Name: implantation of a cranial window for repeated in vivo imaging in awake mice
Uploaded: 2021-06-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice at JoVE.com

모든 동물 실험은 네브래스카 대학 의료 센터에서 IACUC가 승인 한 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 수술 전
<ol><li>바이러스 주사를위한 피펫을 준비하십시오. 피펫 풀러를 사용하여 붕규산염 유리 모세혈관을 당기고 피펫을 20° 각도로 비스듬히 기울입니다. 피펫을 밤새 살균하십시오.</li>
	<li>멸균 젤 폼의 신선한 조각을 작은 사각형으로 절단하여 준비하십시오. 겔 폼을 0.5 m...

<ol>
	<li>Cichon, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branch-specific+dendritic+Ca2++spikes+cause+persistent+synaptic+plasticity.">Branch-specific dendritic Ca2+ spikes cause persistent synaptic plasticity.</a> Nature. 520 (7546), 180-185 (2015).</li><li>Goncalves, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circuit+level+defects+in+the+developing+neocortex+of+Fragile+X+mice.">Circuit level defects in the developing neocortex of Fragile X mice.</a> Nature Neuroscience. 16 (7), 903-909 (2013).</li><li>Padmashri, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+structural+and+functional+synaptic+plasticity+with+motor+skill+learning+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Altered structural and functional synaptic plasticity with motor skill learning in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 33 (50), 19715-19723 (2013).</li><li>Peters, A. J., Chen, S. X., Komiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+reproducible+spatiotemporal+activity+during+motor+learning.">Emergence of reproducible spatiotemporal activity during motor learning.</a> Nature. 510 (7504), 263-267 (2014).</li><li>Poskanzer, K. E., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+regulate+cortical+state+switching+in+vivo.">Astrocytes regulate cortical state switching in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2675-2684 (2016).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++signaling+in+astrocytes+from+Ip3r2(-/-)+mice+in+brain+slices+and+during+startle+responses+in+vivo.">Ca2+ signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo.</a> Nature Neuroscience. 18 (5), 708-717 (2015).</li><li>Takata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+calcium+signaling+transforms+cholinergic+modulation+to+cortical+plasticity+in+vivo.">Astrocyte calcium signaling transforms cholinergic modulation to cortical plasticity in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 31 (49), 18155-18165 (2011).</li><li>Yang, G., Pan, F., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stably+maintained+dendritic+spines+are+associated+with+lifelong+memories.">Stably maintained dendritic spines are associated with lifelong memories.</a> Nature. 462 (7275), 920-924 (2009).</li><li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+long-term+dendritic+spine+stability+in+diverse+regions+of+cerebral+cortex.">Development of long-term dendritic spine stability in diverse regions of cerebral cortex.</a> Neuron. 46 (2), 181-189 (2005).</li><li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain.">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).</li><li>Isshiki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+synapse+remodelling+as+a+common+phenotype+in+mouse+models+of+autism.">Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism.</a> Nature Communications. 5, 4742 (2014).</li><li>Cruz-Martin, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+stabilization+of+dendritic+spines+in+fragile+X+mice.">Delayed stabilization of dendritic spines in fragile X mice.</a> Journal of Neuroscience. 30 (23), 7793-7803 (2010).</li><li>Mostany, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+synaptic+dynamics+during+normal+brain+aging.">Altered synaptic dynamics during normal brain aging.</a> Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).</li><li>Trachtenberg, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex.">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).</li><li>Agarwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+opening+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore+induces+microdomain+calcium+transients+in+astrocyte+processes.">Transient opening of the mitochondrial permeability transition pore induces microdomain calcium transients in astrocyte processes.</a> Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).</li><li>Bindocci, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+Ca2++imaging+advances+understanding+of+astrocyte+biology.">Three-dimensional Ca2+ imaging advances understanding of astrocyte biology.</a> Science. 356 (6339), (2017).</li><li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments.">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li><li>Han, S., Yang, W., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+volumetric+imaging+of+neuronal+activity+of+cortical+columns.">Two-color volumetric imaging of neuronal activity of cortical columns.</a> Cell Reports. 27 (7), 2229-2240 (2019).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo.">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li><li>Stowell, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noradrenergic+signaling+in+the+wakeful+state+inhibits+microglial+surveillance+and+synaptic+plasticity+in+the+mouse+visual+cortex.">Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Chen, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-specific+plasticity+of+inhibitory+circuits+in+motor+cortex+during+motor+learning.">Subtype-specific plasticity of inhibitory circuits in motor cortex during motor learning.</a> Nature Neuroscience. 