Name: implantation of a cranial window for repeated in vivo imaging in awake mice
Uploaded: 2021-06-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice at JoVE.com

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות שאושרו על ידי IACUC במרכז הרפואי של אוניברסיטת נברסקה.
1. לפני הניתוח
<ol><li>הכינו פיפטות לזריקות ויראליות. משכו נימי זכוכית בורוסיליקט באמצעות מושך פיפטה ושפשפו את הפיפטה בזווית של 20 מעלות. לעקר את הפיפטות למשך הלילה.</li>
	<li>מכינים חתיכ...

<ol>
	<li>Cichon, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branch-specific+dendritic+Ca2++spikes+cause+persistent+synaptic+plasticity.">Branch-specific dendritic Ca2+ spikes cause persistent synaptic plasticity.</a> Nature. 520 (7546), 180-185 (2015).</li><li>Goncalves, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circuit+level+defects+in+the+developing+neocortex+of+Fragile+X+mice.">Circuit level defects in the developing neocortex of Fragile X mice.</a> Nature Neuroscience. 16 (7), 903-909 (2013).</li><li>Padmashri, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+structural+and+functional+synaptic+plasticity+with+motor+skill+learning+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Altered structural and functional synaptic plasticity with motor skill learning in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 33 (50), 19715-19723 (2013).</li><li>Peters, A. J., Chen, S. X., Komiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+reproducible+spatiotemporal+activity+during+motor+learning.">Emergence of reproducible spatiotemporal activity during motor learning.</a> Nature. 510 (7504), 263-267 (2014).</li><li>Poskanzer, K. E., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+regulate+cortical+state+switching+in+vivo.">Astrocytes regulate cortical state switching in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2675-2684 (2016).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++signaling+in+astrocytes+from+Ip3r2(-/-)+mice+in+brain+slices+and+during+startle+responses+in+vivo.">Ca2+ signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo.</a> Nature Neuroscience. 18 (5), 708-717 (2015).</li><li>Takata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+calcium+signaling+transforms+cholinergic+modulation+to+cortical+plasticity+in+vivo.">Astrocyte calcium signaling transforms cholinergic modulation to cortical plasticity in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 31 (49), 18155-18165 (2011).</li><li>Yang, G., Pan, F., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stably+maintained+dendritic+spines+are+associated+with+lifelong+memories.">Stably maintained dendritic spines are associated with lifelong memories.</a> Nature. 462 (7275), 920-924 (2009).</li><li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+long-term+dendritic+spine+stability+in+diverse+regions+of+cerebral+cortex.">Development of long-term dendritic spine stability in diverse regions of cerebral cortex.</a> Neuron. 46 (2), 181-189 (2005).</li><li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain.">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).</li><li>Isshiki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+synapse+remodelling+as+a+common+phenotype+in+mouse+models+of+autism.">Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism.</a> Nature Communications. 5, 4742 (2014).</li><li>Cruz-Martin, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+stabilization+of+dendritic+spines+in+fragile+X+mice.">Delayed stabilization of dendritic spines in fragile X mice.</a> Journal of Neuroscience. 30 (23), 7793-7803 (2010).</li><li>Mostany, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+synaptic+dynamics+during+normal+brain+aging.">Altered synaptic dynamics during normal brain aging.</a> Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).</li><li>Trachtenberg, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex.">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).</li><li>Agarwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+opening+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore+induces+microdomain+calcium+transients+in+astrocyte+processes.">Transient opening of the mitochondrial permeability transition pore induces microdomain calcium transients in astrocyte processes.</a> Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).</li><li>Bindocci, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+Ca2++imaging+advances+understanding+of+astrocyte+biology.">Three-dimensional Ca2+ imaging advances understanding of astrocyte biology.</a> Science. 356 (6339), (2017).</li><li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments.">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li><li>Han, S., Yang, W., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+volumetric+imaging+of+neuronal+activity+of+cortical+columns.">Two-color volumetric imaging of neuronal activity of cortical columns.</a> Cell Reports. 27 (7), 2229-2240 (2019).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo.">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li><li>Stowell, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noradrenergic+signaling+in+the+wakeful+state+inhibits+microglial+surveillance+and+synaptic+plasticity+in+the+mouse+visual+cortex.">Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Chen, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-specific+plasticity+of+inhibitory+circuits+in+motor+cortex+during+motor+learning.">Subtype-specific plasticity of inhibitory circuits in motor cortex during motor learning.</a> Nature Neuroscience. 18 (8), 1109-1115 (2015).</li><li>Stobart, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+circuit+activity+evokes+rapid+astrocyte+calcium+signals+on+a+similar+timescale+to+neurons.">Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons.</a> Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).</li><li>Matsui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+in+utero+electroporation:+controlled+spatiotemporal+gene+transfection.">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e3024 (2011).</li><li>Roth, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+synaptic+AMPA+receptor+plasticity+during+motor+learning.">Cortical synaptic AMPA receptor plasticity during motor learning.</a> Neuron. 105 (5), 895-908 (2020).</li><li>Stogsdill, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+neuroligins+control+astrocyte+morphogenesis+and+synaptogenesis.">Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis.</a> Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).</li><li>Suresh, A., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+synaptic+AMPAR+and+spine+dynamics:+impairments+in+the+FXS+mouse.">Relationship between synaptic AMPAR and spine dynamics: impairments in the FXS mouse.</a> Cerebral Cortex. 27 (8), 4244-4256 (2017).</li><li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+two-photon+imaging+of+synaptic+structures+in+the+cortex+of+awake+head-restrained+mice.">Transcranial two-photon imaging of synaptic structures in the cortex of awake head-restrained mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1010, 35-43 (2013).</li><li>Dombeck, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+large-scale+neural+activity+with+cellular+resolution+in+awake,+mobile+mice.">Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice.</a> Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).</li><li>Kislin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat-floored+air-lifted+platform:+a+new+method+for+combining+behavior+with+microscopy+or+electrophysiology+on+awake+freely+moving+rodents.">Flat-floored air-lifted platform: a new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (88), e51869 (2014).</li><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Hauglund, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meningeal+lymphangiogenesis+and+enhanced+glymphatic+activity+in+mice+with+chronically+implanted+EEG+electrodes.">Meningeal lymphangiogenesis and enhanced glymphatic activity in mice with chronically implanted EEG electrodes.</a> Journal of Neuroscience. 40 (11), 2371-2380 (2020).</li><li>De Paola, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+structural+plasticity+of+axonal+branches+and+boutons+in+the+adult+neocortex.">Cell type-specific structural plasticity of axonal branches and boutons in the adult neocortex.</a> Neuron. 49 (6), 861-875 (2006).</li><li>Cheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+two-photon+calcium+imaging+at+different+depths+with+spatiotemporal+multiplexing.">Simultaneous two-photon calcium imaging at different depths with spatiotemporal multiplexing.</a> Nature Methods. 8 (2), 139-142 (2011).</li><li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).</li><li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polished+and+reinforced+thinned-skull+window+for+long-term+imaging+of+the+mouse+brain.">A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), e3742 (2012).</li><li>Helm, P. J., Ottersen, O. P., Nase, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+optical+properties+of+the+mouse+cranium--implications+for+in+vivo+multi+photon+laser+scanning+microscopy.">Analysis of optical properties of the mouse cranium--implications for in vivo multi photon laser scanning microscopy.</a> Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 316-322 (2009).</li><li>Stobart, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+calcium+imaging+of+astrocytes+reveals+distinct+cellular+compartment+responses+to+sensory+stimulation.">Long-term in vivo calcium imaging of astrocytes reveals distinct cellular compartment responses to sensory stimulation.</a> Cerebral Cortex. 28 (1), 184-198 (2018).</li><li>Pryazhnikov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+two-photon+imaging+in+somatosensory+cortex+of+behaving+mice+reveals+dendritic+spine+formation+enhancement+by+subchronic+administration+of+low-dose+ketamine.">Longitudinal two-photon imaging in somatosensory cortex of behaving mice reveals dendritic spine formation enhancement by subchronic administration of low-dose ketamine.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6464 (2018).</li><li>Thrane, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+anesthesia+selectively+disrupts+astrocyte+calcium+signaling+in+the+awake+mouse+cortex.">General anesthesia selectively disrupts astrocyte calcium signaling in the awake mouse cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (46), 18974-18979 (2012).</li><li>Paukert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norepinephrine+controls+astroglial+responsiveness+to+local+circuit+activity.">Norepinephrine controls astroglial responsiveness to local circuit activity.</a> Neuron. 82 (6), 1263-1270 (2014).</li><li>Delekate, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabotropic+P2Y1+receptor+signalling+mediates+astrocytic+hyperactivity+in+vivo+in+an+Alzheimer's+disease+mouse+model.">Metabotropic P2Y1 receptor signalling mediates astrocytic hyperactivity in vivo in an Alzheimer's disease mouse model.</a> Nature Communications. 5, 5422 (2014).</li></ol>

