Name: identification of alternative splicing and polyadenylation in rna-seq data
Uploaded: 2021-06-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af et australsk forskningsråd (ARC) Future Fellowship (FT16010043) og ANU Futures Scheme.

1. Installation af værktøjer og R-pakker, der anvendes i analysen
<ol><li>Conda er en populær og fleksibel pakkehåndtering, der muliggør praktisk installation af pakker med deres afhængigheder på tværs af alle platforme. Brug 'Anaconda' (conda-pakkehåndtering) til at installere 'conda', som kan bruges til at installere de værktøjer/pakker, der kræves til analysen.</li>
	<li>Download 'Anaconda' i henhold til systemkravene fra https://www.anaconda.com/products/individual#Downloads og installer ...

<ol>
	<li>Katz, Y., Wang, E. T., Airoldi, E. M., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+design+of+RNA+sequencing+experiments+for+identifying+isoform+regulation.">Analysis and design of RNA sequencing experiments for identifying isoform regulation.</a> Nature Methods. 7 (12), 1009-1015 (2010).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+alternative+splicing+and+its+regulation.">Mechanism of alternative splicing and its regulation.</a> Biomedical Reports. 3 (2), 152-158 (2015).</li><li>Mehmood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+differential+splicing+tools+for+RNA-seq+studies.">Systematic evaluation of differential splicing tools for RNA-seq studies.</a> Briefings in Bioinformatics. 21 (6), 2052-2065 (2020).</li><li>Movassat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+between+alternative+polyadenylation+and+alternative+splicing+is+limited+to+terminal+introns.">Coupling between alternative polyadenylation and alternative splicing is limited to terminal introns.</a> RNA Biology. 13 (7), 646-655 (2016).</li><li>Tian, B., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+polyadenylation+of+mRNA+precursors.">Alternative polyadenylation of mRNA precursors.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (1), 18-30 (2017).</li><li>Herrmann, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PolyASite+2.0:+a+consolidated+atlas+of+polyadenylation+sites+from+3'+end+sequencing.">PolyASite 2.0: a consolidated atlas of polyadenylation sites from 3' end sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 48 (1), 174-179 (2020).</li><li>Liu, R., Loraine, A. E., Dickerson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparisons+of+computational+methods+for+differential+alternative+splicing+detection+using+RNA-seq+in+plant+systems.">Comparisons of computational methods for differential alternative splicing detection using RNA-seq in plant systems.</a> BMC Bioinformatics. 15 (1), 364 (2014).</li><li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis.">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biology. 17 (1), 13 (2016).</li><li>Anders, S., Reyes, A., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+differential+usage+of+exons+from+RNA-seq+data.">Detecting differential usage of exons from RNA-seq data.</a> Genome Research. 22 (10), 2008-2017 (2012).</li><li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies.">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), 47 (2014).</li><li>Shen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rMATS:+Robust+and+flexible+detection+of+differential+alternative+splicing+from+replicate+RNA-Seq+data.">rMATS: Robust and flexible detection of differential alternative splicing from replicate RNA-Seq data.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (51), 5593-5601 (2014).</li><li>Mehmood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+differential+splicing+tools+for+RNA-seq+studies.">Systematic evaluation of differential splicing tools for RNA-seq studies.</a> Briefings in bioinformatics. 21 (6), 2052-2065 (2020).</li><li>Kanitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+assessment+of+methods+for+the+computational+inference+of+transcript+isoform+abundance+from+RNA-seq+data.">Comparative assessment of methods for the computational inference of transcript isoform abundance from RNA-seq data.</a> Genome biology. 16 (1), 1-26 (2015).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Sznajder, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+MBNL1+induces+RNA+misprocessing+in+the+thymus+and+peripheral+blood.">Loss of MBNL1 induces RNA misprocessing in the thymus and peripheral blood.</a> Nature Communications. 11, 1-11 (2020).</li><li>Batra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+MBNL+leads+to+disruption+of+developmentally+regulated+alternative+polyadenylation+in+RNA-mediated+disease.">Loss of MBNL leads to disruption of developmentally regulated alternative polyadenylation in RNA-mediated disease.</a> Molecular Cell. 56 (2), 311-322 (2014).</li><li>Leinonen, R., Sugawara, H., Shumway, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sequence+read+archive.">The sequence read archive.</a> Nucleic acids research. 39, 19-21 (2010).</li><li>Tange, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> GNU parallel-the command-line power tool. 36, 42-47 (2011).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAR:+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner.">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li><li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=edgeR:+a+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data.">edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).</li><li>Robinson, M. D., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scaling+normalization+method+for+differential+expression+analysis+of+RNA-seq+data.">A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data.</a> Genome Biology. 11 (3), 25 (2010).</li><li>Veiga, D. F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=maser:+Mapping+Alternative+Splicing+Events+to+pRoteins.">maser: Mapping Alternative Splicing Events to pRoteins.</a> R package version 1.4.0. , (2019).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10 (13), 25 (2009).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Ram&#237;rez, F., D&#252;ndar, F., Diehl, S., Gr&#252;ning, B. A., Manke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=deepTools:+a+flexible+platform+for+exploring+deep-sequencing+data.">deepTools: a flexible platform for exploring deep-sequencing data.</a> Nucleic acids research. 42 (1), 187-191 (2014).</li><li>Merino, G. A., Conesa, A., Fern&#225;ndez, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+benchmarking+of+workflows+for+detecting+differential+splicing+and+differential+expression+at+isoform+level+in+human+RNA-seq+studies.">A benchmarking of workflows for detecting differential splicing and differential expression at isoform level in human RNA-seq studies.</a> Briefings in bioinformatics. 20 (2), 471-481 (2019).</li><li>Chhangawala, S., Rudy, G., Mason, C. E., Rosenfeld, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+read+length+on+quantification+of+differentially+expressed+genes+and+splice+junction+detection.">The impact of read length on quantification of differentially expressed genes and splice junction detection.</a> Genome biology. 16 (1), 1-10 (2015).</li><li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis.">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biol. 17, 13 (2016).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks.">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat Protoc. 7 (3), 562-578 (2012).</li><li>Li, B., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RSEM:+accurate+transcript+quantification+from+RNA-Seq+data+with+or+without+a+reference+genome.">RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome.</a> BMC Bioinformatics. 12, 323 (2011).</li><li>Bray, N. L., Pimentel, H., Melsted, P., Pachter, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-optimal+probabilistic+RNA-seq+quantification.">Near-optimal probabilistic RNA-seq quantification.</a> Nat Biotechnol. 34 (5), 525-527 (2016).</li></ol>