18 (8), 1109-1115 (2015).</li><li>Stobart, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+circuit+activity+evokes+rapid+astrocyte+calcium+signals+on+a+similar+timescale+to+neurons.">Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons.</a> Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).</li><li>Matsui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+in+utero+electroporation:+controlled+spatiotemporal+gene+transfection.">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e3024 (2011).</li><li>Roth, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+synaptic+AMPA+receptor+plasticity+during+motor+learning.">Cortical synaptic AMPA receptor plasticity during motor learning.</a> Neuron. 105 (5), 895-908 (2020).</li><li>Stogsdill, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+neuroligins+control+astrocyte+morphogenesis+and+synaptogenesis.">Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis.</a> Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).</li><li>Suresh, A., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+synaptic+AMPAR+and+spine+dynamics:+impairments+in+the+FXS+mouse.">Relationship between synaptic AMPAR and spine dynamics: impairments in the FXS mouse.</a> Cerebral Cortex. 27 (8), 4244-4256 (2017).</li><li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+two-photon+imaging+of+synaptic+structures+in+the+cortex+of+awake+head-restrained+mice.">Transcranial two-photon imaging of synaptic structures in the cortex of awake head-restrained mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1010, 35-43 (2013).</li><li>Dombeck, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+large-scale+neural+activity+with+cellular+resolution+in+awake,+mobile+mice.">Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice.</a> Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).</li><li>Kislin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat-floored+air-lifted+platform:+a+new+method+for+combining+behavior+with+microscopy+or+electrophysiology+on+awake+freely+moving+rodents.">Flat-floored air-lifted platform: a new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (88), e51869 (2014).</li><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Hauglund, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meningeal+lymphangiogenesis+and+enhanced+glymphatic+activity+in+mice+with+chronically+implanted+EEG+electrodes.">Meningeal lymphangiogenesis and enhanced glymphatic activity in mice with chronically implanted EEG electrodes.</a> Journal of Neuroscience. 40 (11), 2371-2380 (2020).</li><li>De Paola, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+structural+plasticity+of+axonal+branches+and+boutons+in+the+adult+neocortex.">Cell type-specific structural plasticity of axonal branches and boutons in the adult neocortex.</a> Neuron. 49 (6), 861-875 (2006).</li><li>Cheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+two-photon+calcium+imaging+at+different+depths+with+spatiotemporal+multiplexing.">Simultaneous two-photon calcium imaging at different depths with spatiotemporal multiplexing.</a> Nature Methods. 8 (2), 139-142 (2011).</li><li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).</li><li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polished+and+reinforced+thinned-skull+window+for+long-term+imaging+of+the+mouse+brain.">A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), e3742 (2012).</li><li>Helm, P. J., Ottersen, O. P., Nase, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+optical+properties+of+the+mouse+cranium--implications+for+in+vivo+multi+photon+laser+scanning+microscopy.">Analysis of optical properties of the mouse cranium--implications for in vivo multi photon laser scanning microscopy.</a> Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 316-322 (2009).</li><li>Stobart, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+calcium+imaging+of+astrocytes+reveals+distinct+cellular+compartment+responses+to+sensory+stimulation.">Long-term in vivo calcium imaging of astrocytes reveals distinct cellular compartment responses to sensory stimulation.</a> Cerebral Cortex. 28 (1), 184-198 (2018).</li><li>Pryazhnikov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+two-photon+imaging+in+somatosensory+cortex+of+behaving+mice+reveals+dendritic+spine+formation+enhancement+by+subchronic+administration+of+low-dose+ketamine.">Longitudinal two-photon imaging in somatosensory cortex of behaving mice reveals dendritic spine formation enhancement by subchronic administration of low-dose ketamine.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6464 (2018).</li><li>Thrane, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+anesthesia+selectively+disrupts+astrocyte+calcium+signaling+in+the+awake+mouse+cortex.">General anesthesia selectively disrupts astrocyte calcium signaling in the awake mouse cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (46), 18974-18979 (2012).</li><li>Paukert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norepinephrine+controls+astroglial+responsiveness+to+local+circuit+activity.">Norepinephrine controls astroglial responsiveness to local circuit activity.</a> Neuron. 82 (6), 1263-1270 (2014).</li><li>Delekate, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabotropic+P2Y1+receptor+signalling+mediates+astrocytic+hyperactivity+in+vivo+in+an+Alzheimer's+disease+mouse+model.">Metabotropic P2Y1 receptor signalling mediates astrocytic hyperactivity in vivo in an Alzheimer's disease mouse model.</a> Nature Communications. 5, 5422 (2014).</li></ol>

여기에서, 우리는 공중 들어 올린 홈 케이지에 깨어 있고 머리가 억제 된 마우스에서 피질 성상 세포 및 뉴런의 생체 내 이미징을위한 만성 두개골 창문을 이식하기위한 프로토콜을 제시했습니다. 구체적인 예가 GECIs 및 뉴런 시냅스 구조를 발현하는 성상세포를 영상화하기 위한 두개골 창 응용의 제공되었다. 다중 광자 현미경을 사용하면 천체 칼슘 신호 역학 및 구조적 시냅스 역학을 며?...

마우스의 피질에서 생체 내 다광자 형광 현미경을 수행하는 능력은 세포 신호 전달 및 구조 1,2,3,4,5,6,7,8,9, 질병 병리학 10,11 및 세포 발달 12,13에 대한 연구에 가장 중요합니다. . 만성 두개골 창문을 이식하면 종방향 이미징이 가능하여 살아있는 동물에서 며칠, 몇 주 또는 몇 달 동안 피질 부위를 반복적으로 이미징 할 수 있습니다13,14. 다중 광자 현미경 검사는 적외선 레이저와 관련된 향상된 깊이 프로빙 및 감소 된 광손상으로 인해 생체 내에서 반복적 인 이미징에 이상적입니다. 이것은 다양한 피질 영역에서 특정 세포의 분자 및 세포 역학에 대한 연구를 가능하게합니다.
다중 광자 현미경 검사는 마우스 15,16,17,18,19,20에서 신경 및 신경교 세포의 생체 내 영상화에 사용되어 왔다. 특정 세포 유형 및 관심 영역을 라벨링하기 위해 다양한 전략이 구현될 수 있다. 하나의 일반적인 접근법은 Cre-Lox 재조합 시스템을 사용하여 세포 특이적 방식으로 유전적으로 코딩된 형광 단백질의 발현을 유도하는 것이다. 이는 유전적으로 변형된 마우스, 예를 들어, 관심있는 프로모터 21 하에 Cre-recombinase를 발현하는 마우스와 tdTomato "floxed" 마우스 (Ai14)를 교차시킴으로써 수행될 수 있다. 대안적으로, 세포- 및 부위-특이적 표지는 바이러스 주사로 달성될 수 있다. 여기서, Cre 재조합효소를 코딩하는 바이러스는 세포 특이적 프로모터 및 관심의 플록스 유전자를 코딩하는 바이러스 하에 정의된 영역에 주입된다. 두 바이러스 벡터 모두를 수용하는 적절한 세포 유형은 이어서 원하는 유전자(들)를 발현할 것이다. 이들 유전자는 tdTomato와 같은 구조적 마커로서 세포 형태학(22)의 변화를 보기 위해, 칼슘 역학(23)을 검사하기 위해 GCaMP 및/또는 RCaMP와 같은 유전적으로 암호화된 칼슘 지표(GECIs)일 수 있다. 유전적 재조합의 방법은 하나 이상의 세포 유형을 표지하기 위해 개별적으로 또는 조합하여 적용될 수 있다. 트랜스제닉 마우스 또는 바이러스 구축물(제한된 패키징 용량을 갖는)을 필요로 하지 않는 세 번째 접근법은 DNA 구축물(24)의 utero 전기천공에 있다. 전기천공의 타이밍에 따라, 상이한 셀 타입들이 표적화될 수 있다(25,26,27).
다중 광자 이미징을 수행 할 때, 마우스는 깨어 있거나 마취되는 동안 이미징 될 수 있습니다. 깨어 있는 마우스의 이미징은 부착된 헤드 플레이트(28)를 통해 마우스를 고정시킴으로써 수행될 수 있다. 이러한 접근법은 자유 부유, 공기 지지형 스티로폼 볼(29), 자유 유동 러닝머신(1), 또는 마우스가 부착된 헤드 플레이트에 의해 고정되고 개방된 챔버(30)에서 이동하도록 허용하는 공랭식 홈 케이지 시스템과 같은 방법을 사용하여 동물의 비교적 자유로운 이동을 허용함으로써 스트레스를 덜 받는다. 이러한 각각의 이미징 조건에 대해, 먼저 이미징 셋업에 마우스를 습관화하는 것이 필요할 것이다. 이 백서에서는 공수 홈 케이지 시스템을 사용한 습관화 및 이미징 절차에 대해 설명합니다.
이 프로토콜은 피질에서 종방향 생체내 영상화를 위한 만성 두개골 창의 이식을 기술한다. 여기에서는 성상세포에서 GCaMP6f를 조건부로 발현하는 마우스를 사용하여 칼슘 신호 역학을 모니터링합니다. 또한,이 논문은 tdTomato를 뉴런의 라벨로 사용하는 바이러스 주사 절차를 설명합니다. 이것은 뉴런 시냅스 구조의 변화 및/또는 동일한 성상세포의 반복적인 이미징을 가능하게 하는 구조적 마커로서의 유용성을 결정할 수 있게 한다. 프로토콜 전반에 걸쳐 다중 광자 현미경에서 얻은 최상의 이미지 품질을 보장하기 위해 중요한 단계가 강조 표시됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15o Pointed Blade</td>
			<td>Surgistar</td>
			<td>6500</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19 G Needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305186</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV1-CAG-FLEX-tdTomato</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>28306-AAV1</td>
			<td>Viral Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV1-CaMKII-0-4-Cre</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>105558-AAV1</td>
			<td>Viral Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acteone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A16P4</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol Prep Pads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Covidien 5750</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beveler</td>
			<td>Narishige</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbide Burs</td>
			<td>SS White Dental</td>
			<td>14717</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen (Rimadyl), 50 mg/mL</td>
			<td>Zoetis Mylan Institutional, LLC.</td>
			<td></td>
			<td>Drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed Air</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-022-523</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tip Applicators</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>836-WC NO BINDER</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass, No. 1 thickness, 3 mm/5 mm</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0720, 64-0700</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Drill</td>
			<td>Aseptico</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone, 4 mg/mL</td>
			<td>Mylan Institutional, LLC.</td>
			<td></td>
			<td>Drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duralay Liquid&#160; (dental cement liquid)</td>
			<td>Patterson Dental</td>
			<td>602-8518</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duralay Powder&#160; (dental cement powder)</td>
			<td>Patterson Dental</td>
			<td>602-7932</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrofloxacin, 2.27%</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td>Drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>17033-211-38</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Lite High Intensity Illuminator</td>
			<td>Dolan-Jenner Industries</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (Large)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14099</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (Small)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501764</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCaMP6f B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Stock No: 024105</td>
			<td>Mouse line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Germinator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Stock No: 012586</td>
			<td>Mouse Line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headplate</td>
			<td>Neurotar</td>
			<td>Model 1, Model 3</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501705</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holder for 15o Pointed Blade</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501247</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holder for Scalpel Blades</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500236</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine Prep Pads</td>
			<td>Avantor</td>
			<td>15648-926</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal</td>
			<td></td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane table top system with Induction Box</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Vaporizer</td>
			<td>SurgiVet</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>KG517</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite 401</td>
			<td>Henkel</td>
			<td>40140</td>
			<td>fast-curing instant adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite 454</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9194415</td>
			<td>cyanoacrylate adhesive gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen</td>
			<td>Matheson</td>
			<td>NI M200</td>
			<td>Gas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen</td>
			<td>Matheson</td>
			<td>OX M250</td>
			<td>Gas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer</td>
			<td>Parker</td>
			<td></td>
			<td>intracellular microinjection dispense system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014340</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Hair Trimmer</td>
			<td>Wahl</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline (0.9% Sodium Chloride)</td>
			<td>Med Vet International</td>
			<td>RX0.9NACL-30BAC</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades, Size 11</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4-111</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503667</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic Instrument</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugi Sponge Strips (sponge strips)</td>
			<td>Kettenbach Dental</td>
			<td>31002</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SURGIFOAM (gel foam)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>1972</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe with 26 G Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>309625</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T5648-1G</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti:Sapphire Laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Blanket</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylocaine MPF with Epinephrine (1:200,000), 10 mg/mL</td>
			<td>Fresenius Kabi USA</td>
			<td></td>
			<td>Drug</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implantation of a cranial window for repeated in vivo imaging in awake mice

행동하는 동물에서 뉴런과 글리아교의 세포 생리학을 완전히 이해하려면 행동 마우스에서 형태를 시각화하고 생체 내에서 활동을 기록해야합니다. 이 논문은 깨어 있고 머리가 억제 된 마우스에서 뇌 세포의 종방향 이미징을 허용하기 위해 만성 두개골 창을 이식하는 방법을 설명합니다. 유전자 전략 및 바이러스 주사와 조합하여, 특정 세포 및 관심 영역을 구조적 또는 생리학적 마커로 표지할 수 있다. 이 프로토콜은 두개골 창을 통해 두 세포를 동시에 이미징하기 위해 피질에서 GCaMP6 발현 성상 세포 근처의 뉴런을 표지하기 위해 바이러스 주사를 결합하는 방법을 보여줍니다. 동일한 세포의 다중 광자 이미징은 깨어 있고 행동하는 동물에서 며칠, 몇 주 또는 몇 달 동안 수행 될 수 있습니다. 이 접근법은 연구자들에게 실시간으로 세포 역학을 보는 방법을 제공하며 신경 과학의 여러 가지 질문에 답하기 위해 적용될 수 있습니다.

두개골 창의 품질은 신경 구조가 얼마나 선명하게 나타나는지에 따라 평가 될 수 있습니다. 좋은 창문에서는 수지상 척추가 명확하게 보입니다 (그림 1). 저장된 구조 및 위치 데이터를 사용하면 동일한 동물을 수일, 몇 주 또는 몇 달 동안 반복적으로 이미지화하여 동일한 세포를 검사할 수 있습니다(그림 1). 도 1 의 이미지는 일?...

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Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

여기에 제시된 것은 깨어 있고 머리가 억제 된 마우스에서 뇌 세포의 종방향 이미징을위한 만성 두개골 창을 이식하기위한 프로토콜입니다.

깨어있는 마우스 에서 반복되는 생체 내 이미징을위한 두개골 창 이식

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...

이 프로토콜은 바이러스 주사를 수행하고 깨어 있고 머리가 억제 된 마우스에서 뇌 세포를 이미징하기위한 두개골 창을 이식하는 방법을 설명합니다. 이 방법의 장점은 뉴런과 성상 세포의 구조와 활동이 여러 세션에 걸쳐 반복적으로 이미징 될 수 있다는 것입니다. 이 접근법은 신경 발달 또는 신경 퇴행성 장애의 모델에서 신경 세포가 어떻게 변화되는지, 또는 경험 의존적 가소성이 손상되는지 여부를 결정하는 데 사용될 수 있습니다.마취 된 마우스를 클램프와 이어 바를 사용하여 입체 택시 프레임에 고정시키는 것으로 시작하십시오. 멸균 수술 도구를 사용하여 브레그마 앞쪽의 전두엽 봉합사에서 람다 뒤쪽으로 피부를 자르고 제거하십시오. 멸균 크기 11 탄소강 수술 블레이드를 사용하여 두개골에서 모든 결합 조직을 부드럽게 긁어냅니다.치과 훈련의 도움으로 점차적으로 두개골 뼈를 동심원의 개구부 윤곽을 따라 뚫고 뼈를 얇게 만듭니다. 각 동심원 통과 후, 드릴링된 부위에 식염수 한 방울 또는 두 개를 첨가하고, 드릴링을 재개하기 전에 식염수를 적어도 10초 동안 앉히도록 한다. 미세한 포셉으로 두개골 뼈의 중앙 영역을 부드럽게 밀어 두개골이 적절하게 얇아지고 움직이는지 확인하십시오.드릴링이 발생한 하부 혈관 구조가 손상되지 않았는지 확인하고 뼈가 금이 가지 않았는지 확인하십시오. 얇아진 뼈에 미니어처 15도 뾰족한 칼날을 조심스럽게 삽입하고 식염수에 담근 젤 폼을 잘라 사용하여 발생할 수있는 출혈을 막으십시오. 포셉을 사용하여 조심스럽게 뼈를 들어 올리고 제거하여 경막이 손상되지 않도록주의하십시오.주사를 위해, 멸균 경사 유리 피펫을 바이러스 혼합물로 20 마이크로 미터 팁으로 채 웁니다. 그런 다음 피펫을 내려 뇌 표면에 닿게 하고, 2/3층 주사를 위해 추가로 200 내지 300 마이크로미터를 더 낮추십시오. 세포내 미세주입 분배 시스템을 사용하여, 2분에 걸쳐 시스템을 12 내지 15회 압력 주입한다.두개골 창 이식을 위해, 두개골의 개구부 위에 덮개 유리를 놓으십시오. 포셉을 사용하여 유리가 개구부 위로 플러시되도록 하십시오. 유리 창의 가장자리를 두개골에 밀봉하려면 유리 표면의 둘레 주위에 시아 노 아크릴레이트 접착 젤을 바르십시오.접착 젤 위에 접착제 층을 바르십시오. 그런 다음 치과 시멘트 액체 층을 추가하십시오. 치과 시멘트가 경화되면 헬리콥터 형 헤드 플레이트의 중앙 개구부 주위에 얇은 접착제 층을 적용하고 커버 글라스 위에 적절한 크기의 헬리콥터 유형 헤드 플레이트를 놓습니다.접착제가 마르게하십시오. 치과 시멘트 분말을 1.5 밀리리터 마이크로 퍼지 튜브에 0.1 밀리리터 마크까지 첨가하십시오. 빠른 경화 인스턴트 접착제의 일곱 ~ 여덟 방울을 분말에 혼합하고, 결과 혼합물을 절단 된 19 게이지 바늘이있는 1 밀리리터 주사기에 그려서 더 큰 구멍을 만듭니다.양쪽에서 스며들 때까지 헬리콥터 바의 측면 구멍을 통해 분말 혼합물을 주입하십시오. 치과 시멘트 접착제 혼합물을 노출 된 두개골의 나머지 부분에 적용하여 머리 판을 두개골에 고정시킵니다. 마우스를 천으로 감싸고 헤드 플레이트를 통해 공수 홈 케이지의 헤드 고정 암에 고정시킨 다음 홈 케이지를 빛에 노출시킵니다.15 분의 습관화 시간이 지나면 홈 케이지에서 마우스를 제거하십시오. 현미경의 넓은 필드 모드를 사용하여 쉽게 식별 할 수있는 혈관 구조의 두 개에서 세 개의 위치를 선택하십시오. 혈관의 이미지를 저장하고 모터 컨트롤러에 나타나는 x 및 y 좌표를 기록하십시오.성상세포에서의 뉴런의 시냅스 구조 및 GCaMP6f 활성을 이미지화한다. 대표적인 분석에서, 두개골 창의 품질은 수일에 걸쳐 수상 돌기 및 GCaMP6f 발현 성상세포의 반복 이미징으로 평가되었다. 좋은 창문에서, 신경 구조는 명확하게 보이는 수지상 척추와 함께 선명하게 보였다.이미징 둘째 날에 두 개의 새로운 척추가 나타났습니다. 단 하나의 척추 만 지속되었고 다섯 번째 날에는 눈에 띄었습니다. 칼슘 활성은 상이한 시점에서 GCaMP6f를 발현하는 성상세포에서 연구되었다.전체 세포를 포괄하는 세계적인 사건이 운동 시합 중에 목격되었습니다. 이 프로토콜의 두 가지 중요한 단계는 뼈를 제거하기 전에 뼈를 적절하게 얇게하고 덮개 유리를 개구부 위에 적절하게 배치해야한다는 것입니다. 이미징은 이미징 중 행동 분석이나 새로운 운동 기술 학습과 같은 사후 행동과 결합하여 신경 및 성상 세포 구조와 기능이 학습에 의해 어떻게 조절되는지 결정할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

만성 두 광자를위한 박막 해골 창 기법 생체내에서</emNeuroinflammation의 모델 Murine Microglia의> 이미징

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

연구

신경과학

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

마우스의 중추 신경계에서 줄기 세포 주입의 Multimodal 이미징

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

초음파 혈액 - 뇌 장벽 파괴 및 망간 향상된 MRI를 사용하여 기능성 Neuroimaging

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

에 얇게 - 두개골 두피 창 기술<em&gt; 생체 내</em&gt; 광 결맞음 단층 촬영 영상

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

측면 만성 두개골 창 준비 활성화<em&gt; 생체</em&gt; 마우스의 말초 중간 대뇌 동맥 폐색에 따라 관측

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of ...

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal (PHASOR): A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal PHASOR: A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

압 전 높은 정확도 Osteal 제거 수술 (위상): 쥐에 향상 된 두개골 창 수술 기법

Multiphoton microscopy has been widely adapted for imaging neurons in vivo. Repeated imaging requires implantation of a cranial window or repeated ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

마우스에 있는 Laminectomy 및 척수 창 이식

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Vivo에서 신생아 쥐에 있는 대뇌 피 질의 뉴런의 두 광자 영상

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

생체 내 마우스 열등올리브의 칼슘 이미징

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Construction and Implementation of Carbon Fiber Microelectrode Arrays for Chronic and Acute In Vivo Recordings

Construction and Implementation of Carbon Fiber Microelectrode Arrays for Chronic and Acute In Vivo Recordings

만성 및 급성 생체 내 기록을 위한 탄소 섬유 미세 전하 배열의 구성 및 구현

Multichannel electrode arrays offer insight into the working brain and serve to elucidate neural processes at the single-cell and circuit levels. ...