כאן, הצגנו פרוטוקול להשתלה של חלונות גולגולתיים כרוניים להדמיית in vivo של אסטרוציטים בקליפת המוח ותאי עצב בעכברים ערים ומרוסנים על הראש על כלוב ביתי מורם באוויר. דוגמאות ספציפיות סופקו ליישום חלון הגולגולת להדמיית אסטרוציטים המבטאים GECIs ומבנים סינפטיים עצביים. עם השימוש במיקרוסקופיי?...

היכולת לבצע מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מרובת-פוטונים in vivo בקליפת המוח של עכברים היא בעלת חשיבות עליונה לחקר האיתות והמבנה התאי 1,2,3,4,5,6,7,8,9, פתולוגיה של מחלות 10,11 והתפתחות תאית12,13 . עם השתלת חלונות גולגולתיים כרוניים, הדמיה אורכית אפשרית, המאפשרת הדמיה חוזרת ונשנית של אזורים בקליפת המוח במשך ימים, שבועות או חודשים13,14 בבעלי חיים. מיקרוסקופיית מולטיפוטונים אידיאלית להדמיה חוזרת ונשנית של in vivo בגלל בדיקת עומק משופרת ופוטו-דאמג' מופחת הקשור ללייזר האינפרא אדום שבו נעשה שימוש. זה מאפשר מחקר של דינמיקה מולקולרית ותאית של תאים ספציפיים באזורים שונים בקליפת המוח.
מיקרוסקופיית מולטיפוטונים שימשה להדמיית in vivo של תאי עצב וגלייה בעכברים 15,16,17,18,19,20. ניתן ליישם אסטרטגיות שונות כדי לתייג סוגי תאים ותחומי עניין מסוימים. גישה נפוצה אחת היא להניע את הביטוי של חלבונים פלואורסצנטיים המקודדים גנטית באופן ספציפי לתא באמצעות מערכת הרקומבינציה Cre-Lox. זה יכול להתבצע עם עכברים מהונדסים גנטית, למשל, חציית עכבר tdTomato "floxed" (Ai14) עם עכבר המבטא Cre-recombinase תחת מקדם של עניין21. לחלופין, ניתן להשיג תיוג ספציפי לתא ולאתר באמצעות זריקות ויראליות. כאן, וירוס המקודד Cre רקומבינאז תחת מקדם ספציפי לתא ונגיף המקודד גן מעניין של floxed מוזרקים לאזור מוגדר. סוגי תאים מתאימים המקבלים את שני הווקטורים הנגיפיים יבטאו את הגנים הרצויים. גנים אלה יכולים להיות סמנים מבניים, כגון tdTomato, כדי לראות שינויים במורפולוגיה התאית22 או באינדיקטורים לסידן המקודדים גנטית (GECIs), כגון GCaMP ו/או RCaMP, כדי לבחון את הדינמיקה של סידן23. שיטות של רקומבינציה גנטית ניתן ליישם בנפרד או בשילוב כדי לתייג סוג אחד או יותר של תאים. גישה שלישית, שאינה דורשת עכברים מהונדסים או מבנים נגיפיים (שיש להם קיבולת אריזה מוגבלת), היא אלקטרופורציה של רחם של מבני דנ"א24. בהתאם לתזמון האלקטרופורציה, ניתן לכוון לסוגי תאים שונים 25,26,27.
בעת ביצוע הדמיית מולטיפוטונים, ניתן לצלם עכברים כשהם ערים או מרדימים. הדמיה של עכברים ערים יכולה להתבצע על ידי אבטחת העכבר באמצעות לוחית ראש מחוברת28. גישה זו הופכת לפחות מלחיצה בכך שהיא מאפשרת תנועה חופשית יחסית של החיה באמצעות שיטות, כגון כדורי קלקר29 צפים חופשיים ונתמכים באוויר, הליכונים צפים חופשיים1, או מערכת כלובים ביתית מורמת אוויר שבה העכברים מהודקים על ידי לוחית ראש מחוברת ומותר להם לנוע בתא פתוח30. עבור כל אחד מתנאי ההדמיה הללו, יהיה צורך תחילה להרגיל את העכברים למערך ההדמיה. מאמר זה מתאר את הליך ההרגלה וההדמיה באמצעות מערכת כלוב ביתית מורמת אוויר.
פרוטוקול זה מתאר השתלה של חלון גולגולתי כרוני להדמיית in vivo אורכית בקליפת המוח. כאן, נשתמש בעכברים המבטאים באופן מותנה GCaMP6f באסטרוציטים כדי לנטר את הדינמיקה של איתות סידן. יתר על כן, מאמר זה מתאר את ההליך עבור זריקות ויראליות באמצעות tdTomato כתווית עבור נוירונים. זה מאפשר לקבוע את השינויים במבנה הסינפטי העצבי ו /או את הזמינות כסמן מבני המאפשר הדמיה חוזרת ונשנית של אותו אסטרוציט. לאורך הפרוטוקול, יודגשו צעדים חיוניים כדי להבטיח את האיכות הטובה ביותר האפשרית של תמונות המתקבלות ממיקרוסקופיית מולטי-פוטון.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15o Pointed Blade</td>
			<td>Surgistar</td>
			<td>6500</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19 G Needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305186</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV1-CAG-FLEX-tdTomato</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>28306-AAV1</td>
			<td>Viral Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV1-CaMKII-0-4-Cre</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>105558-AAV1</td>
			<td>Viral Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acteone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A16P4</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol Prep Pads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Covidien 5750</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beveler</td>
			<td>Narishige</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbide Burs</td>
			<td>SS White Dental</td>
			<td>14717</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen (Rimadyl), 50 mg/mL</td>
			<td>Zoetis Mylan Institutional, LLC.</td>
			<td></td>
			<td>Drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed Air</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-022-523</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tip Applicators</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>836-WC NO BINDER</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass, No. 1 thickness, 3 mm/5 mm</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0720, 64-0700</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Drill</td>
			<td>Aseptico</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone, 4 mg/mL</td>
			<td>Mylan Institutional, LLC.</td>
			<td></td>
			<td>Drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duralay Liquid&#160; (dental cement liquid)</td>
			<td>Patterson Dental</td>
			<td>602-8518</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duralay Powder&#160; (dental cement powder)</td>
			<td>Patterson Dental</td>
			<td>602-7932</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrofloxacin, 2.27%</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td>Drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>17033-211-38</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Lite High Intensity Illuminator</td>
			<td>Dolan-Jenner Industries</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (Large)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14099</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (Small)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501764</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCaMP6f B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Stock No: 024105</td>
			<td>Mouse line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Germinator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Stock No: 012586</td>
			<td>Mouse Line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headplate</td>
			<td>Neurotar</td>
			<td>Model 1, Model 3</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501705</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holder for 15o Pointed Blade</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501247</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holder for Scalpel Blades</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500236</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine Prep Pads</td>
			<td>Avantor</td>
			<td>15648-926</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal</td>
			<td></td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane table top system with Induction Box</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Vaporizer</td>
			<td>SurgiVet</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>KG517</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite 401</td>
			<td>Henkel</td>
			<td>40140</td>
			<td>fast-curing instant adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite 454</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9194415</td>
			<td>cyanoacrylate adhesive gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen</td>
			<td>Matheson</td>
			<td>NI M200</td>
			<td>Gas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen</td>
			<td>Matheson</td>
			<td>OX M250</td>
			<td>Gas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer</td>
			<td>Parker</td>
			<td></td>
			<td>intracellular microinjection dispense system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014340</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Hair Trimmer</td>
			<td>Wahl</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline (0.9% Sodium Chloride)</td>
			<td>Med Vet International</td>
			<td>RX0.9NACL-30BAC</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades, Size 11</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4-111</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503667</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic Instrument</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugi Sponge Strips (sponge strips)</td>
			<td>Kettenbach Dental</td>
			<td>31002</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SURGIFOAM (gel foam)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>1972</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe with 26 G Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>309625</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T5648-1G</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti:Sapphire Laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Blanket</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylocaine MPF with Epinephrine (1:200,000), 10 mg/mL</td>
			<td>Fresenius Kabi USA</td>
			<td></td>
			<td>Drug</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implantation of a cranial window for repeated in vivo imaging in awake mice

כדי להבין באופן מלא את הפיזיולוגיה התאית של נוירונים וגליה בבעלי חיים מתנהגים, יש צורך לדמיין את המורפולוגיה שלהם ולתעד את פעילותם in vivo בעכברים מתנהגים. מאמר זה מתאר שיטה להשתלת חלון גולגולת כרוני כדי לאפשר הדמיה אורכית של תאי מוח בעכברים ערים ומרוסנים ראש. בשילוב עם אסטרטגיות גנטיות וזריקות ויראליות, ניתן לסמן תאים ואזורי עניין ספציפיים עם סמנים מבניים או פיזיולוגיים. פרוטוקול זה מדגים כיצד לשלב זריקות נגיפיות כדי לתייג נוירונים בקרבת אסטרוציטים המבטאים GCaMP6 בקליפת המוח להדמיה סימולטנית של שני התאים דרך חלון גולגולת. הדמיה מרובת-פוטון של אותם תאים יכולה להתבצע במשך ימים, שבועות או חודשים בבעלי חיים ערים ומתנהגים. גישה זו מספקת לחוקרים שיטה לצפייה בדינמיקה התאית בזמן אמת וניתן ליישם אותה כדי לענות על מספר שאלות במדעי המוח.

ניתן להעריך את איכות חלון הגולגולת על ידי עד כמה חדים המבנים העצביים. בחלון טוב, קוצים דנדריטיים נראים בבירור (איור 1). עם הנתונים המבניים והמיקום המאוחסנים, ניתן לצלם את אותה חיה שוב ושוב במשך ימים, שבועות או חודשים כדי לבחון את אותם תאים (איור 1). התמונות <strong ...

Watch this Scientific Journal Video about Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice at JoVE.com

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

מוצג כאן פרוטוקול להשתלת חלון גולגולתי כרוני להדמיה אורכית של תאי מוח בעכברים ערים ומרוסנים ראש.

השתלת חלון גולגולת להדמיה חוזרת ונשנית In Vivo בעכברים ערים

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...

הפרוטוקול מתאר כיצד לבצע זריקות ויראליות ולהשתיל חלון גולגולתי להדמיה של תאי מוח בעכברים ערים ומרוסנים בראש. היתרון של שיטה זו הוא שניתן לדמות שוב ושוב את המבנה והפעילות של נוירונים ואסטרוציטים במשך מספר הפעלות. ניתן להשתמש בגישה זו כדי לקבוע כיצד תאים עצביים משתנים במודלים של הפרעות נוירו-התפתחותיות, או נוירודגנרטיביות, או אם פלסטיות תלוית ניסיון נפגעת.התחל על ידי אבטחת עכבר מורדם למסגרת סטריאוטקסית באמצעות מהדק החוטם ומוטות האוזניים. באמצעות כלים כירורגיים סטריליים, חותכים ומסירים את העור מהתפרים הקדמיים לברגמא לברגמא לגבדה. באמצעות להב כירורגי סטרילי בגודל 11 פלדת פחמן, לגרד בעדינות את כל רקמת החיבור מהגולגולת.בעזרת מקדחה דנטלית, קודחים בהדרגה את עצם הגולגולת לאורך קווי המתאר של הפתח במעגלים קונצנטריים כדי להקל אפילו על דילול העצם. לאחר כל מעבר קונצנטרי, הוסיפו טיפה, או שתיים של מי מלח לאזור שנקדח, ואפשרו למלח לשבת לפחות 10 שניות לפני חידוש הקידוח. לחץ בעדינות על האזור המרכזי של עצם הגולגולת עם מלקחיים עדינים כדי לבדוק שהגולגולת מדוללת כראוי ונעה.ודא כי כלי הדם הבסיסי שבו התרחש הקידוח הוא שלם, וכי העצם אינה סדוקה. הכניסו בזהירות להב מחודד מיניאטורי של 15 מעלות לתוך העצם הדלילה וחתכו והשתמשו בקצף הג'ל הספוג במי מלח כדי לעצור את כל הדימומים שעלולים להתרחש. באמצעות מלקחיים, בזהירות להרים ולהסיר את העצם, תוך הקפדה לא לפגוע במטר הדורה.לצורך ההזרקה, מלאו פיפטת זכוכית משופעת סטרילית עם קצה של 20 מיקרומטר עם תערובת הנגיף. לאחר מכן הנמיכו את הפיפטה כדי לגעת במשטח המוח, והמשיכו להוריד למשך 200 עד 300 מיקרומטר נוספים לזריקות שכבה 2/3. באמצעות מערכת מיקרו-אינטגרטיבית תוך-תאית, הלחץ להזריק את המערכת 12 עד 15 פעמים במשך שתי דקות.עבור השתלת חלון הגולגולת, הניחו את זכוכית הכיסוי מעל הפתח בגולגולת. השתמשו במלקחיים כדי לוודא שהזכוכית נשטפת מעל הפתח. כדי לאטום את קצוות חלון הזכוכית לגולגולת, יש למרוח ג'ל דבק ציאנואקרילט סביב היקף משטח הזכוכית.מעל ג'ל ההדבקה, יש למרוח שכבת דבק. לאחר מכן מוסיפים שכבה של נוזל מלט דנטלי. כאשר מלט דנטלי מתקשה, יש למרוח שכבה דקה של דבק סביב הפתח המרכזי של לוחית הראש מסוג מסוק, ולהניח את לוחית הראש מסוג מסוק בגודל המתאים מעל זכוכית הכיסוי.אפשרו לדבק להתייבש. הוסיפו אבקת צמנט דנטלית בצינור מיקרופוג' של 1.5 מיליליטר עד ל-0.1 מיליליטר. יש לערבב שבע עד שמונה טיפות של דבק אינסטנט מהיר לאבקה, ולמשוך את התערובת המתקבלת למזרק של מיליליטר אחד עם מחט של 19 מדים שנחתכה כדי ליצור פתח גדול יותר.הזריקו את תערובת האבקה דרך החורים הצדדיים של מוט המסוק עד שהיא מחלחלת משני הצדדים. יש למרוח את תערובת דבק המלט הדנטלי על שאר הגולגולת החשופה כדי להדק את צלחת הראש לגולגולת. עוטפים את העכבר בבד, מהדקים אותו באמצעות צלחת הראש שלו לזרוע הקיבועית של הכלוב הביתי המוטס, ואז משאירים את הכלוב הביתי חשוף לאור.לאחר זמן הרגלה של 15 דקות, הסר את העכבר מהכלוב הביתי. באמצעות מצב השדה הרחב של המיקרוסקופ, בחר שניים עד שלושה מיקומים של כלי דם הניתנים לזיהוי בקלות. שמור את התמונות של כלי הדם, ורשם את הקואורדינטות x ו- y המופיעות בבקר המנוע.דמיין את המבנים הסינפטיים של נוירונים, ואת פעילות GCaMP6f באסטרוציטים. בניתוח הייצוגי, איכות חלון הגולגולת הוערכה באמצעות הדמיה חוזרת ונשנית של דנדריטים ואסטרוציטים המבטאים GCaMP6f לאורך ימים. בחלון טוב, המבנים העצביים נראו חדים עם קוצים דנדריטיים גלויים בבירור.שני קוצים חדשים הופיעו ביום השני של ההדמיה. רק עמוד שדרה אחד התמיד ונראה ביום החמישי. פעילות הסידן נחקרה באסטרוציטים המבטאים GCaMP6f בנקודות זמן שונות.אירוע עולמי שהקיף את התא כולו נצפה במהלך התקף תנועה. שני השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה הם שיש לדלל את העצם כראוי לפני הסרת העצם, ואת המיקום הנכון של זכוכית הכיסוי מעל הפתח. הדמיה יכולה להיות משולבת עם ניתוח התנהגותי, במהלך הדמיה, או לאחר התנהגות, כגון למידת מיומנות מוטורית חדשה, כדי לקבוע כיצד המבנה והתפקוד של נוירונים ואסטרוציטים מווסתים על ידי למידה.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

הגולגולת דק חלון טכניקה כרונית דו פוטון ב-vivo הדמיה של microglia Murine של מודלים של Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

Multimodal הדמיה של השתלת תא גזע במערכת העצבים המרכזית של עכברים

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

הדמייה תפקודית באמצעות שיבוש Ultrasonic הדם למוח הגדר מנגן משופרת MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

טכניקת חלון קליפת מוח, גולגולת דקה יותר עבור<em&gt; In Vivo</em&gt; טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית הדמיה

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

הכנת חלון גולגולת כרוני לרוחב מאפשרת<em&gt; In vivo</em&gt; תצפית בעקבות העורקים התיכון ספיגה מוחין דיסטלי של עכברים

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of ...

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal (PHASOR): A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal PHASOR: A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

Piezo גבוהה דיוק Osteal הסרה כירורגית (פאזור): שיטה לניתוח חלון הגולגולת משופרת בעכברים

Multiphoton microscopy has been widely adapted for imaging neurons in vivo. Repeated imaging requires implantation of a cranial window or repeated ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

כריתת למינציה ואת חוט השדרה חלון השרשה בעכבר

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

אין ויוו שני הפוטונים הדמיה של נוירונים בקליפת המוח בעכברים Neonatal

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

אין ויוו הדמיית סידן בעכבר זית נחות

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Construction and Implementation of Carbon Fiber Microelectrode Arrays for Chronic and Acute In Vivo Recordings

Construction and Implementation of Carbon Fiber Microelectrode Arrays for Chronic and Acute In Vivo Recordings

הקמה ויישום של מערכי מיקרו-ectrode סיבי פחמן להקלטות כרוניות וחריפות ב-Vivo

Multichannel electrode arrays offer insight into the working brain and serve to elucidate neural processes at the single-cell and circuit levels. ...