I denne undersøgelse evaluerede vi exon-baserede og begivenhedsbaserede tilgange til at detektere AS og APA i bulk RNA-Seq og 3 'slutsekventeringsdata. De exonbaserede AS-tilgange producerer både en liste over differentielt udtrykte exoner og en rangordning på genniveau ordnet efter den statistiske signifikans af den samlede differentielle splejsningsaktivitet på genniveau (tabel 1-2, 4-5). For diffSplice-pakken bestemmes differentiel brug ved at tilpasse vægtede lineære modeller på exon-niveau fo...

RNA-seq har været meget udbredt gennem årene typisk til estimering af differentiel genekspression og genopdagelse1. Derudover kan det også bruges til at estimere varierende exon-niveau brug på grund af gen, der udtrykker forskellige isoformer, hvilket bidrager til en bedre forståelse af genregulering på post-transkriptionelt niveau. Størstedelen af eukaryote gener genererer forskellige isoformer ved alternativ splejsning (AS) for at øge mangfoldigheden af mRNA-ekspression. AS-begivenheder kan opdeles i forskellige mønstre: spring over komplette exons (SE), hvor en ("kassette") exon fjernes helt ud af udskriften sammen med dens flankerende introns; alternativ (donor) 5' splejsningssted (A5SS) og alternativ 3' (acceptor) splejsningssted (A3SS), når to eller flere splejsningssteder er til stede i hver ende af en exon retention af introns (RI), når en intron bevares inden for det modne mRNA-transkript og gensidig udelukkelse af exonbrug (MXE), hvor kun en af de to tilgængelige exoner kan bevares ad gangen 2,3. Alternativ polyadenylering (APA) spiller også en vigtig rolle i reguleringen af genekspression ved hjælp af alternative poly (A) steder til at generere flere mRNA-isoformer fra et enkelt transkript4. De fleste polyadenyleringssteder (pA'er) er placeret i den 3' uoversatte region (3' UTR'er), der genererer mRNA-isoformer med forskellige 3' UTR-længder. Da 3' UTR er det centrale knudepunkt for genkendelse af regulatoriske elementer, kan forskellige 3' UTR-længder påvirke mRNA-lokalisering, stabilitet og translation5. Der er en klasse af 3 'ende sekventeringsassays optimeret til at detektere APA, der adskiller sig i detaljerne i protokollen6. Rørledningen beskrevet her er designet til PolyA-seq, men kan tilpasses til andre protokoller som beskrevet.
I denne undersøgelse præsenterer vi en pipeline af differentielle exonanalysemetoder7,8 (figur 1), som kan opdeles i to brede kategorier: exonbaseret (DEXSeq9, diffSplice 10) og begivenhedsbaseret (replikeret multivariat analyse af transkriptionsplejsning (rMATS)11). De exon-baserede metoder sammenligner foldændringen på tværs af betingelser for individuelle exoner mod et mål for den samlede genfoldændring for at kalde differentielt udtrykt exon-brug og ud fra det beregne et mål på genniveau for AS-aktivitet. Hændelsesbaserede metoder bruger exon-intron-spanning junction-læsninger til at registrere og klassificere specifikke splejsningshændelser såsom exon-spring eller tilbageholdelse af introns og skelne mellem disse AS-typer i output3. Disse metoder giver således supplerende synspunkter til en komplet analyse af AS12,13. Vi valgte DEXSeq (baseret på DESeq214 DGE-pakken) og diffSplice (baseret på Limma10 DGE-pakken) til undersøgelsen, da de er blandt de mest anvendte pakker til differentiel splejsningsanalyse. rMATS blev valgt som en populær metode til begivenhedsbaseret analyse. En anden populær begivenhedsbaseret metode er MISO (Blanding af isoformer)1. For APA tilpasser vi den exon-baserede tilgang.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62636/62636fig01.jpg"> Figur 1. Analyse pipeline. Rutediagram over de trin, der bruges i analysen. Trin inkluderer: indhentning af data, udførelse af kvalitetskontrol og læsejustering efterfulgt af optælling af læsninger ved hjælp af kommentarer til kendte exons, introns og pA-websteder, filtrering for at fjerne lave tællinger og normalisering. PolyA-seq-data blev analyseret for alternative pA-steder ved hjælp af diffSplice/DEXSeq-metoder, bulk RNA-Seq blev analyseret for alternativ splejsning på exonniveau med diffSplice/DEXseq-metoder og AS-hændelser analyseret med rMATS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62636/62636fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
RNA-seq-dataene, der blev brugt i denne undersøgelse, blev erhvervet fra Gene Expression Omnibus (GEO) (GSE138691)15. Vi brugte mus RNA-seq data fra denne undersøgelse med to tilstandsgrupper: wild-type (WT) og muskelblind-lignende type 1 knockout (Mbnl1 KO) med tre replikater hver. For at demonstrere differentiel analyse af brugen af polyadenyleringsstedet opnåede vi museembryofibroblaster (MEF'er) PolyA-seq-data (GEO-tiltrædelse GSE60487)16. Dataene har fire tilstandsgrupper: Wild-type (WT), Muscleblind-lignende type1/type 2 dobbelt knockout (Mbnl1/2 DKO), Mbnl 1/2 DKO med Mbnl3 knockdown (KD) og Mbnl1/2 DKO med Mbnl3 kontrol (Ctrl). Hver tilstandsgruppe består af to replikater.
<table border="1" fo:font-size="5px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>GEO tiltrædelse</td>
			<td>SRA Kør nummer</td>
			<td>Eksempel på navn</td>
			<td>Betingelse</td>
			<td>Kopiere</td>
			<td>Væv</td>
			<td>Sekventering</td>
			<td>Læs længde</td>
		</tr><tr><td rowspan="6">RNA-Seq</td>
			<td>GSM4116218</td>
			<td>SRR10261601</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_1</td>
			<td>Mbnl1 knockout</td>
			<td>Rep 1</td>
			<td>Thymus</td>
			<td>Parret ende</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM4116219</td>
			<td>SRR10261602</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_2</td>
			<td>Mbnl1 knockout</td>
			<td>Repræsentant 2</td>
			<td>Thymus</td>
			<td>Parret ende</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM4116220</td>
			<td>SRR10261603</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_3</td>
			<td>Mbnl1 knockout</td>
			<td>Rep 3</td>
			<td>Thymus</td>
			<td>Parret ende</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM4116221</td>
			<td>SRR10261604</td>
			<td>WT_Thymus_1</td>
			<td>Vild type</td>
			<td>Rep 1</td>
			<td>Thymus</td>
			<td>Parret ende</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM4116222</td>
			<td>SRR10261605</td>
			<td>WT_Thymus_2</td>
			<td>Vild type</td>
			<td>Repræsentant 2</td>
			<td>Thymus</td>
			<td>Parret ende</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM4116223</td>
			<td>SRR10261606</td>
			<td>WT_Thymus_3</td>
			<td>Vild type</td>
			<td>Rep 3</td>
			<td>Thymus</td>
			<td>Parret ende</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td rowspan="8">3P-Seq</td>
			<td>GSM1480973</td>
			<td>SRR1553129</td>
			<td>WT_1</td>
			<td>Vildtype (WT)</td>
			<td>Rep 1</td>
			<td>Museembryonale fibroblaster (MEF'er)</td>
			<td>Single-end</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480974</td>
			<td>SRR1553130</td>
			<td>WT_2</td>
			<td>Vildtype (WT)</td>
			<td>Repræsentant 2</td>
			<td>Museembryonale fibroblaster (MEF'er)</td>
			<td>Single-end</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480975</td>
			<td>SRR1553131</td>
			<td>DKO_1</td>
			<td>Mbnl 1/2 dobbelt knockout (DKO)</td>
			<td>Rep 1</td>
			<td>Museembryonale fibroblaster (MEF'er)</td>
			<td>Single-end</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480976</td>
			<td>SRR1553132</td>
			<td>DKO_2</td>
			<td>Mbnl 1/2 dobbelt knockout (DKO)</td>
			<td>Repræsentant 2</td>
			<td>Museembryonale fibroblaster (MEF'er)</td>
			<td>Single-end</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480977</td>
			<td>SRR1553133</td>
			<td>DKOsiRNA_1</td>
			<td>Mbnl 1/2 dobbelt knockout med Mbnl 3 siRNA (KD)</td>
			<td>Rep 1</td>
			<td>Museembryonale fibroblaster (MEF'er)</td>
			<td>Single-end</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480978</td>
			<td>SRR1553134</td>
			<td>DKOsiRNA_2</td>
			<td>Mbnl 1/2 dobbelt knockout med Mbnl 3 siRNA (KD)</td>
			<td>Repræsentant 2</td>
			<td>Museembryonale fibroblaster (MEF'er)</td>
			<td>Single-end</td>
			<td>36 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480979</td>
			<td>SRR1553135</td>
			<td>DKONTsiRNA_1</td>
			<td>Mbnl 1/2 dobbelt knockout med ikke-målrettet siRNA (Ctrl)</td>
			<td>Rep 1</td>
			<td>Museembryonale fibroblaster (MEF'er)</td>
			<td>Single-end</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480980</td>
			<td>SRR1553136</td>
			<td>DKONTsiRNA_2</td>
			<td>Mbnl 1/2 dobbelt knockout med ikke-målrettet siRNA (Ctrl)</td>
			<td>Repræsentant 2</td>
			<td>Museembryonale fibroblaster (MEF'er)</td>
			<td>Single-end</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1. Resumé af RNA-Seq og PolyA-seq datasæt, der anvendes til analysen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Not relevent for computational study</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of alternative splicing and polyadenylation in rna-seq data

Ud over den typiske analyse af RNA-Seq til måling af differentiel genekspression (DGE) på tværs af eksperimentelle / biologiske tilstande kan RNA-seq-data også bruges til at udforske andre komplekse reguleringsmekanismer på exon-niveau. Alternativ splejsning og polyadenylering spiller en afgørende rolle i et gens funktionelle mangfoldighed ved at generere forskellige isoformer til regulering af genekspression på post-transkriptionelt niveau, og begrænsning af analyser til hele genniveauet kan gå glip af dette vigtige regulatoriske lag. Her demonstrerer vi detaljerede trin for trin analyser til identifikation og visualisering af differentiel exon og polyadenylering site brug på tværs af betingelser ved hjælp af Bioconductor og andre pakker og funktioner, herunder DEXSeq, diffSplice fra Limma-pakken og rMATS.

Efter at have kørt ovenstående trinvise arbejdsgang er AS- og APA-analyseoutput og repræsentative resultater i form af tabeller og dataplot, der genereres som følger.
SOM: Det vigtigste output af AS-analysen (supplerende tabel 1 for diffSplice; Tabel 2 for DEXSeq) er en liste over exoner, der viser differentieret brug på tværs af betingelser, og en liste over gener, der viser signifikant samlet splejsningsaktivitet af en eller flere a...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data at JoVE.com

Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data

Alternativ splejsning (AS) og alternativ polyadenylering (APA) udvider mangfoldigheden af transkriptionsisoformer og deres produkter. Her beskriver vi bioinformatiske protokoller til analyse af bulk RNA-seq og 3 'slutsekventeringsassays for at detektere og visualisere AS og APA, der varierer på tværs af eksperimentelle forhold.

Identifikation af alternativ splejsning og polyadenylering i RNA-seq-data

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also ...

Denne protokol giver en omfattende forståelse af genisoformer genereret af alternativ splejsning og polyadenylering ved at give en trinvis arbejdsgang til at identificere differentielle splejsningssteder, differentielt udtrykte exoner og poly (A) steder. Den største fordel ved denne protokol er, at den evaluerer både exonbaserede og begivenhedsbaserede metoder til undersøgelse af alternativ splejsning. Det anvender også exonbaseret metode til at studere alternativ polyadenylation.R Markdown-filerne, der indeholder koder og noter til AS- og AP-analyse, er blevet leveret. Det ville være tilrådeligt at følge trinene i R Markdown-filen og nå noten for hvert trin omhyggeligt. Hvis du vil identificere differentiel splejsning ved hjælp af diffSplice fra limma, skal du følge filen med R-notesbogen.Forbered inputfilerne som beskrevet i tekstmanuskriptet. Sørg for, at trin et til tre i manuskriptet er blevet fulgt sekventielt for at forberede inputfiler, før du går videre. Begynd med at indlæse de nødvendige biblioteker.For at udføre ikke-specifik filtrering skal du først udtrække matrixen over læsetællinger, der er opnået tidligere, og oprette en liste over funktioner ved hjælp af DGEList-funktionen fra edgeR-pakken, hvor rækker repræsenterer gener, og kolonner repræsenterer prøver. Transformér derefter dataene fra rå skala til antal pr. million ved hjælp af CPM-funktionen fra edgeR-pakken, og hold exoner med tællinger, der er større end en tærskel, der kan indstilles. Dette datasæt indeholder seks eksempler.Derfor er CPM sat til mere end en og mindst tre prøver ud af seks. Normaliser tællingerne på tværs af prøver med funktionen calcNormFactors fra edgeR-pakken ved hjælp af Trimmet middelværdi af M. Denne funktion beregner skaleringsfaktorer for at justere biblioteksstørrelser.Brug den tidligere genererede eksempeltabel til at oprette designmatrixen til at definere de eksperimentelle betingelser for hver prøve. Kør limma-pakkens voom-funktion for at behandle RNA-sekventeringsdata for at estimere variansen. Denne funktion genererer præcisionsvægte for at korrigere for Poisson-tællestøj og omdanne exonniveautællingerne til at logge to tællinger pr. Million eller logCPM.Kør lmfit-funktionen for at tilpasse lineære modeller til udtryksdataene for hver exon. Kør derefter eBayes-funktionen for at beregne empirisk baseret statistik for den tilpassede model til at detektere differentiel exon-ekspression. Definer en kontrastmatrix til de eksperimentelle sammenligninger af interesse.Brug kontrasterne. Fit funktion for at opnå koefficienter og standardfejl for hvert par sammenligninger. Kør diffSplice på den tilpassede model for at teste forskellene i exon-brug af gener mellem vildtype og knockout.Udforsk de bedst rangerede resultater ved hjælp af topSplice-funktionen, hvor en test lig med t giver en rangordning af AS-exoner, og test lig med simes giver en rangordning af gener. Kør plotSplice-funktionen for at afbilde resultaterne. Ved at sætte genet af interesse i gen-ID-argumentet viser de røde punkter de differentielt udtrykte exoner.Generer et vulkanplot ved hjælp af EnhancedVolcano biolederpakke for at udstille de differentielt udtrykte exoner. Hvis du vil bruge rMATS, skal du sikre dig, at den nyeste version af rMATS version 4.1.1 er installeret enten ved hjælp af conda eller GitHub i arbejdsmappen. Gå til mappen, der indeholder bam-filer, der er hentet efter kortlægning.Forbered tekstfiler som krævet af rMATS for de to betingelser for kopiering af navnet på bam-filer og deres sti adskilt af et komma. Kør rmas. py ved hjælp af de to genererede inputtekstfiler, der beskriver stien til BAM-filerne og annotationen.GTF-fil opnået tidligere. Dette genererer en outputmappe rmats_out, der indeholder tekstfiler, der beskriver statistikker, herunder P-værdier og inklusionsniveauer for hver splejsningshændelse separat. Brug biolederpakken maser til at udforske rMATS-resultaterne.Indlæs forbindelses- og exontællingstekstfilerne med udvidelsen JCEC i maserobjektet, og inkluder mindst fem gennemsnitlige læsninger pr. splejsningshændelse for at filtrere resultatet baseret på dækning. For at visualisere rMATS-resultaterne skal du først køre topEvents-funktionen fra maserpakken og vælge de signifikante splejsningshændelser med en falsk opdagelseshastighed på 10% og en ændring på mindst 10% i procent splejset i eller PSI. Kontroller genhændelserne for individuelle gener af interesse, og plot PSI-værdier for hver splejsningshændelse af det pågældende gen.Generer et vulkanplot ved at angive hændelsestypen. Brug resultaterne af splejsningshændelser opnået med rMATS i form af tekstfiler til at generere sashimi-plots ved hjælp af rmats2sashimiplot-pakken. Sashimi-plottet viser en sprunget exon-begivenhed i Wnk1-genet.Hver række repræsenterer en RNA-seq-prøve, tre replikater af vildtype og Mbnl1 knockout. Højden viser læsedækning i RPKM, og forbindelsesbuerne viser krydslæsninger på tværs af exons. Den nederste del viser kommenterede genmodel alternative isoformer.En betydelig foldændring og stærke statistiske beviser for ægte forskelle kan observeres i generne placeret øverst til venstre eller højre kvadranter af vulkanplotterne opnået ved hjælp af diffSplice og DEXSeq. En kassette exon viste sig at variere mellem forskellige betingelser for genet Wnk1. Det differentielle exon-brugsplot viste tegn på differentiel splejsning på fem exon-steder nær Wnk1.6.45, hvor exonerne fremhævet med lyserødt sandsynligvis vil blive splejset ud i Mbnl1 knockout-prøver sammenlignet med vildtype.Vulkanplottet af gener, der alternativt splejses, hjalp med at skelne mellem de gener, der blev udelukket fra vildtype, og dem, der var inkluderet i vildtype. Typerne af splejsningshændelser SE, A5SS, A3SS, MXE og RI blev visualiseret ved hjælp af sashimi-plots af de øverste signifikante gener af disse begivenheder. Den differentierede APA-aktivitet i tre primære uoversatte regioner af gener blev observeret ved hjælp af vulkanplotter.De signifikant differentierede PA-webstedsbrugsresultater, der blev erhvervet fra forskellige rørledninger, blev visualiseret ved hjælp af begivenhedsplot. En signifikant distal til proksimal ændring af PA-webstedsbrug i dobbelt knockouts kan observeres i begge gener FOSL1 og Papola. Den gennemsnitlige dækning i flankerende regioner forankret på kendte PA-spaltningssteder på genom-dækkende niveau blev bestemt ved hjælp af et diagnostisk plot.Sørg for, at parametrene såsom transpecifik information og tillad multioverlapning bruges korrekt, når der genereres optællingsmålinger. Lineær modeltilpasning og generering af kontrastpar er vigtig for korrekt sammenligning. For rMATS skal du sikre dig, at alle parametre er indstillet korrekt i henhold til dine data, før du kører kommandoen.Generne opnået fra differentiel splejsningsaktivitet kunne bruges til at udføre gensætberigelsesanalyse. Et andet værktøj kaldet MISO kunne bruges til yderligere begivenhedsbaseret analyse.

Research

JoVE Journal

Biology

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

RNA-seq Analyse af Transcriptomes i behandlet Thrombin-og humant kontrol Pulmonal mikrovaskulære endotelceller

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

Udtømning af ribosomalt RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Alternative kulturer til human Pluripotente Stem Cell Produktion, vedligeholdelse og Genetisk analyse

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Påvisning af alternativ splejsning løbet Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

En eksperimentel og Bioinformatik Protokol for RNA-seq Analyser af Fotoperiodisk diapause i den asiatiske Tiger Mosquito,<em&gt; Aedes albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Hurtig identifikation af kemiske genetisk samspil i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Methods to Discover Alternative Promoter Usage and Transcriptional Regulation of Murine Bcrp1

Metoder til at opdage Alternativ Promoter Usage og Transkriptionel forordning af murint Bcrp1

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually ...

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Identifikation af nye regulatorer af plantetranspiration ved storstilet termisk billeddannelse screening i Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq

En bioinformatikrørledning til undersøgelse af molekylær udvikling og genekspression ved hjælp af RNA-seq

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus ...