Name: implantation of a cranial window for repeated in vivo imaging in awake mice
Uploaded: 2021-06-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice at JoVE.com

Alla djurförsök utfördes i enlighet med riktlinjer som godkänts av IACUC vid University of Nebraska Medical Center.
1. Före operationen
<ol><li>Förbered pipetter för virala injektioner. Dra borosilikatglaskapillärer med en pipettavdragare och fasa pipetten i 20 ° vinkel. Sterilisera pipetterna över natten.</li>
	<li>Förbered färska bitar av sterilt gelskum genom att skära dem i små rutor. Sänk ner gelskummet i ett sterilt mikrofugerör innehållande 0,5 ml saltlösning. Blötl...

<ol>
	<li>Cichon, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branch-specific+dendritic+Ca2++spikes+cause+persistent+synaptic+plasticity.">Branch-specific dendritic Ca2+ spikes cause persistent synaptic plasticity.</a> Nature. 520 (7546), 180-185 (2015).</li><li>Goncalves, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circuit+level+defects+in+the+developing+neocortex+of+Fragile+X+mice.">Circuit level defects in the developing neocortex of Fragile X mice.</a> Nature Neuroscience. 16 (7), 903-909 (2013).</li><li>Padmashri, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+structural+and+functional+synaptic+plasticity+with+motor+skill+learning+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Altered structural and functional synaptic plasticity with motor skill learning in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 33 (50), 19715-19723 (2013).</li><li>Peters, A. J., Chen, S. X., Komiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+reproducible+spatiotemporal+activity+during+motor+learning.">Emergence of reproducible spatiotemporal activity during motor learning.</a> Nature. 510 (7504), 263-267 (2014).</li><li>Poskanzer, K. E., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+regulate+cortical+state+switching+in+vivo.">Astrocytes regulate cortical state switching in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2675-2684 (2016).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++signaling+in+astrocytes+from+Ip3r2(-/-)+mice+in+brain+slices+and+during+startle+responses+in+vivo.">Ca2+ signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo.</a> Nature Neuroscience. 18 (5), 708-717 (2015).</li><li>Takata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+calcium+signaling+transforms+cholinergic+modulation+to+cortical+plasticity+in+vivo.">Astrocyte calcium signaling transforms cholinergic modulation to cortical plasticity in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 31 (49), 18155-18165 (2011).</li><li>Yang, G., Pan, F., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stably+maintained+dendritic+spines+are+associated+with+lifelong+memories.">Stably maintained dendritic spines are associated with lifelong memories.</a> Nature. 462 (7275), 920-924 (2009).</li><li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+long-term+dendritic+spine+stability+in+diverse+regions+of+cerebral+cortex.">Development of long-term dendritic spine stability in diverse regions of cerebral cortex.</a> Neuron. 46 (2), 181-189 (2005).</li><li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain.">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).</li><li>Isshiki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+synapse+remodelling+as+a+common+phenotype+in+mouse+models+of+autism.">Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism.</a> Nature Communications. 5, 4742 (2014).</li><li>Cruz-Martin, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+stabilization+of+dendritic+spines+in+fragile+X+mice.">Delayed stabilization of dendritic spines in fragile X mice.</a> Journal of Neuroscience. 30 (23), 7793-7803 (2010).</li><li>Mostany, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+synaptic+dynamics+during+normal+brain+aging.">Altered synaptic dynamics during normal brain aging.</a> Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).</li><li>Trachtenberg, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex.">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).</li><li>Agarwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+opening+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore+induces+microdomain+calcium+transients+in+astrocyte+processes.">Transient opening of the mitochondrial permeability transition pore induces microdomain calcium transients in astrocyte processes.</a> Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).</li><li>Bindocci, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+Ca2++imaging+advances+understanding+of+astrocyte+biology.">Three-dimensional Ca2+ imaging advances understanding of astrocyte biology.</a> Science. 356 (6339), (2017).</li><li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments.">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li><li>Han, S., Yang, W., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+volumetric+imaging+of+neuronal+activity+of+cortical+columns.">Two-color volumetric imaging of neuronal activity of cortical columns.</a> Cell Reports. 27 (7), 2229-2240 (2019).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo.">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li><li>Stowell, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noradrenergic+signaling+in+the+wakeful+state+inhibits+microglial+surveillance+and+synaptic+plasticity+in+the+mouse+visual+cortex.">Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Chen, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-specific+plasticity+of+inhibitory+circuits+in+motor+cortex+during+motor+learning.">Subtype-specific plasticity of inhibitory circuits in motor cortex during motor learning.</a> Nature Neuroscience. 18 (8), 1109-1115 (2015).</li><li>Stobart, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+circuit+activity+evokes+rapid+astrocyte+calcium+signals+on+a+similar+timescale+to+neurons.">Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons.</a> Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).</li><li>Matsui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+in+utero+electroporation:+controlled+spatiotemporal+gene+transfection.">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e3024 (2011).</li><li>Roth, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+synaptic+AMPA+receptor+plasticity+during+motor+learning.">Cortical synaptic AMPA receptor plasticity during motor learning.</a> Neuron. 105 (5), 895-908 (2020).</li><li>Stogsdill, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+neuroligins+control+astrocyte+morphogenesis+and+synaptogenesis.">Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis.</a> Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).</li><li>Suresh, A., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+synaptic+AMPAR+and+spine+dynamics:+impairments+in+the+FXS+mouse.">Relationship between synaptic AMPAR and spine dynamics: impairments in the FXS mouse.</a> Cerebral Cortex. 27 (8), 4244-4256 (2017).</li><li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+two-photon+imaging+of+synaptic+structures+in+the+cortex+of+awake+head-restrained+mice.">Transcranial two-photon imaging of synaptic structures in the cortex of awake head-restrained mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1010, 35-43 (2013).</li><li>Dombeck, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+large-scale+neural+activity+with+cellular+resolution+in+awake,+mobile+mice.">Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice.</a> Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).</li><li>Kislin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat-floored+air-lifted+platform:+a+new+method+for+combining+behavior+with+microscopy+or+electrophysiology+on+awake+freely+moving+rodents.">Flat-floored air-lifted platform: a new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (88), e51869 (2014).</li><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Hauglund, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meningeal+lymphangiogenesis+and+enhanced+glymphatic+activity+in+mice+with+chronically+implanted+EEG+electrodes.">Meningeal lymphangiogenesis and enhanced glymphatic activity in mice with chronically implanted EEG electrodes.</a> Journal of Neuroscience. 40 (11), 2371-2380 (2020).</li><li>De Paola, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+structural+plasticity+of+axonal+branches+and+boutons+in+the+adult+neocortex.">Cell type-specific structural plasticity of axonal branches and boutons in the adult neocortex.</a> Neuron. 49 (6), 861-875 (2006).</li><li>Cheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+two-photon+calcium+imaging+at+different+depths+with+spatiotemporal+multiplexing.">Simultaneous two-photon calcium imaging at different depths with spatiotemporal multiplexing.</a> Nature Methods. 8 (2), 139-142 (2011).</li><li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).</li><li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polished+and+reinforced+thinned-skull+window+for+long-term+imaging+of+the+mouse+brain.">A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), e3742 (2012).</li><li>Helm, P. J., Ottersen, O. P., Nase, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+optical+properties+of+the+mouse+cranium--implications+for+in+vivo+multi+photon+laser+scanning+microscopy.">Analysis of optical properties of the mouse cranium--implications for in vivo multi photon laser scanning microscopy.</a> Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 316-322 (2009).</li><li>Stobart, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+calcium+imaging+of+astrocytes+reveals+distinct+cellular+compartment+responses+to+sensory+stimulation.">Long-term in vivo calcium imaging of astrocytes reveals distinct cellular compartment responses to sensory stimulation.</a> Cerebral Cortex. 28 (1), 184-198 (2018).</li><li>Pryazhnikov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+two-photon+imaging+in+somatosensory+cortex+of+behaving+mice+reveals+dendritic+spine+formation+enhancement+by+subchronic+administration+of+low-dose+ketamine.">Longitudinal two-photon imaging in somatosensory cortex of behaving mice reveals dendritic spine formation enhancement by subchronic administration of low-dose ketamine.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6464 (2018).</li><li>Thrane, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+anesthesia+selectively+disrupts+astrocyte+calcium+signaling+in+the+awake+mouse+cortex.">General anesthesia selectively disrupts astrocyte calcium signaling in the awake mouse cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (46), 18974-18979 (2012).</li><li>Paukert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norepinephrine+controls+astroglial+responsiveness+to+local+circuit+activity.">Norepinephrine controls astroglial responsiveness to local circuit activity.</a> Neuron. 82 (6), 1263-1270 (2014).</li><li>Delekate, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabotropic+P2Y1+receptor+signalling+mediates+astrocytic+hyperactivity+in+vivo+in+an+Alzheimer's+disease+mouse+model.">Metabotropic P2Y1 receptor signalling mediates astrocytic hyperactivity in vivo in an Alzheimer's disease mouse model.</a> Nature Communications. 5, 5422 (2014).</li></ol>

Här har vi presenterat ett protokoll för implantation av kroniska kranialfönster för in vivo-avbildning av kortikala astrocyter och neuroner i vakna, huvudhållna möss på en luftlyft hembur. Specifika exempel har tillhandahållits på kranialfönsterapplikationen för avbildning av astrocyter som uttrycker GECI och neuronala synaptiska strukturer. Med hjälp av multifotonmikroskopi kan astrocytisk kalciumsignaldynamik och strukturell synaptisk dynamik registreras upprepade gånger under dagar.
<p class...

Förmågan att utföra in vivo multifotonfluorescensmikroskopi i mössens cortex är av största vikt för studien av cellulär signalering och struktur 1,2,3,4,5,6,7,8,9, sjukdomspatologi 10,11 och cellulär utveckling12,13 . Med implantation av kroniska kranialfönster är längsgående avbildning möjlig, vilket möjliggör upprepad avbildning av kortikala områden i dagar, veckor eller månader13,14 hos levande djur. Multifotonmikroskopi är idealisk för in vivo, upprepad avbildning på grund av förbättrad djupprobning och minskad fotoskada i samband med den infraröda lasern som används. Detta möjliggör studier av molekylär och cellulär dynamik hos specifika celler i olika kortikala regioner.
Multifotonmikroskopi har använts för in vivo-avbildning av neuronala och gliaceller hos möss 15,16,17,18,19,20. Olika strategier kan implementeras för att märka särskilda celltyper och intresseområden. Ett vanligt tillvägagångssätt är att driva uttrycket av genetiskt kodade fluorescerande proteiner på ett cellspecifikt sätt med hjälp av Cre-Lox-rekombinationssystemet. Detta kan utföras med genetiskt modifierade möss, t.ex. genom att korsa tdTomato "floxed" mus (Ai14) med en mus som uttrycker Cre-recombinase under en promotor av intresse21. Alternativt kan cell- och platsspecifik märkning uppnås med virala injektioner. Här injiceras ett virus som kodar för Cre-rekombinas under en cellspecifik promotor och ett virus som kodar för en floxed gen av intresse i en definierad region. Lämpliga celltyper som tar emot båda virusvektorerna kommer då att uttrycka den eller de önskade generna. Dessa gener kan vara strukturella markörer, såsom tdTomato, för att se förändringar i cellulär morfologi22 eller genetiskt kodade kalciumindikatorer (GECI), såsom GCaMP och / eller RCaMP, för att undersökakalciumdynamiken 23. Metoder för genetisk rekombination kan tillämpas individuellt eller i kombination för att märka en eller flera celltyper. Ett tredje tillvägagångssätt, som inte kräver transgena möss eller virala konstruktioner (som har begränsad förpackningskapacitet), är in utero elektroporering av DNA-konstruktioner24. Beroende på tidpunkten för elektroporationen kan olika celltyper riktas 25,26,27.
När du utför multifotonavbildning kan möss avbildas medan de är vakna eller bedövade. Avbildning av vakna möss kan utföras genom att fästa musen via en fäst huvudplatta28. Detta tillvägagångssätt görs mindre stressande genom att tillåta relativt fri rörlighet för djuret med hjälp av metoder, såsom fritt flytande, luftstödda styrofoambollar29, fritt flytande löpband1 eller ett luftlyft hembursystem där möss fästs av en fäst huvudplatta och får röra sig i en öppen kammare30. För vart och ett av dessa avbildningsförhållanden kommer det först att vara nödvändigt att vanora mössen till bildinställningen. Detta dokument beskriver tillvänjnings- och bildbehandlingsproceduren med hjälp av ett luftlyft hembursystem.
Detta protokoll beskriver implantationen av ett kroniskt kranialfönster för längsgående in vivo-avbildning i cortex. Här kommer vi att använda möss som villkorligt uttrycker GCaMP6f i astrocyter för att övervaka kalciumsignaldynamiken. Vidare beskriver detta dokument proceduren för virala injektioner med tdTomato som en etikett för neuroner. Detta möjliggör bestämning av förändringar i neuronal synaptisk struktur och / eller tillgängligheten som en strukturell markör som möjliggör upprepad avbildning av samma astrocyt. Under hela protokollet kommer viktiga steg att belysas för att säkerställa bästa möjliga kvalitet på bilder som erhållits från multifotonmikroskopi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15o Pointed Blade</td>
			<td>Surgistar</td>
			<td>6500</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19 G Needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305186</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV1-CAG-FLEX-tdTomato</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>28306-AAV1</td>
			<td>Viral Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV1-CaMKII-0-4-Cre</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>105558-AAV1</td>
			<td>Viral Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acteone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A16P4</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol Prep Pads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Covidien 5750</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beveler</td>
			<td>Narishige</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbide Burs</td>
			<td>SS White Dental</td>
			<td>14717</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen (Rimadyl), 50 mg/mL</td>
			<td>Zoetis Mylan Institutional, LLC.</td>
			<td></td>
			<td>Drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed Air</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-022-523</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tip Applicators</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>836-WC NO BINDER</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass, No. 1 thickness, 3 mm/5 mm</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0720, 64-0700</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Drill</td>
			<td>Aseptico</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone, 4 mg/mL</td>
			<td>Mylan Institutional, LLC.</td>
			<td></td>
			<td>Drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duralay Liquid&#160; (dental cement liquid)</td>
			<td>Patterson Dental</td>
			<td>602-8518</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duralay Powder&#160; (dental cement powder)</td>
			<td>Patterson Dental</td>
			<td>602-7932</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrofloxacin, 2.27%</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td>Drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>17033-211-38</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Lite High Intensity Illuminator</td>
			<td>Dolan-Jenner Industries</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (Large)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14099</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (Small)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501764</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCaMP6f B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Stock No: 024105</td>
			<td>Mouse line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Germinator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Stock No: 012586</td>
			<td>Mouse Line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headplate</td>
			<td>Neurotar</td>
			<td>Model 1, Model 3</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501705</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holder for 15o Pointed Blade</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501247</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holder for Scalpel Blades</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500236</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine Prep Pads</td>
			<td>Avantor</td>
			<td>15648-926</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal</td>
			<td></td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane table top system with Induction Box</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Vaporizer</td>
			<td>SurgiVet</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>KG517</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite 401</td>
			<td>Henkel</td>
			<td>40140</td>
			<td>fast-curing instant adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite 454</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9194415</td>
			<td>cyanoacrylate adhesive gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen</td>
			<td>Matheson</td>
			<td>NI M200</td>
			<td>Gas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen</td>
			<td>Matheson</td>
			<td>OX M250</td>
			<td>Gas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer</td>
			<td>Parker</td>
			<td></td>
			<td>intracellular microinjection dispense system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014340</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Hair Trimmer</td>
			<td>Wahl</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline (0.9% Sodium Chloride)</td>
			<td>Med Vet International</td>
			<td>RX0.9NACL-30BAC</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades, Size 11</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4-111</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503667</td>
			<td>Surgery Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic Instrument</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugi Sponge Strips (sponge strips)</td>
			<td>Kettenbach Dental</td>
			<td>31002</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SURGIFOAM (gel foam)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>1972</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe with 26 G Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>309625</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T5648-1G</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti:Sapphire Laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td>Surgery Supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Blanket</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylocaine MPF with Epinephrine (1:200,000), 10 mg/mL</td>
			<td>Fresenius Kabi USA</td>
			<td></td>
			<td>Drug</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implantation of a cranial window for repeated in vivo imaging in awake mice

För att fullt ut förstå den cellulära fysiologin hos neuroner och glia hos uppträdande djur är det nödvändigt att visualisera deras morfologi och registrera deras aktivitet in vivo hos möss som beter sig. Detta dokument beskriver en metod för implantation av ett kroniskt kranialfönster för att möjliggöra längsgående avbildning av hjärnceller i vakna, huvudhållna möss. I kombination med genetiska strategier och virala injektioner är det möjligt att märka specifika celler och regioner av intresse med strukturella eller fysiologiska markörer. Detta protokoll visar hur man kombinerar virala injektioner för att märka neuroner i närheten av GCaMP6-uttryckande astrocyter i cortex för samtidig avbildning av båda cellerna genom ett kranialfönster. Multifotonavbildning av samma celler kan utföras i dagar, veckor eller månader i vakna, uppträdande djur. Detta tillvägagångssätt ger forskare en metod för att se cellulär dynamik i realtid och kan tillämpas för att svara på ett antal frågor inom neurovetenskap.

Kvaliteten på kranialfönstret kan bedömas av hur skarpa de neuronala strukturerna uppträder. I ett bra fönster är dendritiska spines tydligt synliga (Figur 1). Med de strukturella och positionsdata som lagras kan samma djur avbildas upprepade gånger i dagar, veckor eller månader för att undersöka samma celler (figur 1). Bilderna i figur 1 erhölls från frambensregionen i den primära motorcortexen (i ett 5 mm fönster). E...

Watch this Scientific Journal Video about Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice at JoVE.com

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Här presenteras ett protokoll för implantation av ett kroniskt kranialfönster för längsgående avbildning av hjärnceller hos vakna, huvudhållna möss.

Implantation av ett kranialfönster för upprepad in vivo-avbildning hos vakna möss

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...

Protokollet beskriver hur man utför virala injektioner och implanterar ett kranialfönster för avbildning av hjärnceller i vakna, huvudhållna möss. Fördelen med denna metod är att struktur och aktivitet hos neuroner och astrocyter kan avbildas upprepade gånger under flera sessioner. Detta tillvägagångssätt kan användas för att bestämma hur neurala celler förändras i modeller av neurodevelopmental eller neurodegenerativa störningar, eller om erfarenhetsberoende plasticitet försämras.Börja med att fästa en sövd mus i en stereotaxisk ram med hjälp av snutklämman och öronstängerna. Skär och ta bort huden från de främre suturerna främre till bregma till bakre till lambda med hjälp av sterila kirurgiska verktyg. Skrapa försiktigt all bindväv från skallen med ett sterilt storlek 11 kolstål kirurgiskt blad.Med hjälp av en tandborr borrar du gradvis skallbenet längs öppningens kontur i koncentriska cirklar för att underlätta jämn gallring av benet. Efter varje koncentriskt pass, tillsätt en droppe eller två saltlösning till det borrade området och låt saltlösningen sitta i minst 10 sekunder innan du återupptar borrningen. Tryck försiktigt på det centrala området av skallbenet med fina pincett för att kontrollera att skallen är tillräckligt tunn och rör sig.Se till att den underliggande vaskulaturen där borrningen inträffade är intakt och att benet inte är knäckt. Sätt försiktigt in ett miniatyr 15-graders spetsigt blad i det tunna benet och skär och använd gelskummet som blötläggs i saltlösning för att stoppa blödningar som kan uppstå. Använd pincett, lyft försiktigt och ta bort benet, var försiktig så att dura mater inte skadas.För injektionen fyller du en steril fasad glaspipett med en 20-mikrometer spets med virusblandningen. Sänk sedan pipetten för att röra vid hjärnans yta och fortsätt att sänka i ytterligare 200 till 300 mikrometer för lager 2/3 injektioner. Med hjälp av ett intracellulärt mikroinjektionsdispenseringssystem injicerar trycket systemet 12 till 15 gånger under två minuter.För kranialfönsterimplantation, placera täckglaset över öppningen i skallen. Använd pincett för att säkerställa att glaset är jämnt över öppningen. För att täta glasfönstrets kanter till skallen, applicera cyanoakrylathäftande gel runt glasytans omkrets.Applicera ett lager lim över limgelen. Tillsätt sedan ett lager tandcementvätska. När tandcement härdar, applicera ett tunt lager lim runt den centrala öppningen på helikoptertyps huvudplattan och placera helikoptertypshuvudplattan av lämplig storlek över täckglaset.Låt limet torka. Tillsätt tandcementpulver i ett 1,5 ml mikrofugerör upp till 0,1 ml märke. Blanda sju till åtta droppar snabbhärdande snabblim i pulvret och dra den resulterande blandningen i en en milliliter spruta med en 19 gauge nål som har skurits för att skapa en större öppning.Injicera pulverblandningen genom helikopterstångens sidohål tills den sipprar från vardera sidan. Applicera tandcementlimblandningen på resten av den exponerade skallen för att fästa huvudplattan på skallen. Vik in musen i tyg och fäst den via huvudplattan till huvudfixeringsarmen på den luftlyfta hemburen och lämna sedan hemburen utsatt för ljus.Efter en tillvänjningstid på 15 minuter, ta bort musen från hemburet. Använd mikroskopets breda fältläge och välj två till tre positioner med lätt identifierbar vaskulatur. Spara bilderna av blodkärlen och spela in x- och y-koordinaterna som visas på motorstyrenheten.Avbilda de synaptiska strukturerna hos neuroner och GCaMP6f-aktivitet i astrocyter. I den representativa analysen utvärderades kranialfönstrets kvalitet med upprepad avbildning av dendriter och GCaMP6f-uttryckande astrocyter under dagar. I ett bra fönster verkade de neuronala strukturerna skarpa med tydligt synliga dendritiska spines.Två nya taggar dök upp på dag två av bildbehandlingen. Endast en ryggrad kvarstod och var synlig på dag fem. Kalciumaktivitet studerades i astrocyter som uttrycker GCaMP6f vid olika tidpunkter.En global händelse som omfattade hela cellen bevittnades under en rörelsekamp. De två kritiska stegen i detta protokoll är att benet måste tunnas tillräckligt innan benet avlägsnas och att täckglaset placeras korrekt över öppningen. Avbildning kan kombineras med beteendeanalys, antingen under avbildning eller efter beteende, såsom att lära sig en ny motorisk färdighet, för att bestämma hur neuronal och astrocytstruktur och funktion moduleras genom inlärning.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

En tunn-skalle Fönster Teknik för kronisk två-photon In vivo Imaging av murina mikroglia i modeller av Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

Multimodal Imaging av stamceller implanteras i centrala nervsystemet hos möss

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionell hjärnavbildning med ultraljud Blod-hjärnbarriären störningar och mangan-förstärkt MRT

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Förtunnas-skalle Kortikal fönster Teknik för<em&gt; In Vivo</em&gt; Optisk koherens tomografi Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Lateral Kronisk Kraniell fönster Framställning Aktiverar<em&gt; In Vivo</em&gt; Observation Efter Distal Middle Cerebral artärocklusion hos möss

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of ...

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal (PHASOR): A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal PHASOR: A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

Piezo hög noggrannhet kirurgiska Osteal borttagning (PHASOR): En teknik för förbättrat kraniala fönster kirurgi hos möss

Multiphoton microscopy has been widely adapted for imaging neurons in vivo. Repeated imaging requires implantation of a cranial window or repeated ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

Implantation av laminektomi och Ryggmärgs fönster i musen

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Två-foton avbildning av kortikala nervceller hos neonatala möss

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Kalciumavbildning i mus underlägsen oliv

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Construction and Implementation of Carbon Fiber Microelectrode Arrays for Chronic and Acute In Vivo Recordings

Construction and Implementation of Carbon Fiber Microelectrode Arrays for Chronic and Acute In Vivo Recordings

Konstruktion och implementering av kolfibermikroelektrodmatriser för kroniska och akuta in vivo-inspelningar

Multichannel electrode arrays offer insight into the working brain and serve to elucidate neural processes at the single-cell and circuit levels. ...