Name: identification of alternative splicing and polyadenylation in rna-seq data
Uploaded: 2021-06-24T13:00:00
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Cette étude a été financée par une bourse Future Fellowship (FT16010043) du Conseil australien de la recherche (ARC) et un programme ANU Futures.

1. Installation des outils et des packages R utilisés dans l’analyse
<ol><li>Conda est un gestionnaire de paquets populaire et flexible qui permet une installation pratique des paquets avec leurs dépendances sur toutes les plates-formes. Utilisez 'Anaconda' (gestionnaire de paquets conda) pour installer 'conda' qui peut être utilisé pour installer les outils/paquets requis pour l’analyse.</li>
	<li>Téléchargez 'Anaconda' selon la configuration système requise de https://www.anaconda.com/produc...

<ol>
	<li>Katz, Y., Wang, E. T., Airoldi, E. M., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+design+of+RNA+sequencing+experiments+for+identifying+isoform+regulation.">Analysis and design of RNA sequencing experiments for identifying isoform regulation.</a> Nature Methods. 7 (12), 1009-1015 (2010).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+alternative+splicing+and+its+regulation.">Mechanism of alternative splicing and its regulation.</a> Biomedical Reports. 3 (2), 152-158 (2015).</li><li>Mehmood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+differential+splicing+tools+for+RNA-seq+studies.">Systematic evaluation of differential splicing tools for RNA-seq studies.</a> Briefings in Bioinformatics. 21 (6), 2052-2065 (2020).</li><li>Movassat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+between+alternative+polyadenylation+and+alternative+splicing+is+limited+to+terminal+introns.">Coupling between alternative polyadenylation and alternative splicing is limited to terminal introns.</a> RNA Biology. 13 (7), 646-655 (2016).</li><li>Tian, B., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+polyadenylation+of+mRNA+precursors.">Alternative polyadenylation of mRNA precursors.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (1), 18-30 (2017).</li><li>Herrmann, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PolyASite+2.0:+a+consolidated+atlas+of+polyadenylation+sites+from+3'+end+sequencing.">PolyASite 2.0: a consolidated atlas of polyadenylation sites from 3' end sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 48 (1), 174-179 (2020).</li><li>Liu, R., Loraine, A. E., Dickerson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparisons+of+computational+methods+for+differential+alternative+splicing+detection+using+RNA-seq+in+plant+systems.">Comparisons of computational methods for differential alternative splicing detection using RNA-seq in plant systems.</a> BMC Bioinformatics. 15 (1), 364 (2014).</li><li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis.">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biology. 17 (1), 13 (2016).</li><li>Anders, S., Reyes, A., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+differential+usage+of+exons+from+RNA-seq+data.">Detecting differential usage of exons from RNA-seq data.</a> Genome Research. 22 (10), 2008-2017 (2012).</li><li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies.">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), 47 (2014).</li><li>Shen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rMATS:+Robust+and+flexible+detection+of+differential+alternative+splicing+from+replicate+RNA-Seq+data.">rMATS: Robust and flexible detection of differential alternative splicing from replicate RNA-Seq data.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (51), 5593-5601 (2014).</li><li>Mehmood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+differential+splicing+tools+for+RNA-seq+studies.">Systematic evaluation of differential splicing tools for RNA-seq studies.</a> Briefings in bioinformatics. 21 (6), 2052-2065 (2020).</li><li>Kanitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+assessment+of+methods+for+the+computational+inference+of+transcript+isoform+abundance+from+RNA-seq+data.">Comparative assessment of methods for the computational inference of transcript isoform abundance from RNA-seq data.</a> Genome biology. 16 (1), 1-26 (2015).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Sznajder, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+MBNL1+induces+RNA+misprocessing+in+the+thymus+and+peripheral+blood.">Loss of MBNL1 induces RNA misprocessing in the thymus and peripheral blood.</a> Nature Communications. 11, 1-11 (2020).</li><li>Batra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+MBNL+leads+to+disruption+of+developmentally+regulated+alternative+polyadenylation+in+RNA-mediated+disease.">Loss of MBNL leads to disruption of developmentally regulated alternative polyadenylation in RNA-mediated disease.</a> Molecular Cell. 56 (2), 311-322 (2014).</li><li>Leinonen, R., Sugawara, H., Shumway, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sequence+read+archive.">The sequence read archive.</a> Nucleic acids research. 39, 19-21 (2010).</li><li>Tange, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> GNU parallel-the command-line power tool. 36, 42-47 (2011).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAR:+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner.">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li><li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=edgeR:+a+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data.">edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).</li><li>Robinson, M. D., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scaling+normalization+method+for+differential+expression+analysis+of+RNA-seq+data.">A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data.</a> Genome Biology. 11 (3), 25 (2010).</li><li>Veiga, D. F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=maser:+Mapping+Alternative+Splicing+Events+to+pRoteins.">maser: Mapping Alternative Splicing Events to pRoteins.</a> R package version 1.4.0. , (2019).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10 (13), 25 (2009).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Ram&#237;rez, F., D&#252;ndar, F., Diehl, S., Gr&#252;ning, B. A., Manke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=deepTools:+a+flexible+platform+for+exploring+deep-sequencing+data.">deepTools: a flexible platform for exploring deep-sequencing data.</a> Nucleic acids research. 42 (1), 187-191 (2014).</li><li>Merino, G. A., Conesa, A., Fern&#225;ndez, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+benchmarking+of+workflows+for+detecting+differential+splicing+and+differential+expression+at+isoform+level+in+human+RNA-seq+studies.">A benchmarking of workflows for detecting differential splicing and differential expression at isoform level in human RNA-seq studies.</a> Briefings in bioinformatics. 20 (2), 471-481 (2019).</li><li>Chhangawala, S., Rudy, G., Mason, C. E., Rosenfeld, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+read+length+on+quantification+of+differentially+expressed+genes+and+splice+junction+detection.">The impact of read length on quantification of differentially expressed genes and splice junction detection.</a> Genome biology. 16 (1), 1-10 (2015).</li><li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis.">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biol. 17, 13 (2016).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks.">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat Protoc. 7 (3), 562-578 (2012).</li><li>Li, B., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RSEM:+accurate+transcript+quantification+from+RNA-Seq+data+with+or+without+a+reference+genome.">RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome.</a> BMC Bioinformatics. 12, 323 (2011).</li><li>Bray, N. L., Pimentel, H., Melsted, P., Pachter, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-optimal+probabilistic+RNA-seq+quantification.">Near-optimal probabilistic RNA-seq quantification.</a> Nat Biotechnol. 34 (5), 525-527 (2016).</li></ol>

Dans cette étude, nous avons évalué des approches basées sur les exons et les événements pour détecter l’AS et l’APA dans les données de séquençage massif de l’ARN-Seq et de l’extrémité 3'. Les approches AS basées sur les exons produisent à la fois une liste d’exons exprimés différentiellement et un classement au niveau du gène ordonné en fonction de la signification statistique de l’activité globale d’épissage différentiel au niveau du gène (tableaux 1-2, 4-5). Pour l...

Le séquençage de l’ARN a été largement utilisé au fil des ans, généralement pour estimer l’expression différentielle des gènes et la découverte de gènes1. En outre, il peut également être utilisé pour estimer l’utilisation variable du niveau d’exon en raison de l’expression de gènes différentes isoformes, contribuant ainsi à une meilleure compréhension de la régulation des gènes au niveau post-transcriptionnel. La majorité des gènes eucaryotes génèrent différentes isoformes par épissage alternatif (AS) pour augmenter la diversité de l’expression de l’ARNm. Les événements AS peuvent être divisés en différents modèles: saut d’exons complets (SE) où un exon (« cassette ») est complètement retiré de la transcription avec ses introns flanquants; sélection alternative (donneur) du site d’épissage 5' (A5SS) et alternative 3' (accepteur) sélection du site d’épissage (A3SS) lorsque deux sites d’épissage ou plus sont présents à chaque extrémité d’un exon; rétention d’introns (RI) lorsqu’un intron est retenu dans le transcrit d’ARNm mature et exclusion mutuelle de l’utilisation d’exons (MXE) où un seul des deux exons disponibles peut être retenu à la fois 2,3. La polyadénylation alternative (APA) joue également un rôle important dans la régulation de l’expression génique en utilisant des sites poly (A) alternatifs pour générer plusieurs isoformes d’ARNm à partir d’un seul transcrit4. La plupart des sites de polyadénylation (pA) sont situés dans la région 3' non traduite (3' UTR), générant des isoformes d’ARNm avec diverses longueurs 3' UTR. Comme l’UTR 3' est le centre central pour la reconnaissance des éléments régulateurs, différentes longueurs 3' UTR peuvent affecter la localisation, la stabilité et la traduction de l’ARNm5. Il existe une classe de tests de séquençage d’extrémité 3' optimisés pour détecter l’APA qui diffèrent dans les détails du protocole6. Le pipeline décrit ici est conçu pour PolyA-seq, mais peut être adapté à d’autres protocoles comme décrit.
Dans cette étude, nous présentons un pipeline de méthodes d’analyse différentielledes exons 7,8 (Figure 1), qui peuvent être divisées en deux grandes catégories : basées sur les exons (DEXSeq9, diffSplice10) et basées sur les événements (analyse multivariée répliquée de l’épissage des transcriptions (rMATS)11). Les méthodes basées sur les exons comparent le changement de pli entre les conditions des exons individuels, à une mesure du changement global du pli des gènes pour appeler l’utilisation d’exons exprimée différentiellement, et à partir de là, calculez une mesure au niveau du gène de l’activité SA. Les méthodes basées sur les événements utilisent des lectures de jonction couvrant exon-intron pour détecter et classer des événements d’épissage spécifiques tels que le saut d’exon ou la rétention d’introns, et distinguer ces types AS dans la sortie3. Ainsi, ces méthodes fournissent des points de vue complémentaires pour une analyse complète de la SA12,13. Nous avons sélectionné DEXSeq (basé sur le package DESeq214 DGE) et diffSplice (basé sur le package Limma10 DGE) pour l’étude car ils sont parmi les packages les plus largement utilisés pour l’analyse d’épissage différentiel. rMATS a été choisi comme méthode populaire pour l’analyse basée sur les événements. Une autre méthode populaire basée sur les événements est MISO (Mixture of Isoforms)1. Pour l’APA, nous adaptons l’approche basée sur les exons.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62636/62636fig01.jpg"> Graphique 1. Pipeline d’analyse. Organigramme des étapes utilisées dans l’analyse. Les étapes comprennent : l’obtention des données, l’exécution de contrôles de qualité et d’alignement des lectures, suivis du comptage des lectures à l’aide d’annotations pour les exons, les introns et les sites pA connus, le filtrage pour supprimer les faibles nombres et la normalisation. Les données PolyA-seq ont été analysées pour d’autres sites pA à l’aide des méthodes diffSplice/DEXSeq, le RNA-Seq en vrac a été analysé pour l’épissage alternatif au niveau de l’exon avec les méthodes diffSplice/DEXseq et les événements AS analysés avec rMATS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62636/62636fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Les données RNA-seq utilisées dans cette enquête ont été acquises à partir de Gene Expression Omnibus (GEO) (GSE138691)15. Nous avons utilisé les données de séquençage de l’ARN de souris de cette étude avec deux groupes de conditions : le type sauvage (WT) et le knockout de type 1 de type Muscleblind (Mbnl1 KO) avec trois réplications chacun. Pour démontrer l’analyse différentielle de l’utilisation du site de polyadénylation, nous avons obtenu des données PolyA-seq sur des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) (GEO Accession GSE60487)16. Les données comportent quatre groupes de conditions : Wild-type (WT), Muscleblind-like type1/type 2 double knockout (Mbnl1/2 DKO), Mbnl 1/2 DKO avec Mbnl3 knockdown (KD) et Mbnl1/2 DKO avec contrôle Mbnl3 (Ctrl). Chaque groupe de conditions se compose de deux répétitions.
<table border="1" fo:font-size="5px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Adhésion GEO</td>
			<td>Numéro d’exécution SRA</td>
			<td>Nom de l’échantillon</td>
			<td>Condition</td>
			<td>Répliquer</td>
			<td>Tissu</td>
			<td>Séquençage</td>
			<td>Longueur de lecture</td>
		</tr><tr><td rowspan="6">RNA-Seq</td>
			<td>GSM4116218</td>
			<td>SRR10261601</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_1</td>
			<td>Mbnl1 knockout</td>
			<td>Rép. 1</td>
			<td>Thymus</td>
			<td>Extrémité jumelée</td>
			<td>100 pb</td>
		</tr><tr><td>GSM4116219</td>
			<td>SRR10261602</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_2</td>
			<td>Mbnl1 knockout</td>
			<td>Rép. 2</td>
			<td>Thymus</td>
			<td>Extrémité jumelée</td>
			<td>100 pb</td>
		</tr><tr><td>GSM4116220</td>
			<td>SRR10261603</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_3</td>
			<td>Mbnl1 knockout</td>
			<td>Rép. 3</td>
			<td>Thymus</td>
			<td>Extrémité jumelée</td>
			<td>100 pb</td>
		</tr><tr><td>GSM4116221</td>
			<td>SRR10261604</td>
			<td>WT_Thymus_1</td>
			<td>Type sauvage</td>
			<td>Rép. 1</td>
			<td>Thymus</td>
			<td>Extrémité jumelée</td>
			<td>100 pb</td>
		</tr><tr><td>GSM4116222</td>
			<td>SRR10261605</td>
			<td>WT_Thymus_2</td>
			<td>Type sauvage</td>
			<td>Rép. 2</td>
			<td>Thymus</td>
			<td>Extrémité jumelée</td>
			<td>100 pb</td>
		</tr><tr><td>GSM4116223</td>
			<td>SRR10261606</td>
			<td>WT_Thymus_3</td>
			<td>Type sauvage</td>
			<td>Rép. 3</td>
			<td>Thymus</td>
			<td>Extrémité jumelée</td>
			<td>100 pb</td>
		</tr><tr><td rowspan="8">3P-Seq</td>
			<td>GSM1480973</td>
			<td>SRR1553129</td>
			<td>WT_1</td>
			<td>Type sauvage (WT)</td>
			<td>Rép. 1</td>
			<td>Fibroblastes embryonnaires de souris (MEF)</td>
			<td>Extrémité unique</td>
			<td>40 pb</td>
		</tr><tr><td>GSM1480974</td>
			<td>SRR1553130</td>
			<td>WT_2</td>
			<td>Type sauvage (WT)</td>
			<td>Rép. 2</td>
			<td>Fibroblastes embryonnaires de souris (MEF)</td>
			<td>Extrémité unique</td>
			<td>40 pb</td>
		</tr><tr><td>GSM1480975</td>
			<td>SRR1553131</td>
			<td>DKO_1</td>
			<td>Mbnl 1/2 double knockout (DKO)</td>
			<td>Rép. 1</td>
			<td>Fibroblastes embryonnaires de souris (MEF)</td>
			<td>Extrémité unique</td>
			<td>40 pb</td>
		</tr><tr><td>GSM1480976</td>
			<td>SRR1553132</td>
			<td>DKO_2</td>
			<td>Mbnl 1/2 double knockout (DKO)</td>
			<td>Rép. 2</td>
			<td>Fibroblastes embryonnaires de souris (MEF)</td>
			<td>Extrémité unique</td>
			<td>40 pb</td>
		</tr><tr><td>GSM1480977</td>
			<td>SRR1553133</td>
			<td>DKOsiRNA_1</td>
			<td>Mbnl 1/2 double knockout avec Mbnl 3 siRNA (KD)</td>
			<td>Rép. 1</td>
			<td>Fibroblastes embryonnaires de souris (MEF)</td>
			<td>Extrémité unique</td>
			<td>40 pb</td>
		</tr><tr><td>GSM1480978</td>
			<td>SRR1553134</td>
			<td>DKOsiRNA_2</td>
			<td>Mbnl 1/2 double knockout avec Mbnl 3 siRNA (KD)</td>
			<td>Rép. 2</td>
			<td>Fibroblastes embryonnaires de souris (MEF)</td>
			<td>Extrémité unique</td>
			<td>36 pb</td>
		</tr><tr><td>GSM1480979</td>
			<td>SRR1553135</td>
			<td>DKONTsiRNA_1</td>
			<td>Mbnl 1/2 double knockout avec siRNA non ciblé (Ctrl)</td>
			<td>Rép. 1</td>
			<td>Fibroblastes embryonnaires de souris (MEF)</td>
			<td>Extrémité unique</td>
			<td>40 pb</td>
		</tr><tr><td>GSM1480980</td>
			<td>SRR1553136</td>
			<td>DKONTsiRNA_2</td>
			<td>Mbnl 1/2 double knockout avec siRNA non ciblé (Ctrl)</td>
			<td>Rép. 2</td>
			<td>Fibroblastes embryonnaires de souris (MEF)</td>
			<td>Extrémité unique</td>
			<td>40 pb</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1. Résumé des ensembles de données RNA-Seq et PolyA-seq utilisés pour l’analyse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Not relevent for computational study</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of alternative splicing and polyadenylation in rna-seq data

En plus de l’analyse typique du RNA-Seq pour mesurer l’expression génique différentielle (DGE) dans des conditions expérimentales / biologiques, les données RNA-seq peuvent également être utilisées pour explorer d’autres mécanismes de régulation complexes au niveau de l’exon. L’épissage alternatif et la polyadénylation jouent un rôle crucial dans la diversité fonctionnelle d’un gène en générant différentes isoformes pour réguler l’expression génique au niveau post-transcriptionnel, et limiter les analyses à l’ensemble du niveau du gène peut manquer cette couche régulatrice importante. Ici, nous démontrons des analyses détaillées étape par étape pour l’identification et la visualisation de l’utilisation différentielle des exons et des sites de polyadénylation dans toutes les conditions, en utilisant Bioconductor et d’autres packages et fonctions, y compris DEXSeq, diffSplice du package Limma et rMATS.

Après avoir exécuté le flux de travail étape par étape ci-dessus, les résultats d’analyse AS et APA et les résultats représentatifs se présentent sous la forme de tableaux et de diagrammes de données, générés comme suit.
COMME: Le principal résultat de l’analyse AS (tableau supplémentaire 1 pour diffSplice; Le tableau 2 pour DEXSeq) est une liste d’exons montrant une utilisation différentielle selon les conditions, et ...

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Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data

L’épissage alternatif (AS) et la polyadénylation alternative (APA) élargissent la diversité des isoformes de transcrits et de leurs produits. Ici, nous décrivons des protocoles bioinformatiques pour analyser les tests de séquençage d’ARN en vrac et de séquençage à 3' pour détecter et visualiser l’AS et l’APA variant selon les conditions expérimentales.

Identification d’un épissage alternatif et d’une polyadénylation dans les données de séquençage de l’ARN

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also ...

Ce protocole fournit une compréhension complète des isoformes géniques générées par l’épissage alternatif et la polyadénylation en fournissant un flux de travail étape par étape pour identifier les sites d’épissage différentiel, les exons exprimés différemment et les sites poly(A). Le principal avantage de ce protocole est qu’il évalue à la fois les méthodes basées sur les exons et les méthodes basées sur les événements pour étudier l’épissage alternatif. Il applique également une méthode à base d’exons pour étudier la polyadénylation alternative.Les fichiers R Markdown qui incluent les codes et les notes pour l’analyse AS et AP ont été fournis. Il serait conseillé de suivre les étapes du fichier R Markdown et d’atteindre attentivement la note pour chaque étape. Pour identifier l’épissage différentiel à l’aide de diffSplice from limma, suivez le fichier R notebook.Préparez les fichiers d’entrée comme décrit dans le manuscrit texte. Assurez-vous que les étapes un à trois du manuscrit ont été suivies séquentiellement pour préparer les fichiers d’entrée avant de continuer. Commencez par charger les bibliothèques nécessaires.Pour effectuer un filtrage non spécifique, extrayez d’abord la matrice des comptes de lecture obtenus précédemment et créez une liste d’entités à l’aide de la fonction DGEList à partir du package edgeR, où les lignes représentent les gènes et les colonnes représentent les échantillons. Ensuite, transformez les données de l’échelle brute en nombre par million à l’aide de la fonction CPM du package edgeR et conservez les exons dont le nombre est supérieur à un seuil définissable. Cet ensemble de données contient six échantillons.Par conséquent, la MPC est fixée à plus d’un échantillon et au moins trois échantillons sur six. Normalisez les comptages entre les échantillons à l’aide de la fonction calcNormFactors du package edgeR à l’aide de la moyenne tronquée des valeurs M. Cette fonction calcule les facteurs d’échelle pour ajuster la taille des bibliothèques.Utilisez la table d’exemples générée précédemment pour créer la matrice de plan afin de définir les conditions expérimentales pour chaque échantillon. Exécutez la fonction voom du package limma pour traiter les données de séquençage de l’ARN afin d’estimer la variance. Cette fonction générera des poids de précision pour corriger le bruit de comptage de Poisson et transformer le nombre de niveaux d’exons en nombre de deux comptes par million ou logCPM.Exécutez la fonction lmfit pour ajuster les modèles linéaires aux données d’expression de chaque exon. Exécutez ensuite la fonction eBayes pour calculer des statistiques empiriques pour le modèle ajusté afin de détecter l’expression différentielle des exons. Définir une matrice de contraste pour les comparaisons expérimentales d’intérêt.Utilisez les contrastes. Fonction d’ajustement pour obtenir des coefficients et des erreurs-types pour chaque paire de comparaisons. Exécutez diffSplice sur le modèle ajusté pour tester les différences dans l’utilisation des gènes par exon entre le type sauvage et le knockout.Explorez les résultats les mieux classés à l’aide de la fonction topSplice où un test égal à t donne un classement des exons AS et un test égal à simes donne un classement des gènes. Exécutez la fonction plotSplice pour tracer les résultats. En mettant le gène d’intérêt dans l’argument de l’identification du gène, les points rouges montrent les exons exprimés différemment.Générez un tracé de volcan à l’aide du package bioconducteur EnhancedVolcano pour afficher les exons exprimés différentiellement. Pour utiliser rMATS, assurez-vous que la dernière version de rMATS version 4.1.1 est installée à l’aide de conda ou GitHub dans le répertoire de travail. Accédez au dossier contenant les fichiers bam obtenus après mappage.Préparez les fichiers texte requis par rMATS pour les deux conditions de copie du nom des fichiers bam et de leur chemin séparés par une virgule. Exécutez rmas. PY à l’aide des deux fichiers texte d’entrée générés décrivant le chemin des fichiers BAM et l’annotation.GTF obtenu précédemment. Cela génère un dossier de sortie contenant rmats_out fichiers texte décrivant les statistiques, y compris les valeurs P et les niveaux d’inclusion pour chaque événement d’épissage séparément. Utilisez le maser du boîtier bioconducteur pour explorer les résultats rMATS.Chargez les fichiers texte de jonction et de comptage d’exons avec l’extension JCEC dans l’objet maser et incluez au moins cinq lectures moyennes par événement d’épissage pour filtrer le résultat en fonction de la couverture. Pour visualiser les résultats rMATS, exécutez d’abord la fonction topEvents à partir du package maser, en sélectionnant les événements d’épissage significatifs à un taux de fausse découverte de 10 % et une variation minimale de 10 % du pourcentage d’épissage dans ou PSI. Vérifiez les événements génétiques pour les gènes individuels d’intérêt et tracez les valeurs PSI pour chaque événement d’épissage de ce gène.Générez un tracé de volcan en spécifiant le type d’événement. Utilisez les résultats des événements d’épissage obtenus avec rMATS sous forme de fichiers texte pour générer des tracés sashimi à l’aide du package rmats2sashimiplot. Le diagramme de sashimi montre un événement d’exon sauté dans le gène Wnk1.Chaque rangée représente un échantillon de séquençage d’ARN, trois répétitions de type sauvage et un knockout Mbnl1. La hauteur montre la couverture de lecture en RPKM et les arcs de connexion représentent les lectures de jonction à travers les exons. La partie inférieure montre des isoformes alternatives annotées du modèle de gènes.Un changement de pli substantiel et de fortes preuves statistiques de différences réelles peuvent être observés dans les gènes situés dans les quadrants supérieurs gauche ou droit des parcelles volcaniques obtenues en utilisant diffSplice et DEXSeq. Un exon de cassette variait entre différentes conditions pour le gène Wnk1. Le graphique d’utilisation différentielle des exons a montré des signes d’épissage différentiel sur cinq sites d’exons près de Wnk1.6.45, les exons surlignés en rose étant susceptibles d’être épissés dans les échantillons knockout Mbnl1 par rapport au type sauvage.Le tracé volcanique des gènes qui sont alternativement épissés a aidé à distinguer les gènes qui ont été exclus du type sauvage et ceux qui ont été inclus dans le type sauvage. Les types d’épissage SE, A5SS, A3SS, MXE et RI ont été visualisés à l’aide de diagrammes de sashimi des gènes les plus significatifs de ces événements. L’activité différentielle de l’APA dans trois régions principales non traduites de gènes a été observée à l’aide de diagrammes volcaniques.Les résultats d’utilisation du site PA significativement différentiels acquis à partir de différents pipelines ont été visualisés à l’aide d’un diagramme d’événements. Un déplacement distal à proximal significatif de l’utilisation du site PA dans les doubles knockouts peut être observé dans les deux gènes FOSL1 et Papola. La couverture moyenne dans les régions flanquantes ancrées à des sites de clivage PA connus à l’échelle du génome a été déterminée à l’aide d’un diagramme diagnostique.Assurez-vous que les paramètres tels que les informations transspécifiques et l’autorisation du chevauchement multiple sont correctement utilisés lors de la génération de mesures de comptage. L’ajustement du modèle linéaire et la génération de paires de contraste sont importants pour une comparaison correcte. Pour rMATS, assurez-vous que tous les paramètres sont correctement définis en fonction de vos données avant d’exécuter la commande.Les gènes obtenus à partir de l’activité d’épissage différentiel pourraient être utilisés pour effectuer une analyse d’enrichissement de l’ensemble de gènes. Un autre outil appelé MISO pourrait être utilisé pour une analyse plus approfondie basée sur les événements.

Research

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