen transgene muizen of virale constructies (die een beperkte verpakkingscapaciteit hebben) nodig zijn, is in utero-elektroporatie van DNA-constructen24. Afhankelijk van de timing van de elektroporatie kunnen verschillende celtypen worden gericht op 25,26,27.
Bij het uitvoeren van multifoton-beeldvorming kunnen muizen worden afgebeeld terwijl ze wakker zijn of verdoofd. Beeldvorming van wakkere muizen kan worden uitgevoerd door de muis vast te zetten via een bevestigde kopplaat28. Deze aanpak wordt minder stressvol gemaakt door relatief vrije beweging van het dier mogelijk te maken met behulp van methoden, zoals vrij zwevende, luchtondersteunde piepschuimballen29, vrij zwevende loopbanden1, of een luchtgelift thuiskooisysteem waarbij muizen worden vastgemaakt door een bevestigde hoofdplaat en mogen bewegen in een open kamer30. Voor elk van deze beeldvormingscondities zal het eerst nodig zijn om de muizen te laten wennen aan de beeldvormingsopstelling. Dit artikel beschrijft de gewennings- en beeldvormingsprocedure met behulp van een luchtgelift thuiskooisysteem.
Dit protocol beschrijft de implantatie van een chronisch schedelvenster voor longitudinale in vivo beeldvorming in de cortex. Hier zullen we muizen gebruiken die GCaMP6f voorwaardelijk tot expressie brengen in astrocyten om de dynamiek van calciumsignalering te volgen. Verder beschrijft dit artikel de procedure voor virale injecties met tdTomato als een label voor neuronen. Dit maakt het mogelijk om veranderingen in de neuronale synaptische structuur te bepalen en /of de beschikbaarheid als een structurele marker die herhaalde beeldvorming van dezelfde astrocyte mogelijk maakt. Gedurende het hele protocol zullen cruciale stappen worden gemarkeerd om de best mogelijke kwaliteit van beelden verkregen uit multifotonenmicroscopie te garanderen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15o Pointed Blade</td>
			<td>Surgistar</td>
			<td>6500</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19 G Needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305186</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV1-CAG-FLEX-tdTomato</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>28306-AAV1</td>
			<td>Viral Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV1-CaMKII-0-4-Cre</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>105558-AAV1</td>
			<td>Viral Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acteone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A16P4</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol Prep Pads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Covidien 5750</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beveler</td>
			<td>Narishige</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbide Burs</td>
			<td>SS White Dental</td>
			<td>14717</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen (Rimadyl), 50 mg/mL</td>
			<td>Zoetis Mylan Institutional, LLC.</td>
			<td></td>
			<td>Drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed Air</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-022-523</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tip Applicators</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>836-WC NO BINDER</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass, No. 1 thickness, 3 mm/5 mm</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0720, 64-0700</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Drill</td>
			<td>Aseptico</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone, 4 mg/mL</td>
			<td>Mylan Institutional, LLC.</td>
			<td></td>
			<td>Drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duralay Liquid&#160; (dental cement liquid)</td>
			<td>Patterson Dental</td>
			<td>602-8518</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duralay Powder&#160; (dental cement powder)</td>
			<td>Patterson Dental</td>
			<td>602-7932</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrofloxacin, 2.27%</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td>Drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>17033-211-38</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Lite High Intensity Illuminator</td>
			<td>Dolan-Jenner Industries</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (Large)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14099</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (Small)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501764</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCaMP6f B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Stock No: 024105</td>
			<td>Mouse line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Germinator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Stock No: 012586</td>
			<td>Mouse Line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headplate</td>
			<td>Neurotar</td>
			<td>Model 1, Model 3</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501705</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holder for 15o Pointed Blade</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501247</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holder for Scalpel Blades</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500236</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine Prep Pads</td>
			<td>Avantor</td>
			<td>15648-926</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal</td>
			<td></td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane table top system with Induction Box</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Vaporizer</td>
			<td>SurgiVet</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>KG517</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite 401</td>
			<td>Henkel</td>
			<td>40140</td>
			<td>fast-curing instant adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite 454</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9194415</td>
			<td>cyanoacrylate adhesive gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen</td>
			<td>Matheson</td>
			<td>NI M200</td>
			<td>Gas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen</td>
			<td>Matheson</td>
			<td>OX M250</td>
			<td>Gas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer</td>
			<td>Parker</td>
			<td></td>
			<td>intracellular microinjection dispense system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014340</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Hair Trimmer</td>
			<td>Wahl</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline (0.9% Sodium Chloride)</td>
			<td>Med Vet International</td>
			<td>RX0.9NACL-30BAC</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades, Size 11</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4-111</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503667</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic Instrument</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugi Sponge Strips (sponge strips)</td>
			<td>Kettenbach Dental</td>
			<td>31002</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SURGIFOAM (gel foam)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>1972</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe with 26 G Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>309625</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T5648-1G</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti:Sapphire Laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Blanket</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylocaine MPF with Epinephrine (1:200,000), 10 mg/mL</td>
			<td>Fresenius Kabi USA</td>
			<td></td>
			<td>Drug</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implantation of a cranial window for repeated in vivo imaging in awake mice

Om de cellulaire fysiologie van neuronen en glia bij zich gedragende dieren volledig te begrijpen, is het noodzakelijk om hun morfologie te visualiseren en hun activiteit in vivo vast te leggen bij zich gedragende muizen. Dit artikel beschrijft een methode voor de implantatie van een chronisch schedelvenster om de longitudinale beeldvorming van hersencellen in wakkere, hoofdbevangen muizen mogelijk te maken. In combinatie met genetische strategieën en virale injecties is het mogelijk om specifieke cellen en interessante gebieden te labelen met structurele of fysiologische markers. Dit protocol laat zien hoe virale injecties kunnen worden gecombineerd om neuronen in de buurt van GCaMP6-tot expressie brengende astrocyten in de cortex te labelen voor gelijktijdige beeldvorming van beide cellen door een schedelvenster. Multifoton beeldvorming van dezelfde cellen kan dagen, weken of maanden worden uitgevoerd bij wakkere, zich gedragende dieren. Deze aanpak biedt onderzoekers een methode om cellulaire dynamica in realtime te bekijken en kan worden toegepast om een aantal vragen in de neurowetenschappen te beantwoorden.

De kwaliteit van het schedelvenster kan worden beoordeeld aan de hand van hoe helder de neuronale structuren eruit zien. In een goed venster zijn dendritische stekels duidelijk zichtbaar (figuur 1). Met de opgeslagen structurele en positionele gegevens kan hetzelfde dier dagen, weken of maanden herhaaldelijk in beeld worden gebracht om dezelfde cellen te onderzoeken (figuur 1). De beelden in figuur 1 zijn verkregen uit het voorpootg...

Watch this Scientific Journal Video about Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice at JoVE.com

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de implantatie van een chronisch schedelvenster voor de longitudinale beeldvorming van hersencellen in wakkere, hoofdbezorgde muizen.

Implantatie van een schedelvenster voor herhaalde in vivo beeldvorming bij wakkere muizen

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...

Het protocol beschrijft hoe virale injecties moeten worden uitgevoerd en een schedelvenster kan worden geïmplanteerd voor beeldvorming van hersencellen in wakkere, in bedwang gehouden muizen. Het voordeel van deze methode is dat de structuur en activiteit van neuronen en astrocyten herhaaldelijk in beeld kan worden gebracht gedurende meerdere sessies. Deze benadering kan worden gebruikt om te bepalen hoe neurale cellen worden veranderd in modellen van neurologische ontwikkelings- of neurodegeneratieve aandoeningen, of dat ervaringsafhankelijke plasticiteit is aangetast.Begin met het vastzetten van een verdoofde muis aan een stereotaxisch frame met behulp van de snuitklem en oorstaven. Snijd en verwijder met behulp van steriele chirurgische hulpmiddelen de huid van de frontale hechtingen vooraan bij de bregma tot achteraan bij lambda. Schraap met behulp van een steriel maat 11 koolstofstalen chirurgisch mes voorzichtig al het bindweefsel uit de schedel.Boor met behulp van een tandartsboor geleidelijk het schedelbot langs de omtrek van de opening in concentrische cirkels om zelfs het dunner worden van het bot te vergemakkelijken. Voeg na elke concentrische passage een druppel of twee zoutoplossing toe aan het geboorde gebied en laat de zoutoplossing minstens 10 seconden zitten voordat u het boren hervat. Druk voorzichtig op het centrale gedeelte van het schedelbot met een fijne tang om te controleren of de schedel voldoende verdund en beweegt.Zorg ervoor dat de onderliggende vasculatuur waar de boring plaatsvond intact is en dat het bot niet is gebarsten. Steek voorzichtig een miniatuur puntig mes van 15 graden in het verdunde bot en snijd en gebruik het gelschuim gedrenkt in zoutoplossing om eventuele bloedingen te stoppen. Til met behulp van een tang het bot voorzichtig op en verwijder het, zorg ervoor dat u de dura mater niet beschadigt.Vul voor de injectie een steriele afgeschuinde glazen pipet met een punt van 20 micrometer met het virusmengsel. Laat vervolgens de pipet zakken om het oppervlak van de hersenen aan te raken en blijf nog eens 200 tot 300 micrometer zakken voor laag 2/3-injecties. Met behulp van een intracellulair micro-injectiedoseersysteem het systeem 12 tot 15 keer gedurende twee minuten.Voor de implantatie van het schedelvenster plaatst u het dekglas over de opening in de schedel. Gebruik een tang om ervoor te zorgen dat het glas vlak over de opening gaat. Om de randen van het glazen venster naar de schedel af te dichten, brengt u cyanoacrylaatlijmgel aan rond de omtrek van het glasoppervlak.Breng over de zelfklevende gel een laag lijm aan. Voeg vervolgens een laag tandcementvloeistof toe. Wanneer tandcement uithardt, brengt u een dunne laag lijm aan rond de centrale opening van de kopplaat van het helikoptertype en plaatst u de kopplaat van het helikoptertype van de juiste grootte over het afdekglas.Laat de lijm drogen. Voeg tandcementpoeder toe in een microfugebuis van 1,5 milliliter tot de 0,1 milliliter. Meng zeven tot acht druppels snel uithardende instantlijm in het poeder en trek het resulterende mengsel in een spuit van één milliliter met een naald van 19 gauge die is gesneden om een grotere opening te creëren.Injecteer het poedermengsel door de zijgaten van de helikopterbalk totdat het van beide kanten sijpelt. Breng het tandcementlijmmengsel aan op de rest van de blootgestelde schedel om de hoofdplaat aan de schedel vast te maken. Wikkel de muis in doek en bevestig hem via de kopplaat aan de hoofdbevestigingsarm van de door de lucht verplaatste thuiskooi en laat de thuiskooi vervolgens blootgesteld aan licht.Na een gewenningstijd van 15 minuten haalt u de muis uit de thuiskooi. Gebruik de breedveldmodus van de microscoop om twee tot drie posities van gemakkelijk identificeerbare vasculatuur te selecteren. Sla de beelden van de bloedvaten op en noteer de x- en y-coördinaten die op de motorcontroller verschijnen.Stel je de synaptische structuren van neuronen en GCaMP6f-activiteit in astrocyten voor. In de representatieve analyse werd de kwaliteit van het schedelvenster geëvalueerd met herhaalde beeldvorming van dendrieten en GCaMP6f-tot expressie brengende astrocyten gedurende dagen. In een goed venster leken de neuronale structuren helder met duidelijk zichtbare dendritische stekels.Twee nieuwe stekels verschenen op dag twee van de beeldvorming. Slechts één wervelkolom hield aan en was zichtbaar op dag vijf. Calciumactiviteit werd bestudeerd in astrocyten die GCaMP6f op verschillende tijdstippen tot expressie brachten.Een wereldwijde gebeurtenis die de hele cel omvatte, was getuige tijdens een voortbewegingsaanval. De twee kritieke stappen van dit protocol zijn dat het bot voldoende moet worden verdund voordat het bot wordt verwijderd en dat het dekglas op de juiste manier over de opening wordt geplaatst. Beeldvorming kan worden gecombineerd met gedragsanalyse, hetzij tijdens beeldvorming, hetzij post-gedrag, zoals het leren van een nieuwe motorische vaardigheid, om te bepalen hoe neuronale en astrocytenstructuur en -functie wordt gemoduleerd door te leren.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Een dunne-schedel Window Techniek voor chronische Twee-foton In vivo Imaging Murine Microglia in modellen van ontstekingsprocessen

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

Multimodal Imaging van Stem Cell implantatie in het centrale zenuwstelsel van Muizen

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Functionele neuroimaging Met behulp van ultrasone bloed-hersen barrière verstoring en mangaan-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Verdund-schedel Corticale Venster Techniek voor<em&gt; In Vivo</em&gt; Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Laterale Chronische Cranial Window Voorbereiding Maakt<em&gt; In Vivo</em&gt; Observatie Na distale midden cerebrale slagader Occlusie in Muizen

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of ...

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal (PHASOR): A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal PHASOR: A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

Piezo hoge nauwkeurigheid chirurgische Osteal verwijdering (FASOR): Een techniek voor verbeterde craniale venster chirurgie in muizen

Multiphoton microscopy has been widely adapted for imaging neurons in vivo. Repeated imaging requires implantation of a cranial window or repeated ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

Implantatie van de laminectomie en het ruggenmerg in de muis

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Twee-foton beeldvorming van corticale neuronen in neonatale muizen

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium beeldvorming in muis inferieure olijf

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Construction and Implementation of Carbon Fiber Microelectrode Arrays for Chronic and Acute In Vivo Recordings

Construction and Implementation of Carbon Fiber Microelectrode Arrays for Chronic and Acute In Vivo Recordings

Constructie en implementatie van koolstofvezel micro-elektrode arrays voor chronische en acute in vivo opnames

Multichannel electrode arrays offer insight into the working brain and serve to elucidate neural processes at the single-cell and circuit levels. ...