Name: identification of alternative splicing and polyadenylation in rna-seq data
Uploaded: 2021-06-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data at JoVE.com

تم دعم هذه الدراسة من قبل زمالة المستقبل لمجلس البحوث الأسترالي (ARC) (FT16010043) ومخطط ANU Futures.

1. تركيب الأدوات وحزم R المستخدمة في التحليل
<ol><li>Conda هو مدير حزم شائع ومرن يسمح بالتثبيت المريح للحزم مع تبعياتها عبر جميع الأنظمة الأساسية. استخدم "Anaconda" (مدير حزم conda) لتثبيت "conda" والذي يمكن استخدامه لتثبيت الأدوات / الحزم المطلوبة للتحليل.</li>
	<li>قم بتنزيل "Anaconda" وفقا لمتطلبات النظا?...

<ol>
	<li>Katz, Y., Wang, E. T., Airoldi, E. M., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+design+of+RNA+sequencing+experiments+for+identifying+isoform+regulation.">Analysis and design of RNA sequencing experiments for identifying isoform regulation.</a> Nature Methods. 7 (12), 1009-1015 (2010).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+alternative+splicing+and+its+regulation.">Mechanism of alternative splicing and its regulation.</a> Biomedical Reports. 3 (2), 152-158 (2015).</li><li>Mehmood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+differential+splicing+tools+for+RNA-seq+studies.">Systematic evaluation of differential splicing tools for RNA-seq studies.</a> Briefings in Bioinformatics. 21 (6), 2052-2065 (2020).</li><li>Movassat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+between+alternative+polyadenylation+and+alternative+splicing+is+limited+to+terminal+introns.">Coupling between alternative polyadenylation and alternative splicing is limited to terminal introns.</a> RNA Biology. 13 (7), 646-655 (2016).</li><li>Tian, B., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+polyadenylation+of+mRNA+precursors.">Alternative polyadenylation of mRNA precursors.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (1), 18-30 (2017).</li><li>Herrmann, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PolyASite+2.0:+a+consolidated+atlas+of+polyadenylation+sites+from+3'+end+sequencing.">PolyASite 2.0: a consolidated atlas of polyadenylation sites from 3' end sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 48 (1), 174-179 (2020).</li><li>Liu, R., Loraine, A. E., Dickerson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparisons+of+computational+methods+for+differential+alternative+splicing+detection+using+RNA-seq+in+plant+systems.">Comparisons of computational methods for differential alternative splicing detection using RNA-seq in plant systems.</a> BMC Bioinformatics. 15 (1), 364 (2014).</li><li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis.">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biology. 17 (1), 13 (2016).</li><li>Anders, S., Reyes, A., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+differential+usage+of+exons+from+RNA-seq+data.">Detecting differential usage of exons from RNA-seq data.</a> Genome Research. 22 (10), 2008-2017 (2012).</li><li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies.">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), 47 (2014).</li><li>Shen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rMATS:+Robust+and+flexible+detection+of+differential+alternative+splicing+from+replicate+RNA-Seq+data.">rMATS: Robust and flexible detection of differential alternative splicing from replicate RNA-Seq data.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (51), 5593-5601 (2014).</li><li>Mehmood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+differential+splicing+tools+for+RNA-seq+studies.">Systematic evaluation of differential splicing tools for RNA-seq studies.</a> Briefings in bioinformatics. 21 (6), 2052-2065 (2020).</li><li>Kanitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+assessment+of+methods+for+the+computational+inference+of+transcript+isoform+abundance+from+RNA-seq+data.">Comparative assessment of methods for the computational inference of transcript isoform abundance from RNA-seq data.</a> Genome biology. 16 (1), 1-26 (2015).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Sznajder, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+MBNL1+induces+RNA+misprocessing+in+the+thymus+and+peripheral+blood.">Loss of MBNL1 induces RNA misprocessing in the thymus and peripheral blood.</a> Nature Communications. 11, 1-11 (2020).</li><li>Batra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+MBNL+leads+to+disruption+of+developmentally+regulated+alternative+polyadenylation+in+RNA-mediated+disease.">Loss of MBNL leads to disruption of developmentally regulated alternative polyadenylation in RNA-mediated disease.</a> Molecular Cell. 56 (2), 311-322 (2014).</li><li>Leinonen, R., Sugawara, H., Shumway, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sequence+read+archive.">The sequence read archive.</a> Nucleic acids research. 39, 19-21 (2010).</li><li>Tange, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> GNU parallel-the command-line power tool. 36, 42-47 (2011).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAR:+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner.">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li><li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=edgeR:+a+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data.">edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).</li><li>Robinson, M. D., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scaling+normalization+method+for+differential+expression+analysis+of+RNA-seq+data.">A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data.</a> Genome Biology. 11 (3), 25 (2010).</li><li>Veiga, D. F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=maser:+Mapping+Alternative+Splicing+Events+to+pRoteins.">maser: Mapping Alternative Splicing Events to pRoteins.</a> R package version 1.4.0. , (2019).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10 (13), 25 (2009).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Ram&#237;rez, F., D&#252;ndar, F., Diehl, S., Gr&#252;ning, B. A., Manke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=deepTools:+a+flexible+platform+for+exploring+deep-sequencing+data.">deepTools: a flexible platform for exploring deep-sequencing data.</a> Nucleic acids research. 42 (1), 187-191 (2014).</li><li>Merino, G. A., Conesa, A., Fern&#225;ndez, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+benchmarking+of+workflows+for+detecting+differential+splicing+and+differential+expression+at+isoform+level+in+human+RNA-seq+studies.">A benchmarking of workflows for detecting differential splicing and differential expression at isoform level in human RNA-seq studies.</a> Briefings in bioinformatics. 20 (2), 471-481 (2019).</li><li>Chhangawala, S., Rudy, G., Mason, C. E., Rosenfeld, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+read+length+on+quantification+of+differentially+expressed+genes+and+splice+junction+detection.">The impact of read length on quantification of differentially expressed genes and splice junction detection.</a> Genome biology. 16 (1), 1-10 (2015).</li><li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis.">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biol. 17, 13 (2016).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks.">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat Protoc. 7 (3), 562-578 (2012).</li><li>Li, B., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RSEM:+accurate+transcript+quantification+from+RNA-Seq+data+with+or+without+a+reference+genome.">RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome.</a> BMC Bioinformatics. 12, 323 (2011).</li><li>Bray, N. L., Pimentel, H., Melsted, P., Pachter, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-optimal+probabilistic+RNA-seq+quantification.">Near-optimal probabilistic RNA-seq quantification.</a> Nat Biotechnol. 34 (5), 525-527 (2016).</li></ol>

في هذه الدراسة ، قمنا بتقييم النهج القائمة على exon والقائمة على الأحداث للكشف عن AS و APA في بيانات تسلسل RNA-Seq السائبة و 3 'التسلسل النهائي. تنتج مناهج AS القائمة على exon كلا من قائمة الإكسونات المعبر عنها بشكل تفاضلي وترتيب على مستوى الجينات مرتبة حسب الأهمية الإحصائية لنشاط الربط التفاضلي على م...

تم استخدام RNA-seq على نطاق واسع على مر السنين عادة لتقدير التعبير الجيني التفاضلي واكتشاف الجينات1. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدامه أيضا لتقدير الاستخدام المتغير لمستوى إكسون بسبب تعبير الجينات عن أشكال متساوية مختلفة ، وبالتالي المساهمة في فهم أفضل لتنظيم الجينات على مستوى ما بعد النسخ. تولد غالبية الجينات حقيقية النواة أشكالا متساوية مختلفة عن طريق الربط البديل (AS) لزيادة تنوع تعبير mRNA. يمكن تقسيم أحداث AS إلى أنماط مختلفة: تخطي exons كاملة (SE) حيث تتم إزالة exon ("كاسيت") تماما من النص جنبا إلى جنب مع الإنترونات المرافقة له ؛ اختيار موقع لصق بديل (مانح) 5 '(A5SS) واختيار موقع لصق بديل 3 '(متقبل) (A3SS) عند وجود موقعين أو أكثر من مواقع لصق على طرفي إكسون ؛ الاحتفاظ بالإنترونات (RI) عند الاحتفاظ ب intron ضمن نسخة mRNA الناضجة والاستبعاد المتبادل لاستخدام exon (MXE) حيث يمكن الاحتفاظ بواحد فقط من الإكسونات المتاحين في وقت 2,3. يلعب polyadenylation البديل (APA) أيضا دورا مهما في تنظيم التعبير الجيني باستخدام مواقع poly البديلة (A) لتوليد أشكال متماثلة متعددة من mRNA من نسخة واحدة4. تقع معظم مواقع polyadenylation (pAs) في المنطقة غير المترجمة 3 '(3' UTRs) ، مما يولد أشكالا متماثلة من mRNA بأطوال UTR متنوعة 3 بوصات. نظرا لأن 3 'UTR هو المحور المركزي للتعرف على العناصر التنظيمية ، يمكن أن تؤثر أطوال UTR المختلفة 3 'على توطين mRNA واستقراره وترجمته5. هناك فئة من 3 'مقايسات تسلسل نهاية محسنة للكشف عن APA التي تختلف في تفاصيل البروتوكول6. تم تصميم خط الأنابيب الموصوف هنا ل PolyA-seq ، ولكن يمكن تكييفه مع البروتوكولات الأخرى كما هو موضح.
في هذه الدراسة ، نقدم مجموعة من طرق تحليل exon التفاضلية 7,8 (الشكل 1) ، والتي يمكن تقسيمها إلى فئتين عريضتين: القائمة على exon (DEXSeq9 ، diffSplice 10) والقائمة على الحدث (تكرار التحليل متعدد المتغيرات لربط النص (rMATS)11). تقارن الطرق القائمة على الإكسون تغير الطي عبر ظروف الإكسونات الفردية ، مقابل مقياس للتغير الكلي في طية الجينات لاستدعاء استخدام إكسون المعبر عنه بشكل تفاضلي ، ومن ذلك تحسب مقياسا على مستوى الجينات لنشاط AS. تستخدم الطرق المستندة إلى الأحداث قراءات تقاطع exon-intron-spanning لاكتشاف وتصنيف أحداث الربط المحددة مثل تخطي exon أو الاحتفاظ بالإنترونات ، وتمييز أنواع AS هذه في الإخراج3. وبالتالي ، توفر هذه الطرق وجهات نظر تكميلية لتحليل كامل لمعيار المحاسبة12,13. اخترنا DEXSeq (استنادا إلى حزمة DESeq214 DGE) و diffSplice (استنادا إلى حزمة Limma10 DGE) للدراسة لأنهما من بين الحزم الأكثر استخداما لتحليل الربط التفاضلي. تم اختيار rMATS كطريقة شائعة للتحليل القائم على الأحداث. طريقة أخرى شائعة قائمة على الأحداث هي MISO (خليط من الأشكال المتساوية)1. بالنسبة إلى APA ، نقوم بتكييف النهج القائم على exon.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62636/62636fig01.jpg"> الشكل 1. خط أنابيب التحليل. مخطط انسيابي للخطوات المستخدمة في التحليل. تشمل الخطوات: الحصول على البيانات ، وإجراء فحوصات الجودة ومحاذاة القراءة متبوعة بحساب القراءات باستخدام التعليقات التوضيحية لمواقع exons و introns و pA المعروفة ، والتصفية لإزالة الأعداد المنخفضة والتطبيع. تم تحليل بيانات PolyA-seq لمواقع pA البديلة باستخدام طرق diffSplice / DEXSeq ، وتم تحليل RNA-Seq السائب للربط البديل على مستوى exon باستخدام طرق diffSplice / DEXseq ، وتم تحليل أحداث AS باستخدام rMATS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62636/62636fig01large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
تم الحصول على بيانات RNA-seq المستخدمة في هذا المسح من التعبير الجيني الجامع (GEO) (GSE138691)15. استخدمنا بيانات RNA-seq للفأر من هذه الدراسة مع مجموعتين من الحالات: النوع البري (WT) والضربة القاضية من النوع 1 الشبيه بالعضلات (Mbnl1 KO) مع ثلاث نسخ متماثلة لكل منهما. لإثبات تحليل استخدام موقع polyadenylation التفاضلي ، حصلنا على بيانات الخلايا الليفية الجنينية للفأر (MEFs) PolyA-seq (GEO Accession GSE60487)16. تحتوي البيانات على أربع مجموعات شروط: النوع البري (WT) ، النوع 1 / النوع 2 الشبيه بالعضلات بالضربة القاضية المزدوجة (Mbnl1/2 DKO) ، Mbnl 1/2 DKO مع ضربة قاضية Mbnl3 (KD) و Mbnl1/2 DKO مع التحكم Mbnl3 (Ctrl). تتكون كل مجموعة شرط من نسختين متماثلتين.
<table border="1" fo:font-size="5px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>انضمام GEO</td>
			<td>رقم تشغيل SRA</td>
			<td>اسم العينة</td>
			<td>شرط</td>
			<td>تكرار</td>
			<td>نسيج</td>
			<td>التسلسل</td>
			<td>طول القراءة</td>
		</tr><tr><td rowspan="6">RNA-Seq</td>
			<td>جي إس إم 4116218</td>
			<td>SRR10261601</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_1</td>
			<td>Mbnl1 بالضربة القاضية</td>
			<td>ممثل 1</td>
			<td>الغدة الصعترية</td>
			<td>نهاية مزدوجة</td>
			<td>100 نقطة أساس</td>
		</tr><tr><td>جي إس إم 4116219</td>
			<td>SRR10261602</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_2</td>
			<td>Mbnl1 بالضربة القاضية</td>
			<td>ممثل 2</td>
			<td>الغدة الصعترية</td>
			<td>نهاية مزدوجة</td>
			<td>100 نقطة أساس</td>
		</tr><tr><td>جي إس إم 4116220</td>
			<td>SRR10261603</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_3</td>
			<td>Mbnl1 بالضربة القاضية</td>
			<td>مندوب 3</td>
			<td>الغدة الصعترية</td>
			<td>نهاية مزدوجة</td>
			<td>100 نقطة أساس</td>
		</tr><tr><td>جي إس إم 4116221</td>
			<td>SRR10261604</td>
			<td>WT_Thymus_1</td>
			<td>نوع البرية</td>
			<td>ممثل 1</td>
			<td>الغدة الصعترية</td>
			<td>نهاية مزدوجة</td>
			<td>100 نقطة أساس</td>
		</tr><tr><td>جي إس إم 4116222</td>
			<td>SRR10261605</td>
			<td>WT_Thymus_2</td>
			<td>نوع البرية</td>
			<td>ممثل 2</td>
			<td>الغدة الصعترية</td>
			<td>نهاية مزدوجة</td>
			<td>100 نقطة أساس</td>
		</tr><tr><td>جي إس إم 4116223</td>
			<td>SRR10261606</td>
			<td>WT_Thymus_3</td>
			<td>نوع البرية</td>
			<td>مندوب 3</td>
			<td>الغدة الصعترية</td>
			<td>نهاية مزدوجة</td>
			<td>100 نقطة أساس</td>
		</tr><tr><td rowspan="8">3P-Seq</td>
			<td>جي إس إم 1480973</td>
			<td>ريال1553129</td>
			<td>WT_1</td>
			<td>النوع البري (WT)</td>
			<td>ممثل 1</td>
			<td>الخلايا الليفية الجنينية للفأر (MEFs)</td>
			<td>نهاية واحدة</td>
			<td>40 نقطة أساس</td>
		</tr><tr><td>جي إس إم 1480974</td>
			<td>ريال1553130</td>
			<td>WT_2</td>
			<td>النوع البري (WT)</td>
			<td>ممثل 2</td>
			<td>الخلايا الليفية الجنينية للفأر (MEFs)</td>
			<td>نهاية واحدة</td>
			<td>40 نقطة أساس</td>
		</tr><tr><td>جي إس إم 1480975</td>
			<td>SRR1553131</td>
			<td>DKO_1</td>
			<td>Mbnl 1/2 ضربة قاضية مزدوجة (DKO)</td>
			<td>ممثل 1</td>
			<td>الخلايا الليفية الجنينية للفأر (MEFs)</td>
			<td>نهاية واحدة</td>
			<td>40 نقطة أساس</td>
		</tr><tr><td>جي إس إم 1480976</td>
			<td>SRR1553132</td>
			<td>DKO_2</td>
			<td>Mbnl 1/2 ضربة قاضية مزدوجة (DKO)</td>
			<td>ممثل 2</td>
			<td>الخلايا الليفية الجنينية للفأر (MEFs)</td>
			<td>نهاية واحدة</td>
			<td>40 نقطة أساس</td>
		</tr><tr><td>جي إس إم 1480977</td>
			<td>ريال1553133</td>
			<td>DKOsiRNA_1</td>
			<td>Mbnl 1/2 ضربة قاضية مزدوجة مع Mbnl 3 siRNA (دينار كويتي)</td>
			<td>ممثل 1</td>
			<td>الخلايا الليفية الجنينية للفأر (MEFs)</td>
			<td>نهاية واحدة</td>
			<td>40 نقطة أساس</td>
		</tr><tr><td>جي إس إم 1480978</td>
			<td>ريال1553134</td>
			<td>DKOsiRNA_2</td>
			<td>Mbnl 1/2 ضربة قاضية مزدوجة مع Mbnl 3 siRNA (دينار كويتي)</td>
			<td>ممثل 2</td>
			<td>الخلايا الليفية الجنينية للفأر (MEFs)</td>
			<td>نهاية واحدة</td>
			<td>36 نقطة أساس</td>
		</tr><tr><td>جي إس إم 1480979</td>
			<td>ريال1553135</td>
			<td>DKONTsiRNA_1</td>
			<td>Mbnl 1/2 ضربة قاضية مزدوجة مع siRNA غير مستهدف (Ctrl)</td>
			<td>ممثل 1</td>
			<td>الخلايا الليفية الجنينية للفأر (MEFs)</td>
			<td>نهاية واحدة</td>
			<td>40 نقطة أساس</td>
		</tr><tr><td>جي إس إم 1480980</td>
			<td>SRR1553136</td>
			<td>DKONTsiRNA_2</td>
			<td>Mbnl 1/2 ضربة قاضية مزدوجة مع siRNA غير مستهدف (Ctrl)</td>
			<td>ممثل 2</td>
			<td>الخلايا الليفية الجنينية للفأر (MEFs)</td>
			<td>نهاية واحدة</td>
			<td>40 نقطة أساس</td>
		</tr></tbody></table>الجدول 1. ملخص مجموعات بيانات RNA-Seq و PolyA-seq المستخدمة في التحليل.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Not relevent for computational study</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of alternative splicing and polyadenylation in rna-seq data

بالإضافة إلى التحليل النموذجي ل RNA-Seq لقياس التعبير الجيني التفاضلي (DGE) عبر الظروف التجريبية / البيولوجية ، يمكن أيضا استخدام بيانات RNA-seq لاستكشاف آليات تنظيمية معقدة أخرى على مستوى exon. يلعب الربط البديل و polyadenylation دورا حاسما في التنوع الوظيفي للجين من خلال توليد أشكال متساوية مختلفة لتنظيم التعبير الجيني على مستوى ما بعد النسخ ، ويمكن أن يؤدي قصر التحليلات على مستوى الجينات بالكامل إلى تفويت هذه الطبقة التنظيمية المهمة. هنا ، نوضح تحليلات مفصلة خطوة بخطوة لتحديد وتصور استخدام موقع exon و polyadenylation التفاضلي عبر الظروف ، باستخدام Bioconductor والحزم والوظائف الأخرى ، بما في ذلك DEXSeq و diffSplice من حزمة Limma و rMATS.

بعد تشغيل سير العمل خطوة بخطوة أعلاه ، تكون مخرجات تحليل AS و APA والنتائج التمثيلية في شكل جداول ومخططات بيانات ، يتم إنشاؤها على النحو التالي.
مثل: الناتج الرئيسي لتحليل AS (الجدول التكميلي 1 ل diffSplice; الجدول 2 ل DEXSeq) عبارة عن قائمة بالإكسونات التي تظ...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data at JoVE.com

Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data

يعمل الربط البديل (AS) والبولي أدينيل البديل (APA) على توسيع تنوع الأشكال المتماثلة ومنتجاتها. هنا ، نصف بروتوكولات المعلوماتية الحيوية لتحليل مقايسات تسلسل RNA-seq السائبة و 3 'للكشف عن وتصور AS و APA المتغيرة عبر الظروف التجريبية.

تحديد الربط البديل والبولي أدينيل في بيانات RNA-seq

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also ...

يوفر هذا البروتوكول فهما شاملا للأشكال المتماثلة للجينات الناتجة عن الربط البديل و polyadenylation من خلال توفير سير عمل خطوة بخطوة لتحديد مواقع الربط التفاضلي ، والإكسونات المعبر عنها بشكل تفاضلي ، ومواقع poly (A). الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي أنه يقيم كلا من الطرق القائمة على exon والقائمة على الأحداث لدراسة الربط البديل. كما يطبق الطريقة القائمة على exon لدراسة polyadenylation البديلة.تم توفير ملفات R Markdown التي تتضمن الرموز والملاحظات لتحليل AS و AP. ينصح باتباع الخطوات الموجودة في ملف R Markdown والوصول إلى الملاحظة لكل خطوة بعناية. لتحديد الربط التفاضلي باستخدام diffSplice من limma ، اتبع ملف دفتر الملاحظات R.قم بإعداد ملفات الإدخال كما هو موضح في مخطوطة النص. تأكد من اتباع الخطوات من الأول إلى الثالث في المخطوطة بالتتابع لإعداد ملفات الإدخال قبل المضي قدما. ابدأ بتحميل المكتبات اللازمة.لإجراء تصفية غير محددة ، قم أولا باستخراج مصفوفة أعداد القراءة التي تم الحصول عليها مسبقا وإنشاء قائمة بالميزات باستخدام وظيفة DGEList من حزمة edgeR ، حيث تمثل الصفوف الجينات والأعمدة تمثل العينات. بعد ذلك ، قم بتحويل البيانات من مقياس خام إلى أعداد لكل مليون باستخدام وظيفة CPM من حزمة edgeR ، واحتفظ ب exons بأعداد أكبر من عتبة قابلة للتعيين. تحتوي مجموعة البيانات هذه على ست عينات.ومن ثم ، يتم تعيين CPM على أكثر من عينة واحدة وثلاث عينات على الأقل من أصل ستة. قم بتسوية الأعداد عبر العينات باستخدام الدالة calcNormFactors من حزمة edgeR باستخدام قيم المتوسط المقتطع ل M. ستحسب هذه الوظيفة عوامل القياس لضبط أحجام المكتبة.استخدم جدول العينة الذي تم إنشاؤه مسبقا لإنشاء مصفوفة التصميم لتحديد الشروط التجريبية لكل عينة. قم بتشغيل وظيفة voom لحزمة limma لمعالجة بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي لتقدير التباين. ستولد هذه الوظيفة أوزانا دقيقة لتصحيح ضوضاء عد بواسون وتحويل أعداد مستوى إكسون لتسجيل عددين لكل مليون أو logCPM.قم بتشغيل الدالة lmfit لملاءمة النماذج الخطية مع بيانات التعبير لكل إكسون. ثم قم بتشغيل وظيفة eBayes لحساب الإحصائيات المستندة إلى التجريبية للنموذج المجهز للكشف عن تعبير exon التفاضلي. حدد مصفوفة تباين للمقارنات التجريبية ذات الأهمية.استخدم التناقضات. دالة الملاءمة للحصول على المعاملات والأخطاء القياسية لكل زوج من المقارنات. قم بتشغيل diffSplice على النموذج المجهز لاختبار الاختلافات في استخدام exon للجينات بين النوع البري والضربة القاضية.استكشف النتائج الأعلى تصنيفا باستخدام دالة topSplice حيث يعطي الاختبار الذي يساوي t ترتيبا ل AS exons والاختبار المتساوي ل simes يعطي ترتيبا للجينات. قم بتشغيل الدالة plotSplice لرسم النتائج. عند وضع الجين محل الاهتمام في وسيطة معرف الجين ، تظهر النقاط الحمراء الإكسونات المعبر عنها بشكل تفاضلي.قم بإنشاء قطعة أرض بركان باستخدام حزمة الموصلات الحيوية EnhancedVolcano لعرض الإكسونات المعبر عنها بشكل تفاضلي. لاستخدام rMATS، تأكد من تثبيت أحدث إصدار من rMATS الإصدار 4.1.1 إما باستخدام conda أو GitHub في دليل العمل. انتقل إلى المجلد الذي يحتوي على ملفات bam التي تم الحصول عليها بعد التعيين.قم بإعداد الملفات النصية كما هو مطلوب بواسطة rMATS لشرطي نسخ اسم ملفات bam ومسارها مفصولا بفاصلة. قم بتشغيل rmas. PY باستخدام ملفي نص الإدخال اللذين تم إنشاؤهما ويصفان مسار ملفات BAM والتعليق التوضيحي.GTF تم الحصول عليها سابقا. يؤدي هذا إلى إنشاء مجلد إخراج يحتوي rmats_out ملفات نصية تصف الإحصائيات بما في ذلك قيم P ومستويات التضمين لكل حدث ربط بشكل منفصل. استخدم مازر حزمة الموصلات الحيوية لاستكشاف نتائج rMATS.قم بتحميل التقاطع ويقوم exon بحساب الملفات النصية بامتداد JCEC في كائن maser وقم بتضمين ما لا يقل عن خمسة قراءات متوسطة لكل حدث ربط لتصفية النتيجة بناء على التغطية. لتصور نتائج rMATS ، قم أولا بتشغيل وظيفة topEvents من حزمة maser ، وتحديد أحداث الربط المهمة بمعدل اكتشاف خاطئ يبلغ 10٪ وتغيير لا يقل عن 10٪ في النسبة المئوية المقسمة أو PSI. تحقق من أحداث الجينات للجينات الفردية ذات الأهمية وارسم قيم PSI لكل حدث ربط لهذا الجين.قم بإنشاء مخطط بركان عن طريق تحديد نوع الحدث. استخدم نتائج أحداث الربط التي تم الحصول عليها باستخدام rMATS في شكل ملفات نصية لإنشاء مؤامرات الساشيمي باستخدام حزمة rmats2sashimiplot. تظهر مؤامرة الساشيمي حدث إكسون تم تخطيه في جين Wnk1.يمثل كل صف عينة RNA-seq ، وثلاث نسخ مكررة من النوع البري وضربة قاضية Mbnl1. يظهر الارتفاع تغطية القراءة في RPKM وتصور الأقواس المتصلة قراءات التقاطع عبر exons. يوضح الجزء السفلي الأشكال المتماثلة البديلة لنموذج الجينات المشروحة.يمكن ملاحظة تغيير كبير في الطيات وأدلة إحصائية قوية على وجود اختلافات حقيقية في الجينات الموجودة في الأرباع العلوية اليسرى أو اليمنى من مخططات البركان التي تم الحصول عليها باستخدام diffSplice و DEXSeq. تم العثور على إكسون كاسيت يختلف بين الظروف المختلفة للجين Wnk1. أظهر مخطط استخدام الإكسون التفاضلي دليلا على الربط التفاضلي في خمسة مواقع إكسون بالقرب من Wnk1.6.45 ، مع احتمال أن يتم تقسيم الإكسونات المميزة باللون الوردي في عينات خروج المغلوب Mbnl1 مقارنة بالنوع البري.ساعدت قطعة البركان للجينات التي يتم تقسيمها بدلا من ذلك على التمييز بين الجينات التي تم استبعادها من النوع البري وتلك التي تم تضمينها في النوع البري. تم تصور أنواع أحداث الربط SE و A5SS و A3SS و MXE و RI باستخدام مخططات الساشيمي لأهم الجينات لتلك الأحداث. لوحظ نشاط APA التفاضلي في ثلاث مناطق رئيسية غير مترجمة من الجينات باستخدام قطع البركان.تم تصور نتائج استخدام موقع PA ذات التفاضل الكبير التي تم الحصول عليها من خطوط أنابيب مختلفة باستخدام مخطط الحدث. يمكن ملاحظة تحول كبير من البعد إلى القريب من استخدام موقع PA في الضربات القاضية المزدوجة في كل من الجينات FOSL1 و Papola. تم تحديد متوسط التغطية في المناطق المحيطة الراسية في مواقع انقسام السلطة الفلسطينية المعروفة على مستوى الجينوم باستخدام مخطط تشخيصي.تأكد من استخدام المعلمات مثل المعلومات الخاصة بالنقل والسماح بالتداخل المتعدد بشكل صحيح عند إنشاء مقاييس العدد. يعد تركيب النموذج الخطي وتوليد أزواج التباين أمرا مهما للمقارنة المناسبة. بالنسبة إلى rMATS ، تأكد من تعيين جميع المعلمات بشكل صحيح وفقا لبياناتك قبل تشغيل الأمر.يمكن استخدام الجينات التي تم الحصول عليها من نشاط الربط التفاضلي لإجراء تحليل إثراء مجموعة الجينات. يمكن استخدام أداة أخرى تسمى MISO لمزيد من التحليل القائم على الأحداث.

Research

JoVE Journal

Biology

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

RNA-يليها تحليل Transcriptomes في المعاملة والثرومبين الإنسان الرئوي مراقبة الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

استنزاف الحمض النووي الريبي الريباسي لMetagenomic الوتر البعوض RNA-يليها

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

الثقافات البديلة لافرة القوة البشرية الجذعية إنتاج الخلية، الصيانة، والتحليل الوراثي

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

الكشف عن البديل خلال الربط طلائي-الوسيطة الانتقالية

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

والتجريبية وبروتوكول المعلوماتية الحيوية لتحليل-RNA وما يليها من دور التعرض للضوء الكمون في النمر الآسيوي البعوض،<em&gt; بحمى الضنك</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

تحديد سرعة التفاعلات الكيميائية الوراثية في<em&gt; خميرة الخباز</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Methods to Discover Alternative Promoter Usage and Transcriptional Regulation of Murine Bcrp1

طرق لاكتشاف المروج البديل الاستخدام وتنظيم الترانسكربتي من الفئران Bcrp1

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually ...

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

تحديد المنظمين رواية نتح النبات من خلال فحص التصوير الحراري على نطاق واسع في Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq

خط أنابيب المعلوماتية الحيوية للتحقيق في التطور الجزيئي والتعبير الجيني باستخدام الحمض النووي الريبي-seq

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus ...