Name: identification of alternative splicing and polyadenylation in rna-seq data
Uploaded: 2021-06-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data at JoVE.com

Deze studie werd ondersteund door een Australian Research Council (ARC) Future Fellowship (FT16010043) en ANU Futures Scheme.

1. Installatie van tools en R-pakketten die bij de analyse worden gebruikt
<ol><li>Conda is een populaire en flexibele pakketbeheerder die een gemakkelijke installatie van pakketten met hun afhankelijkheden op alle platforms mogelijk maakt. Gebruik 'Anaconda' (conda package manager) om 'conda' te installeren, wat kan worden gebruikt om de tools/pakketten te installeren die nodig zijn voor de analyse.</li>
	<li>Download 'Anaconda' volgens de systeemvereisten van https://www.anaconda.com/products/individua...

<ol>
	<li>Katz, Y., Wang, E. T., Airoldi, E. M., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+design+of+RNA+sequencing+experiments+for+identifying+isoform+regulation.">Analysis and design of RNA sequencing experiments for identifying isoform regulation.</a> Nature Methods. 7 (12), 1009-1015 (2010).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+alternative+splicing+and+its+regulation.">Mechanism of alternative splicing and its regulation.</a> Biomedical Reports. 3 (2), 152-158 (2015).</li><li>Mehmood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+differential+splicing+tools+for+RNA-seq+studies.">Systematic evaluation of differential splicing tools for RNA-seq studies.</a> Briefings in Bioinformatics. 21 (6), 2052-2065 (2020).</li><li>Movassat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+between+alternative+polyadenylation+and+alternative+splicing+is+limited+to+terminal+introns.">Coupling between alternative polyadenylation and alternative splicing is limited to terminal introns.</a> RNA Biology. 13 (7), 646-655 (2016).</li><li>Tian, B., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+polyadenylation+of+mRNA+precursors.">Alternative polyadenylation of mRNA precursors.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (1), 18-30 (2017).</li><li>Herrmann, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PolyASite+2.0:+a+consolidated+atlas+of+polyadenylation+sites+from+3'+end+sequencing.">PolyASite 2.0: a consolidated atlas of polyadenylation sites from 3' end sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 48 (1), 174-179 (2020).</li><li>Liu, R., Loraine, A. E., Dickerson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparisons+of+computational+methods+for+differential+alternative+splicing+detection+using+RNA-seq+in+plant+systems.">Comparisons of computational methods for differential alternative splicing detection using RNA-seq in plant systems.</a> BMC Bioinformatics. 15 (1), 364 (2014).</li><li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis.">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biology. 17 (1), 13 (2016).</li><li>Anders, S., Reyes, A., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+differential+usage+of+exons+from+RNA-seq+data.">Detecting differential usage of exons from RNA-seq data.</a> Genome Research. 22 (10), 2008-2017 (2012).</li><li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies.">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), 47 (2014).</li><li>Shen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rMATS:+Robust+and+flexible+detection+of+differential+alternative+splicing+from+replicate+RNA-Seq+data.">rMATS: Robust and flexible detection of differential alternative splicing from replicate RNA-Seq data.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (51), 5593-5601 (2014).</li><li>Mehmood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+differential+splicing+tools+for+RNA-seq+studies.">Systematic evaluation of differential splicing tools for RNA-seq studies.</a> Briefings in bioinformatics. 21 (6), 2052-2065 (2020).</li><li>Kanitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+assessment+of+methods+for+the+computational+inference+of+transcript+isoform+abundance+from+RNA-seq+data.">Comparative assessment of methods for the computational inference of transcript isoform abundance from RNA-seq data.</a> Genome biology. 16 (1), 1-26 (2015).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Sznajder, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+MBNL1+induces+RNA+misprocessing+in+the+thymus+and+peripheral+blood.">Loss of MBNL1 induces RNA misprocessing in the thymus and peripheral blood.</a> Nature Communications. 11, 1-11 (2020).</li><li>Batra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+MBNL+leads+to+disruption+of+developmentally+regulated+alternative+polyadenylation+in+RNA-mediated+disease.">Loss of MBNL leads to disruption of developmentally regulated alternative polyadenylation in RNA-mediated disease.</a> Molecular Cell. 56 (2), 311-322 (2014).</li><li>Leinonen, R., Sugawara, H., Shumway, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sequence+read+archive.">The sequence read archive.</a> Nucleic acids research. 39, 19-21 (2010).</li><li>Tange, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> GNU parallel-the command-line power tool. 36, 42-47 (2011).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAR:+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner.">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li><li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=edgeR:+a+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data.">edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).</li><li>Robinson, M. D., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scaling+normalization+method+for+differential+expression+analysis+of+RNA-seq+data.">A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data.</a> Genome Biology. 11 (3), 25 (2010).</li><li>Veiga, D. F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=maser:+Mapping+Alternative+Splicing+Events+to+pRoteins.">maser: Mapping Alternative Splicing Events to pRoteins.</a> R package version 1.4.0. , (2019).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10 (13), 25 (2009).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Ram&#237;rez, F., D&#252;ndar, F., Diehl, S., Gr&#252;ning, B. A., Manke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=deepTools:+a+flexible+platform+for+exploring+deep-sequencing+data.">deepTools: a flexible platform for exploring deep-sequencing data.</a> Nucleic acids research. 42 (1), 187-191 (2014).</li><li>Merino, G. A., Conesa, A., Fern&#225;ndez, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+benchmarking+of+workflows+for+detecting+differential+splicing+and+differential+expression+at+isoform+level+in+human+RNA-seq+studies.">A benchmarking of workflows for detecting differential splicing and differential expression at isoform level in human RNA-seq studies.</a> Briefings in bioinformatics. 20 (2), 471-481 (2019).</li><li>Chhangawala, S., Rudy, G., Mason, C. E., Rosenfeld, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+read+length+on+quantification+of+differentially+expressed+genes+and+splice+junction+detection.">The impact of read length on quantification of differentially expressed genes and splice junction detection.</a> Genome biology. 16 (1), 1-10 (2015).</li><li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis.">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biol. 17, 13 (2016).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks.">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat Protoc. 7 (3), 562-578 (2012).</li><li>Li, B., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RSEM:+accurate+transcript+quantification+from+RNA-Seq+data+with+or+without+a+reference+genome.">RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome.</a> BMC Bioinformatics. 12, 323 (2011).</li><li>Bray, N. L., Pimentel, H., Melsted, P., Pachter, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-optimal+probabilistic+RNA-seq+quantification.">Near-optimal probabilistic RNA-seq quantification.</a> Nat Biotechnol. 34 (5), 525-527 (2016).</li></ol>

In deze studie evalueerden we exon-gebaseerde en event-gebaseerde benaderingen om AS en APA te detecteren in bulk RNA-Seq en 3'-end sequencinggegevens. De exon-gebaseerde AS-benaderingen produceren zowel een lijst van differentieel tot expressie gebrachte exonen als een rangschikking op genniveau, geordend op basis van de statistische significantie van de totale differentiële splicingactiviteit op genniveau (tabellen 1-2, 4-5). Voor het diffSplice-pakket wordt het differentiële gebruik bepaald door gew...

RNA-seq is in de loop der jaren op grote schaal gebruikt, meestal voor het schatten van differentiële genexpressie en genontdekking1. Bovendien kan het ook worden gebruikt om het gebruik op exonniveau te schatten als gevolg van gen dat verschillende isovormen tot expressie brengt, waardoor het bijdraagt aan een beter begrip van genregulatie op post-transcriptioneel niveau. De meerderheid van de eukaryote genen genereren verschillende isovormen door alternatieve splicing (AS) om de diversiteit van mRNA-expressie te vergroten. AS-gebeurtenissen kunnen worden onderverdeeld in verschillende patronen: het overslaan van complete exonen (SE) waarbij een ("cassette") exon volledig uit het transcript wordt verwijderd samen met de flankerende introns; alternatieve (donor) 5' splice site selection (A5SS) en alternatieve 3' (acceptor) splice site selection (A3SS) wanneer twee of meer splice sites aanwezig zijn aan beide uiteinden van een exon; retentie van introns (RI) wanneer een intron wordt bewaard binnen het volwassen mRNA-transcript en wederzijdse uitsluiting van exongebruik (MXE) waarbij slechts één van de twee beschikbare exonen tegelijk kan worden bewaard 2,3. Alternatieve polyadenylering (APA) speelt ook een belangrijke rol bij het reguleren van genexpressie met behulp van alternatieve poly (A) -sites om meerdere mRNA-isovormen te genereren uit een enkel transcript4. De meeste polyadenylation sites (pa's) bevinden zich in het 3' onvertaalde gebied (3' UTR's), waardoor mRNA-isovormen met diverse 3' UTR-lengtes worden gegenereerd. Aangezien de 3' UTR de centrale hub is voor het herkennen van regulerende elementen, kunnen verschillende 3' UTR-lengtes van invloed zijn op mRNA-lokalisatie, stabiliteit en translatie5. Er zijn een klasse van 3'-eindsequencingtests die zijn geoptimaliseerd om APA te detecteren die verschillen in de details van het protocol6. De hier beschreven pijplijn is ontworpen voor PolyA-seq, maar kan worden aangepast voor andere protocollen zoals beschreven.
In deze studie presenteren we een pijplijn van differentiële exon-analysemethoden 7,8 (figuur 1), die kunnen worden onderverdeeld in twee brede categorieën: exon-gebaseerd (DEXSeq9, diffSplice10) en gebeurtenisgebaseerd (multivariate analyse van transcriptsplitsing (rMATS)11). De op exon gebaseerde methoden vergelijken de vouwverandering over de omstandigheden van individuele exonen, met een maat voor de totale genplooiverandering om differentieel tot expressie gebracht exongebruik aan te roepen, en berekenen op basis daarvan een maat op genniveau van AS-activiteit. Op gebeurtenissen gebaseerde methoden gebruiken exon-intron-spanning junction reads om specifieke splicinggebeurtenissen zoals exon-overslaan of retentie van introns te detecteren en te classificeren, en onderscheiden deze AS-typen in de uitgang3. Deze methoden bieden dus complementaire weergaven voor een volledige analyse van AS 12,13. We selecteerden DEXSeq (gebaseerd op het DESeq214 DGE-pakket) en diffSplice (gebaseerd op het Limma10 DGE-pakket) voor de studie omdat ze tot de meest gebruikte pakketten voor differentiële splicinganalyse behoren. rMATS werd gekozen als een populaire methode voor event-based analyse. Een andere populaire op gebeurtenissen gebaseerde methode is MISO (Mixture of Isoforms)1. Voor APA passen we de exon-gebaseerde aanpak aan.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62636/62636fig01.jpg"> Figuur 1. Analysepijplijn. Stroomdiagram van de stappen die in de analyse zijn gebruikt. Stappen omvatten: het verkrijgen van de gegevens, het uitvoeren van kwaliteitscontroles en leesuitlijning gevolgd door het tellen van reads met behulp van annotaties voor bekende exonen, introns en pA-sites, filteren om lage tellingen en normalisatie te verwijderen. PolyA-seq-gegevens werden geanalyseerd voor alternatieve pA-locaties met behulp van diffSplice/DEXSeq-methoden, bulk RNA-Seq werd geanalyseerd voor alternatieve splicing op exon-niveau met diffSplice/DEXseq-methoden en AS-gebeurtenissen geanalyseerd met rMATS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62636/62636fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
De RNA-seq-gegevens die in dit onderzoek zijn gebruikt, zijn verkregen uit Gene Expression Omnibus (GEO) (GSE138691)15. We gebruikten muis RNA-seq-gegevens uit deze studie met twee conditiegroepen: wild-type (WT) en Muscleblind-like type 1 knockout (Mbnl1 KO) met elk drie replicaties. Om de analyse van het gebruik van differentiële polyadenylation-sites aan te tonen, verkregen we polyA-seq-gegevens van muizenembryoblasten (MEF's) (GEO Accession GSE60487)16. De gegevens hebben vier conditiegroepen: Wild-type (WT), Muscleblind-like type1/type 2 double knockout (Mbnl1/2 DKO), Mbnl 1/2 DKO met Mbnl3 knockdown (KD) en Mbnl1/2 DKO met Mbnl3 control (Ctrl). Elke conditiegroep bestaat uit twee replicaties.
<table border="1" fo:font-size="5px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>GEO Toetreding</td>
			<td>SRA Run nummer</td>
			<td>Voorbeeldnaam</td>
			<td>Conditie</td>
			<td>Nabootsen</td>
			<td>Weefsel</td>
			<td>Sequencing</td>
			<td>Leeslengte</td>
		</tr><tr><td rowspan="6">RNA-Seq</td>
			<td>GSM4116218</td>
			<td>SRR10261601</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_1</td>
			<td>Mbnl1 knock-out</td>
			<td>Rep 1</td>
			<td>Thymus</td>
			<td>Gekoppeld uiteinde</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM4116219</td>
			<td>SRR10261602</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_2</td>
			<td>Mbnl1 knock-out</td>
			<td>Rep 2</td>
			<td>Thymus</td>
			<td>Gekoppeld uiteinde</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM4116220</td>
			<td>SRR10261603</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_3</td>
			<td>Mbnl1 knock-out</td>
			<td>Rep 3</td>
			<td>Thymus</td>
			<td>Gekoppeld uiteinde</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM4116221</td>
			<td>SRR10261604</td>
			<td>WT_Thymus_1</td>
			<td>Wild type</td>
			<td>Rep 1</td>
			<td>Thymus</td>
			<td>Gekoppeld uiteinde</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM4116222</td>
			<td>SRR10261605</td>
			<td>WT_Thymus_2</td>
			<td>Wild type</td>
			<td>Rep 2</td>
			<td>Thymus</td>
			<td>Gekoppeld uiteinde</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM4116223</td>
			<td>SRR10261606</td>
			<td>WT_Thymus_3</td>
			<td>Wild type</td>
			<td>Rep 3</td>
			<td>Thymus</td>
			<td>Gekoppeld uiteinde</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td rowspan="8">3P-Seq</td>
			<td>GSM1480973</td>
			<td>SRR1553129</td>
			<td>WT_1</td>
			<td>Wild type (WT)</td>
			<td>Rep 1</td>
			<td>Embryonale fibroblasten bij muizen (MEF's)</td>
			<td>Single-end</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480974</td>
			<td>SRR1553130</td>
			<td>WT_2</td>
			<td>Wild type (WT)</td>
			<td>Rep 2</td>
			<td>Embryonale fibroblasten bij muizen (MEF's)</td>
			<td>Single-end</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480975</td>
			<td>SRR1553131</td>
			<td>DKO_1</td>
			<td>Mbnl 1/2 dubbele knock-out (DKO)</td>
			<td>Rep 1</td>
			<td>Embryonale fibroblasten bij muizen (MEF's)</td>
			<td>Single-end</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480976</td>
			<td>SRR1553132</td>
			<td>DKO_2</td>
			<td>Mbnl 1/2 dubbele knock-out (DKO)</td>
			<td>Rep 2</td>
			<td>Embryonale fibroblasten bij muizen (MEF's)</td>
			<td>Single-end</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480977</td>
			<td>SRR1553133</td>
			<td>DKOsiRNA_1</td>
			<td>Mbnl 1/2 dubbele knock-out met Mbnl 3 siRNA (KD)</td>
			<td>Rep 1</td>
			<td>Embryonale fibroblasten bij muizen (MEF's)</td>
			<td>Single-end</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480978</td>
			<td>SRR1553134</td>
			<td>DKOsiRNA_2</td>
			<td>Mbnl 1/2 dubbele knock-out met Mbnl 3 siRNA (KD)</td>
			<td>Rep 2</td>
			<td>Embryonale fibroblasten bij muizen (MEF's)</td>
			<td>Single-end</td>
			<td>36 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480979</td>
			<td>SRR1553135</td>
			<td>DKONTsiRNA_1</td>
			<td>Mbnl 1/2 dubbele knock-out met non-targeting siRNA (Ctrl)</td>
			<td>Rep 1</td>
			<td>Embryonale fibroblasten bij muizen (MEF's)</td>
			<td>Single-end</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480980</td>
			<td>SRR1553136</td>
			<td>DKONTsiRNA_2</td>
			<td>Mbnl 1/2 dubbele knock-out met non-targeting siRNA (Ctrl)</td>
			<td>Rep 2</td>
			<td>Embryonale fibroblasten bij muizen (MEF's)</td>
			<td>Single-end</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1. Samenvatting van RNA-Seq en PolyA-seq datasets die voor de analyse zijn gebruikt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Not relevent for computational study</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of alternative splicing and polyadenylation in rna-seq data

Naast de typische analyse van RNA-Seq om differentiële genexpressie (DGE) te meten over experimentele / biologische omstandigheden, kunnen RNA-seq-gegevens ook worden gebruikt om andere complexe regulerende mechanismen op exon-niveau te verkennen. Alternatieve splicing en polyadenylation spelen een cruciale rol in de functionele diversiteit van een gen door verschillende isovormen te genereren om genexpressie op post-transcriptioneel niveau te reguleren, en het beperken van analyses tot het hele genniveau kan deze belangrijke regulerende laag missen. Hier demonstreren we gedetailleerde stapsgewijze analyses voor identificatie en visualisatie van differentiële exon- en polyadenylation-sitegebruik onder omstandigheden, met behulp van Bioconductor en andere pakketten en functies, waaronder DEXSeq, diffSplice uit het Limma-pakket en rMATS.

Na het uitvoeren van de bovenstaande stapsgewijze workflow, worden de AS- en APA-analyse-uitvoer en representatieve resultaten in de vorm van tabellen en gegevensplots weergegeven, die als volgt worden gegenereerd.
ALS: De belangrijkste output van de AS-analyse (aanvullende tabel 1 voor diffSplice; Tabel 2 voor DEXSeq) is een lijst van exonen die differentieel gebruik tussen omstandigheden laten zien, en een lijst van genen die significante...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data at JoVE.com

Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data

Alternatieve splicing (AS) en alternatieve polyadenylation (APA) vergroten de diversiteit van transcriptisovormen en hun producten. Hier beschrijven we bioinformatische protocollen om bulk RNA-seq en 3'-eindsequencingtests te analyseren om AS en APA te detecteren en te visualiseren, variërend tussen experimentele omstandigheden.

Identificatie van alternatieve splicing en polyadenylation in RNA-seq-gegevens

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also ...

Dit protocol biedt een uitgebreid inzicht in genisovormen die worden gegenereerd door alternatieve splicing en polyadenylation door een stapsgewijze workflow te bieden om differentiële splicing-sites, differentieel tot expressie gebrachte exonen en poly (A) -sites te identificeren. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het zowel exon-gebaseerde als event-gebaseerde methoden evalueert voor het bestuderen van alternatieve splicing. Het past ook een exon-gebaseerde methode toe om alternatieve polyadenylering te bestuderen.De R Markdown-bestanden met de codes en opmerkingen voor AS- en AP-analyse zijn verstrekt. Het is raadzaam om de stappen in het R Markdown-bestand te volgen en de notitie voor elke stap zorgvuldig te bereiken. Als u differentiële splicing wilt identificeren met diffSplice van limma, volgt u het R-notebookbestand.Bereid de invoerbestanden voor zoals beschreven in het tekstmanuscript. Zorg ervoor dat de stappen één tot en met drie in het manuscript achtereenvolgens zijn gevolgd om invoerbestanden voor te bereiden voordat u verder gaat. Begin met het laden van de benodigde bibliotheken.Als u niet-specifieke filtering wilt uitvoeren, haalt u eerst de matrix van eerder verkregen leestellingen uit en maakt u een lijst met functies met de functie DGEList uit het edgeR-pakket, waarbij rijen genen vertegenwoordigen en kolommen monsters vertegenwoordigen. Transformeer vervolgens de gegevens van onbewerkte schaal naar tellingen per miljoen met behulp van de CPM-functie van het edgeR-pakket en bewaar exonen met tellingen groter dan een instelbare drempel. Deze dataset bevat zes voorbeelden.Daarom is de CPM ingesteld op meer dan één en ten minste drie van de zes monsters. Normaliseer de tellingen in monsters met de functie calcNormFactors uit het edgeR-pakket met behulp van bijgesneden gemiddelde van M-waarden. Deze functie berekent schaalfactoren om de bibliotheekgrootte aan te passen.Gebruik de eerder gegenereerde voorbeeldtabel om de ontwerpmatrix te maken om de experimentele omstandigheden voor elk monster te definiëren. Voer de voomfunctie van het limma-pakket uit om RNA-sequencinggegevens te verwerken om de variantie te schatten. Deze functie genereert precisiegewichten om te corrigeren voor Poisson-tellingsruis en transformeert de exon-niveautellingen naar log twee tellingen per miljoen of logCPM.Voer de lmfit-functie uit om lineaire modellen aan te passen aan de expressiegegevens voor elk exon. Voer vervolgens de functie eBayes uit om empirische statistieken te berekenen voor het aangepaste model om differentiële exonexpressie te detecteren. Definieer een contrastmatrix voor de experimentele vergelijkingen van belang.Gebruik de contrasten. fit-functie om coëfficiënten en standaardfouten voor elk paar vergelijkingen te verkrijgen. Voer diffSplice uit op het aangepaste model om de verschillen in exongebruik van genen tussen wild type en knock-out te testen.Verken de best gerangschikte resultaten met behulp van de topSplice-functie waarbij een test gelijk aan t een rangschikking van AS-exonen geeft en een test gelijk aan simes een rangorde van genen geeft. Voer de functie plotSplice uit om de resultaten te plotten. Door het gen van belang in het gen ID-argument te plaatsen, tonen de rode punten de differentieel tot expressie gebrachte exonen.Genereer een vulkaanplot met behulp van EnhancedVolcano bioconductor-pakket om de differentieel tot expressie gebrachte exonen tentoon te stellen. Als u rMATS wilt gebruiken, moet u ervoor zorgen dat de nieuwste versie van rMATS versie 4.1.1 is geïnstalleerd met conda of GitHub in de werkmap. Ga naar de map met bam-bestanden die zijn verkregen na toewijzing.Bereid tekstbestanden voor zoals vereist door rMATS voor de twee voorwaarden voor het kopiëren van de naam van bam-bestanden en hun pad gescheiden door een komma. Voer rma's uit. py met behulp van de twee gegenereerde invoer tekstbestanden die het pad van de bam-bestanden en de annotatie beschrijven.gtf-bestand dat eerder is verkregen. Dit genereert een uitvoermap rmats_out met tekstbestanden die statistieken beschrijven, waaronder P-waarden en inclusieniveaus voor elke splicinggebeurtenis afzonderlijk. Gebruik de bioconductorpakket maser om de rMATS-resultaten te verkennen.Laad de junction- en exon-tellingen tekstbestanden met de extensie JCEC in het maser-object en neem ten minste vijf gemiddelde reads per splicinggebeurtenis op om het resultaat te filteren op basis van dekking. Om de rMATS-resultaten te visualiseren, voert u eerst de topEvents-functie uit het maserpakket uit en selecteert u de significante splicinggebeurtenissen met een false discovery rate van 10% en een minimale verandering van 10% in procent gesplitst in of PSI. Controleer de gengebeurtenissen op individuele genen van belang en plot PSI-waarden voor elke splicinggebeurtenis van dat gen.Genereer een vulkaanplot door het gebeurtenistype op te geven. Gebruik de resultaten van splicinggebeurtenissen die zijn verkregen met rMATS in de vorm van tekstbestanden om sashimi-plots te genereren met behulp van het rmats2sashimiplot-pakket. De sashimi-plot toont een overgeslagen exongebeurtenis in het Wnk1-gen.Elke rij vertegenwoordigt een RNA-seq-monster, drie replica's van wild type en Mbnl1 knock-out. De hoogte toont de leesdekking in RPKM en de verbindingsbogen geven junction reads over exonen weer. Het onderste deel toont geannoteerde genmodel alternatieve isovormen.Een substantiële vouwverandering en sterk statistisch bewijs van echte verschillen kunnen worden waargenomen in de genen die zich bevinden in de kwadranten linksboven of rechts van de vulkaanplots verkregen met behulp van diffSplice en DEXSeq. Een cassette-exon bleek te variëren tussen verschillende omstandigheden voor het gen Wnk1. De differentiële exon-gebruiksplot toonde bewijs van differentiële splicing op vijf exon-locaties in de buurt van Wnk1.6.45, waarbij de exonen in roze werden gemarkeerd en waarschijnlijk werden uitgesplitst in Mbnl1 knock-outmonsters in vergelijking met wild type.De vulkaanplot van genen die als alternatief gesplitst zijn, hielp om onderscheid te maken tussen de genen die werden uitgesloten van het wilde type en die welke waren opgenomen in het wilde type. De soorten splicinggebeurtenissen SE, A5SS, A3SS, MXE en RI werden gevisualiseerd met behulp van sashimi-plots van de belangrijkste genen van die gebeurtenissen. De differentiële APA-activiteit in drie primaire onvertaalde gebieden van genen werd waargenomen met behulp van vulkaanplots.De significant differentiële pa-sitegebruiksresultaten verkregen uit verschillende pijplijnen werden gevisualiseerd met behulp van event plot. Een significante distale tot proximale verschuiving van pa-sitegebruik bij dubbele knock-outs kan worden waargenomen in zowel genen FOSL1 als papola. De gemiddelde dekking in flankerende gebieden verankerd op bekende PA-splitsingsplaatsen op genoombreed niveau werd bepaald met behulp van een diagnostische plot.Zorg ervoor dat de parameters zoals transspecifieke informatie en meervoudige overlap toestaan correct worden gebruikt bij het genereren van telstatistieken. Lineaire modelaanpassing en het genereren van contrastparen is belangrijk voor een goede vergelijking. Voor rMATS moet u ervoor zorgen dat alle parameters correct zijn ingesteld op basis van uw gegevens voordat u de opdracht uitvoert.De genen verkregen uit differentiële splicingactiviteit kunnen worden gebruikt om gensetverrijkingsanalyse uit te voeren. Een andere tool genaamd MISO kan worden gebruikt voor verdere op gebeurtenissen gebaseerde analyse.

Research

JoVE Journal

Biology

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

RNA-seq Analyse van transcriptomen in trombine-behandelde en Control Human Pulmonary microvasculaire endotheelcellen

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

Uitputting van ribosomaal RNA voor Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Alternatieve Cultures for Human pluripotente stamcellen zijn Productie, Onderhoud, en genetische analyses

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Detectie van alternatieve splicing Tijdens-mesenchymale transitie

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Een experimentele en Bioinformatica Protocol voor RNA-seq Analyses van Fotoperiodische diapause in de Aziatische tijgermug,<em&gt; Aedes albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Snelle identificatie van chemische Genetische Interacties in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Methods to Discover Alternative Promoter Usage and Transcriptional Regulation of Murine Bcrp1

Methoden om Ontdek Alternatieve Promoter Gebruik en transcriptionele regulatie van Murine Bcrp1

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually ...

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Identificatie van nieuwe regulatoren van plantaardige transpiratie door grootschalige thermische beeldvorming screening in Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq

Een bioinformaticapijplijn voor het onderzoeken van moleculaire evolutie en genexpressie met behulp van RNA-seq

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus ...