Name: identification of alternative splicing and polyadenylation in rna-seq data
Uploaded: 2021-06-24T13:00:00
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Diese Studie wurde von einem Australian Research Council (ARC) Future Fellowship (FT16010043) und ANU Futures Scheme unterstützt.

1. Installation von Tools und R-Paketen, die in der Analyse verwendet werden
<ol><li>Conda ist ein beliebter und flexibler Paketmanager, der eine komfortable Installation von Paketen mit ihren Abhängigkeiten über alle Plattformen hinweg ermöglicht. Verwenden Sie 'Anaconda' (conda-Paketmanager), um 'conda' zu installieren, mit dem die für die Analyse erforderlichen Tools/Pakete installiert werden können.</li>
	<li>Laden Sie 'Anaconda' gemäß den Systemanforderungen von https://www.anaconda.com/produ...

<ol>
	<li>Katz, Y., Wang, E. T., Airoldi, E. M., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+design+of+RNA+sequencing+experiments+for+identifying+isoform+regulation.">Analysis and design of RNA sequencing experiments for identifying isoform regulation.</a> Nature Methods. 7 (12), 1009-1015 (2010).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+alternative+splicing+and+its+regulation.">Mechanism of alternative splicing and its regulation.</a> Biomedical Reports. 3 (2), 152-158 (2015).</li><li>Mehmood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+differential+splicing+tools+for+RNA-seq+studies.">Systematic evaluation of differential splicing tools for RNA-seq studies.</a> Briefings in Bioinformatics. 21 (6), 2052-2065 (2020).</li><li>Movassat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+between+alternative+polyadenylation+and+alternative+splicing+is+limited+to+terminal+introns.">Coupling between alternative polyadenylation and alternative splicing is limited to terminal introns.</a> RNA Biology. 13 (7), 646-655 (2016).</li><li>Tian, B., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+polyadenylation+of+mRNA+precursors.">Alternative polyadenylation of mRNA precursors.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (1), 18-30 (2017).</li><li>Herrmann, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PolyASite+2.0:+a+consolidated+atlas+of+polyadenylation+sites+from+3'+end+sequencing.">PolyASite 2.0: a consolidated atlas of polyadenylation sites from 3' end sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 48 (1), 174-179 (2020).</li><li>Liu, R., Loraine, A. E., Dickerson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparisons+of+computational+methods+for+differential+alternative+splicing+detection+using+RNA-seq+in+plant+systems.">Comparisons of computational methods for differential alternative splicing detection using RNA-seq in plant systems.</a> BMC Bioinformatics. 15 (1), 364 (2014).</li><li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis.">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biology. 17 (1), 13 (2016).</li><li>Anders, S., Reyes, A., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+differential+usage+of+exons+from+RNA-seq+data.">Detecting differential usage of exons from RNA-seq data.</a> Genome Research. 22 (10), 2008-2017 (2012).</li><li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies.">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), 47 (2014).</li><li>Shen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rMATS:+Robust+and+flexible+detection+of+differential+alternative+splicing+from+replicate+RNA-Seq+data.">rMATS: Robust and flexible detection of differential alternative splicing from replicate RNA-Seq data.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (51), 5593-5601 (2014).</li><li>Mehmood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+differential+splicing+tools+for+RNA-seq+studies.">Systematic evaluation of differential splicing tools for RNA-seq studies.</a> Briefings in bioinformatics. 21 (6), 2052-2065 (2020).</li><li>Kanitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+assessment+of+methods+for+the+computational+inference+of+transcript+isoform+abundance+from+RNA-seq+data.">Comparative assessment of methods for the computational inference of transcript isoform abundance from RNA-seq data.</a> Genome biology. 16 (1), 1-26 (2015).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Sznajder, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+MBNL1+induces+RNA+misprocessing+in+the+thymus+and+peripheral+blood.">Loss of MBNL1 induces RNA misprocessing in the thymus and peripheral blood.</a> Nature Communications. 11, 1-11 (2020).</li><li>Batra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+MBNL+leads+to+disruption+of+developmentally+regulated+alternative+polyadenylation+in+RNA-mediated+disease.">Loss of MBNL leads to disruption of developmentally regulated alternative polyadenylation in RNA-mediated disease.</a> Molecular Cell. 56 (2), 311-322 (2014).</li><li>Leinonen, R., Sugawara, H., Shumway, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sequence+read+archive.">The sequence read archive.</a> Nucleic acids research. 39, 19-21 (2010).</li><li>Tange, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> GNU parallel-the command-line power tool. 36, 42-47 (2011).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAR:+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner.">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li><li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=edgeR:+a+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data.">edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).</li><li>Robinson, M. D., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scaling+normalization+method+for+differential+expression+analysis+of+RNA-seq+data.">A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data.</a> Genome Biology. 11 (3), 25 (2010).</li><li>Veiga, D. F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=maser:+Mapping+Alternative+Splicing+Events+to+pRoteins.">maser: Mapping Alternative Splicing Events to pRoteins.</a> R package version 1.4.0. , (2019).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10 (13), 25 (2009).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Ram&#237;rez, F., D&#252;ndar, F., Diehl, S., Gr&#252;ning, B. A., Manke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=deepTools:+a+flexible+platform+for+exploring+deep-sequencing+data.">deepTools: a flexible platform for exploring deep-sequencing data.</a> Nucleic acids research. 42 (1), 187-191 (2014).</li><li>Merino, G. A., Conesa, A., Fern&#225;ndez, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+benchmarking+of+workflows+for+detecting+differential+splicing+and+differential+expression+at+isoform+level+in+human+RNA-seq+studies.">A benchmarking of workflows for detecting differential splicing and differential expression at isoform level in human RNA-seq studies.</a> Briefings in bioinformatics. 20 (2), 471-481 (2019).</li><li>Chhangawala, S., Rudy, G., Mason, C. E., Rosenfeld, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+read+length+on+quantification+of+differentially+expressed+genes+and+splice+junction+detection.">The impact of read length on quantification of differentially expressed genes and splice junction detection.</a> Genome biology. 16 (1), 1-10 (2015).</li><li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis.">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biol. 17, 13 (2016).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks.">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat Protoc. 7 (3), 562-578 (2012).</li><li>Li, B., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RSEM:+accurate+transcript+quantification+from+RNA-Seq+data+with+or+without+a+reference+genome.">RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome.</a> BMC Bioinformatics. 12, 323 (2011).</li><li>Bray, N. L., Pimentel, H., Melsted, P., Pachter, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-optimal+probabilistic+RNA-seq+quantification.">Near-optimal probabilistic RNA-seq quantification.</a> Nat Biotechnol. 34 (5), 525-527 (2016).</li></ol>

In dieser Studie evaluierten wir Exon-basierte und ereignisbasierte Ansätze zum Nachweis von AS und APA in Bulk-RNA-Seq- und 3'-Endsequenzierungsdaten. Die Exon-basierten AS-Ansätze erzeugen sowohl eine Liste differentiell exprimierter Exons als auch ein Ranking auf Genebene, geordnet nach der statistischen Signifikanz der gesamten differentiellen Spleißaktivität auf Genebene (Tabellen 1-2, 4-5). Für das diffSplice-Paket wird die differentielle Nutzung bestimmt, indem gewichtete lineare Modelle auf ...

RNA-seq wurde im Laufe der Jahre häufig verwendet, typischerweise zur Schätzung der differentiellen Genexpression und Genentdeckung1. Darüber hinaus kann es auch verwendet werden, um die unterschiedliche Nutzung auf Exon-Ebene aufgrund der Genexprimierung verschiedener Isoformen abzuschätzen, was zu einem besseren Verständnis der Genregulation auf posttranskriptioneller Ebene beiträgt. Die Mehrheit der eukaryotischen Gene erzeugt verschiedene Isoformen durch alternatives Spleißen (AS), um die Vielfalt der mRNA-Expression zu erhöhen. AS-Ereignisse können in verschiedene Muster unterteilt werden: Überspringen vollständiger Exons (SE), bei denen ein ("Kassetten") Exon zusammen mit seinen flankierenden Introns vollständig aus dem Transkript entfernt wird; alternative (Donor) 5'-Spleißstellenauswahl (A5SS) und alternative 3' (Akzeptor) Spleißstellenauswahl (A3SS), wenn zwei oder mehr Spleißstellen an beiden Enden eines Exons vorhanden sind; Beibehaltung von Introns (RI), wenn ein Intron innerhalb des reifen mRNA-Transkripts beibehalten wird, und gegenseitiger Ausschluss der Exon-Nutzung (MXE), wobei nur eines der beiden verfügbaren Exons gleichzeitig beibehalten werden kann 2,3. Die alternative Polyadenylierung (APA) spielt auch eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Genexpression unter Verwendung alternativer Poly(A)-Stellen, um mehrere mRNA-Isoformen aus einem einzigen Transkriptzu erzeugen 4. Die meisten Polyadenylierungsstellen (pAs) befinden sich in der 3' untranslatierten Region (3' UTRs) und erzeugen mRNA-Isoformen mit unterschiedlichen 3' UTR-Längen. Da die 3' UTR die zentrale Drehscheibe für die Erkennung regulatorischer Elemente ist, können unterschiedliche 3' UTR-Längen die mRNA-Lokalisierung, Stabilität und Translation beeinflussen5. Es gibt eine Klasse von 3'-Endsequenzierungsassays, die für den Nachweis von APA optimiert sind und sich in den Details des Protokolls6 unterscheiden. Die hier beschriebene Pipeline ist für PolyA-seq ausgelegt, kann aber wie beschrieben für andere Protokolle angepasst werden.
In dieser Studie stellen wir eine Pipeline von differentiellen Exon-Analysemethoden7,8 (Abbildung 1) vor, die in zwei große Kategorien unterteilt werden können: exon-basiert (DEXSeq9, diffSplice 10) und ereignisbasiert (replicate Multivariate Analysis of Transcript Splicing (rMATS)11). Die Exon-basierten Methoden vergleichen die Faltenänderung über die Bedingungen einzelner Exons hinweg mit einem Maß für die gesamte Genfaltenänderung, um differentiell exprimierte Exon-Nutzung zu nennen, und berechnen daraus ein Maß für die AS-Aktivität auf Genebene. Ereignisbasierte Methoden verwenden Exon-Intron-Spanning-Junction-Lesevorgänge, um bestimmte Spleißereignisse wie Exon-Skipping oder Beibehaltung von Introns zu erkennen und zu klassifizieren und diese AS-Typen in Ausgabe3 zu unterscheiden. Somit bieten diese Methoden komplementäre Sichtweisen für eine vollständige Analyse von AS12,13. Wir haben DEXSeq (basierend auf dem DESeq214 DGE-Paket) und diffSplice (basierend auf dem Limma10 DGE-Paket) für die Studie ausgewählt, da sie zu den am häufigsten verwendeten Paketen für die differentielle Spleißanalyse gehören. rMATS wurde als beliebte Methode für die ereignisbasierte Analyse ausgewählt. Eine weitere beliebte ereignisbasierte Methode ist MISO (Mixture of Isoforms)1. Für APA adaptieren wir den Exon-basierten Ansatz.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62636/62636fig01.jpg"> Abbildung 1. Analyse-Pipeline. Flussdiagramm der in der Analyse verwendeten Schritte. Zu den Schritten gehören: Abrufen der Daten, Durchführen von Qualitätsprüfungen und Leseausrichtung, gefolgt von Zählen von Lesevorgängen unter Verwendung von Anmerkungen für bekannte Exons, Introns und pA-Stellen, Filtern zur Entfernung niedriger Zählungen und Normalisierung. PolyA-seq-Daten wurden für alternative pA-Stellen mit diffSplice/DEXSeq-Methoden analysiert, Bulk-RNA-Seq wurde auf alternative Spleißung auf Exon-Ebene mit diffSplice/DEXseq-Methoden analysiert und AS-Ereignisse mit rMATS analysiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62636/62636fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Die in dieser Umfrage verwendeten RNA-seq-Daten stammen von Gene Expression Omnibus (GEO) (GSE138691)15. Wir verwendeten Maus-RNA-seq-Daten aus dieser Studie mit zwei Bedingungsgruppen: Wildtyp (WT) und Muskelblind-ähnlicher Typ-1-Knockout (Mbnl1 KO) mit jeweils drei Replikaten. Um die Analyse der differentiellen Polyadenylierungsstandortnutzung zu demonstrieren, erhielten wir PolyA-seq-Daten von Mausembryo-Fibroblasten (MEFs) (GEO Accession GSE60487)16. Die Daten haben vier Bedingungsgruppen: Wild-Typ (WT), Muskelblind-Typ 1/Typ 2 Doppel-Knockout (Mbnl1/2 DKO), Mbnl 1/2 DKO mit Mbnl3-Knockdown (KD) und Mbnl1/2 DKO mit Mbnl3-Kontrolle (Strg). Jede Bedingungsgruppe besteht aus zwei Replikaten.
<table border="1" fo:font-size="5px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>GEO-Beitritt</td>
			<td>SRA-Ausführungsnummer</td>
			<td>Name des Beispiels</td>
			<td>Zustand</td>
			<td>Replizieren</td>
			<td>Gewebe</td>
			<td>Sequenzierung</td>
			<td>Leselänge</td>
		</tr><tr><td rowspan="6">RNA-Seq</td>
			<td>GSM4116218</td>
			<td>SRR10261601</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_1</td>
			<td>Mbnl1 Knockout</td>
			<td>Wiederholung 1</td>
			<td>Thymus</td>
			<td>Gepaartes Ende</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM4116219</td>
			<td>SRR10261602</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_2</td>
			<td>Mbnl1 Knockout</td>
			<td>Wiederholung 2</td>
			<td>Thymus</td>
			<td>Gepaartes Ende</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM4116220</td>
			<td>SRR10261603</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_3</td>
			<td>Mbnl1 Knockout</td>
			<td>Wiederholung 3</td>
			<td>Thymus</td>
			<td>Gepaartes Ende</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM4116221</td>
			<td>SRR10261604</td>
			<td>WT_Thymus_1</td>
			<td>Wildtyp</td>
			<td>Wiederholung 1</td>
			<td>Thymus</td>
			<td>Gepaartes Ende</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM4116222</td>
			<td>SRR10261605</td>
			<td>WT_Thymus_2</td>
			<td>Wildtyp</td>
			<td>Wiederholung 2</td>
			<td>Thymus</td>
			<td>Gepaartes Ende</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM4116223</td>
			<td>SRR10261606</td>
			<td>WT_Thymus_3</td>
			<td>Wildtyp</td>
			<td>Wiederholung 3</td>
			<td>Thymus</td>
			<td>Gepaartes Ende</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td rowspan="8">3P-Seq</td>
			<td>GSM1480973</td>
			<td>SRR1553129</td>
			<td>WT_1</td>
			<td>Wildtyp (WT)</td>
			<td>Wiederholung 1</td>
			<td>Embryonale Fibroblasten (MEFs) der Maus</td>
			<td>Single-End</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480974</td>
			<td>SRR1553130</td>
			<td>WT_2</td>
			<td>Wildtyp (WT)</td>
			<td>Wiederholung 2</td>
			<td>Embryonale Fibroblasten (MEFs) der Maus</td>
			<td>Single-End</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480975</td>
			<td>SRR1553131</td>
			<td>DKO_1</td>
			<td>Mbnl 1/2 Doppel-Knockout (DKO)</td>
			<td>Wiederholung 1</td>
			<td>Embryonale Fibroblasten (MEFs) der Maus</td>
			<td>Single-End</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480976</td>
			<td>SRR1553132</td>
			<td>DKO_2</td>
			<td>Mbnl 1/2 Doppel-Knockout (DKO)</td>
			<td>Wiederholung 2</td>
			<td>Embryonale Fibroblasten (MEFs) der Maus</td>
			<td>Single-End</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480977</td>
			<td>SRR1553133</td>
			<td>DKOsiRNA_1</td>
			<td>Mbnl 1/2 Doppel-Knockout mit Mbnl 3 siRNA (KD)</td>
			<td>Wiederholung 1</td>
			<td>Embryonale Fibroblasten (MEFs) der Maus</td>
			<td>Single-End</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480978</td>
			<td>SRR1553134</td>
			<td>DKOsiRNA_2</td>
			<td>Mbnl 1/2 Doppel-Knockout mit Mbnl 3 siRNA (KD)</td>
			<td>Wiederholung 2</td>
			<td>Embryonale Fibroblasten (MEFs) der Maus</td>
			<td>Single-End</td>
			<td>36 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480979</td>
			<td>SRR1553135</td>
			<td>DKONTsiRNA_1</td>
			<td>Mbnl 1/2 Doppel-Knockout mit nicht-targetender siRNA (Ctrl)</td>
			<td>Wiederholung 1</td>
			<td>Embryonale Fibroblasten (MEFs) der Maus</td>
			<td>Single-End</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480980</td>
			<td>SRR1553136</td>
			<td>DKONTsiRNA_2</td>
			<td>Mbnl 1/2 Doppel-Knockout mit nicht-targetender siRNA (Ctrl)</td>
			<td>Wiederholung 2</td>
			<td>Embryonale Fibroblasten (MEFs) der Maus</td>
			<td>Single-End</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1. Zusammenfassung der RNA-Seq- und PolyA-seq-Datensätze, die für die Analyse verwendet wurden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Not relevent for computational study</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of alternative splicing and polyadenylation in rna-seq data

Neben der typischen Analyse von RNA-Seq zur Messung der differentiellen Genexpression (DGE) unter experimentellen/biologischen Bedingungen können RNA-seq-Daten auch verwendet werden, um andere komplexe regulatorische Mechanismen auf Exon-Ebene zu erforschen. Alternative Spleißung und Polyadenylierung spielen eine entscheidende Rolle für die funktionelle Vielfalt eines Gens, indem sie verschiedene Isoformen erzeugen, um die Genexpression auf posttranskriptioneller Ebene zu regulieren, und die Beschränkung der Analysen auf die gesamte Genebene kann diese wichtige regulatorische Schicht übersehen. Hier demonstrieren wir detaillierte Schritt-für-Schritt-Analysen zur Identifizierung und Visualisierung der differentiellen Exon- und Polyadenylierungsstellennutzung über Bedingungen hinweg, wobei Bioconductor und andere Pakete und Funktionen wie DEXSeq, diffSplice aus dem Limma-Paket und rMATES verwendet werden.

Nach dem Ausführen des obigen Schritt-für-Schritt-Workflows werden die AS- und APA-Analyseausgaben und repräsentativen Ergebnisse in Form von Tabellen und Datendiagrammen erstellt, die wie folgt generiert werden.
WIE: Die Hauptergebnisse der AS-Analyse (Zusatztabelle 1 für diffSplice; Tabelle 2 für DEXSeq) ist eine Liste von Exons, die eine unterschiedliche Nutzung über Bedingungen hinweg zeigen, und eine Liste von Genen, die eine sig...

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Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data

Alternative Spleißen (AS) und alternative Polyadenylierung (APA) erweitern die Vielfalt der Transkriptisoformen und ihrer Produkte. Hier beschreiben wir bioinformatische Protokolle zur Analyse von Bulk-RNA-seq und 3'-Endsequenzierungsassays, um AS und APA zu erkennen und zu visualisieren, die unter experimentellen Bedingungen variieren.

Identifizierung von alternativem Spleißen und Polyadenylierung in RNA-seq-Daten

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also ...

Dieses Protokoll bietet ein umfassendes Verständnis von Genisoformen, die durch alternatives Spleißen und Polyadenylierung erzeugt werden, indem es einen schrittweisen Workflow zur Identifizierung differentieller Spleißstellen, differentiell exprimierter Exons und Poly(A)-Stellen bereitstellt. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es sowohl Exon-basierte als auch ereignisbasierte Methoden zur Untersuchung des alternativen Spleißens evaluiert. Es wendet auch eine Exon-basierte Methode an, um alternative Polyadenylierung zu untersuchen.Die R-Markdown-Dateien, die die Codes und Notizen für die AS- und AP-Analyse enthalten, wurden bereitgestellt. Es wäre ratsam, die Schritte in der R Markdown-Datei zu befolgen und die Notiz für jeden Schritt sorgfältig zu erreichen. Um das differentielle Spleißen mit diffSplice aus limma zu identifizieren, folgen Sie der R-Notebook-Datei.Bereiten Sie die Eingabedateien wie im Textmanuskript beschrieben vor. Stellen Sie sicher, dass die Schritte eins bis drei im Manuskript nacheinander befolgt wurden, um Eingabedateien vorzubereiten, bevor Sie fortfahren. Laden Sie zunächst die erforderlichen Bibliotheken.Um eine unspezifische Filterung durchzuführen, extrahieren Sie zunächst die zuvor erhaltene Matrix der Lesezähler und erstellen Sie eine Liste von Features mit der DGEList-Funktion aus dem edgeR-Paket, wobei Zeilen Gene und Spalten Proben darstellen. Transformieren Sie dann die Daten mithilfe der CPM-Funktion aus dem edgeR-Paket von der Rohskala in Zählungen pro Million und behalten Sie Exons mit Zählungen über einem einstellbaren Schwellenwert bei. Dieser Datensatz enthält sechs Beispiele.Daher wird der CPM auf mehr als eine und mindestens drei von sechs Stichproben festgelegt. Normalisieren Sie die Zählungen über Stichproben hinweg mit der calcNormFactors-Funktion aus dem edgeR-Paket unter Verwendung von Trimmed Mean of M-Werten. Diese Funktion berechnet Skalierungsfaktoren, um Bibliotheksgrößen anzupassen.Verwenden Sie die zuvor generierte Beispieltabelle, um die Entwurfsmatrix zu erstellen, um die experimentellen Bedingungen für jede Probe zu definieren. Führen Sie die voom-Funktion des limma-Pakets aus, um RNA-Sequenzierungsdaten zu verarbeiten und die Varianz zu schätzen. Diese Funktion generiert Präzisionsgewichte zur Korrektur von Poisson-Zählrauschen und wandelt die Exon-Level-Zählungen in zwei Zählungen pro Million oder logCPM um.Führen Sie die lmfit-Funktion aus, um lineare Modelle an die Ausdrucksdaten für jedes Exon anzupassen. Führen Sie dann die eBayes-Funktion aus, um empirische Statistiken für das angepasste Modell zu berechnen, um differentielle Exonausdrücke zu erkennen. Definieren Sie eine Kontrastmatrix für die experimentellen Vergleiche von Interesse.Verwenden Sie die Kontraste. Fit-Funktion, um Koeffizienten und Standardfehler für jedes Vergleichspaar zu erhalten. Führen Sie diffSplice auf dem angepassten Modell aus, um die Unterschiede in der Exon-Verwendung von Genen zwischen Wildtyp und Knockout zu testen.Untersuchen Sie die am besten bewerteten Ergebnisse mit der topSplice-Funktion, wobei ein Test gleich t eine Rangfolge von AS-Exons und ein Test gleich Simes eine Rangfolge von Genen ergibt. Führen Sie die plotSplice-Funktion aus, um die Ergebnisse zu plotten. Wenn man das interessierende Gen in das Gen-ID-Argument einfügt, zeigen die roten Punkte die differentiell exprimierten Exons.Generieren Sie ein Vulkandiagramm mit dem EnhancedVolcano-Bioleiterpaket, um die differentiell exprimierten Exons darzustellen. Um rMATS zu verwenden, stellen Sie sicher, dass die neueste Version von rMATS Version 4.1.1 entweder mit conda oder GitHub im Arbeitsverzeichnis installiert ist. Wechseln Sie zu dem Ordner, der die BAM-Dateien enthält, die nach der Zuordnung abgerufen wurden.Bereiten Sie Textdateien gemäß den Anforderungen von rMATS für die beiden Bedingungen vor, bei denen der Name von BAM-Dateien und deren Pfad durch ein Komma getrennt kopiert werden. Führen Sie rmas aus. py verwendet die beiden generierten Eingabetextdateien, die den Pfad der BAM-Dateien und die Anmerkung beschreiben.GTF-Datei zuvor erhalten. Dadurch wird ein Ausgabeordner rmats_out generiert, der Textdateien enthält, die Statistiken beschreiben, einschließlich P-Werte und Einschlussstufen für jedes Spleißereignis separat. Verwenden Sie den Bioconductor Package Maser, um die rMATS-Ergebnisse zu untersuchen.Laden Sie die Junction- und Exon-Counts-Textdateien mit der Erweiterung JCEC in das Maser-Objekt und schließen Sie mindestens fünf durchschnittliche Lesevorgänge pro Spleißereignis ein, um das Ergebnis basierend auf der Abdeckung zu filtern. Um die rMATS-Ergebnisse zu visualisieren, führen Sie zunächst die Funktion topEvents aus dem Maser-Paket aus und wählen Sie die signifikanten Spleißereignisse mit einer False-Discovery-Rate von 10 % und einer Mindeständerung von 10 % in Prozent gespleißt oder PSI aus. Überprüfen Sie die Genereignisse für einzelne Gene von Interesse und zeichnen Sie PSI-Werte für jedes Spleißereignis dieses Gens.Generieren Sie ein Vulkandiagramm, indem Sie den Ereignistyp angeben. Verwenden Sie die mit rMATS erhaltenen Ergebnisse von Spleißereignissen in Form von Textdateien, um Sashimi-Plots mit dem Paket rmats2sashimiplot zu generieren. Das Sashimi-Diagramm zeigt ein übersprungenes Exon-Ereignis im Wnk1-Gen.Jede Zeile repräsentiert eine RNA-seq-Probe, drei Replikate des Wildtyps und Mbnl1-Knockout. Die Höhe zeigt die Leseabdeckung in RPKM und die Verbindungsbögen zeigen Verbindungslesevorgänge über Exons hinweg. Der untere Teil zeigt annotierte alternative Isoformen des Genmodells.Eine signifikante Faltenänderung und starke statistische Beweise für echte Unterschiede können in den Genen beobachtet werden, die sich im oberen linken oder rechten Quadranten der Vulkandiagramme befinden, die mit diffSplice und DEXSeq erhalten wurden. Es wurde festgestellt, dass ein Kassettenexon zwischen verschiedenen Bedingungen für das Gen Wnk1 variiert. Das Differential-Exon-Nutzungsdiagramm zeigte Hinweise auf differentielles Spleißen an fünf Exon-Stellen in der Nähe von Wnk1.6.45, wobei die rosa hervorgehobenen Exons wahrscheinlich in Mbnl1-Knockout-Proben im Vergleich zum Wildtyp ausgespleißt wurden.Das Vulkandiagramm von Genen, die alternativ gespleißt werden, half bei der Unterscheidung zwischen den Genen, die vom Wildtyp ausgeschlossen wurden, und denen, die in den Wildtyp eingeschlossen waren. Die Arten von Spleißereignissen SE, A5SS, A3SS, MXE und RI wurden unter Verwendung von Sashimi-Diagrammen der wichtigsten Gene dieser Ereignisse visualisiert. Die differentielle APA-Aktivität in drei primären untranslatierten Genregionen wurde anhand von Vulkandiagrammen beobachtet.Die signifikant unterschiedlichen PA-Standortnutzungsergebnisse, die von verschiedenen Pipelines erfasst wurden, wurden mittels Ereignisdiagramm visualisiert. Eine signifikante distale bis proximale Verschiebung der PA-Standortnutzung bei Doppel-Knockouts kann in beiden Genen FOSL1 und Papola beobachtet werden. Die mittlere Abdeckung in flankierenden Regionen, die an bekannten PA-Spaltungsstellen auf genomweiter Ebene verankert sind, wurde mit Hilfe eines diagnostischen Diagramms bestimmt.Stellen Sie sicher, dass die Parameter wie transspezifische Informationen und Mehrfachüberlappung zulassen beim Generieren von Zählmetriken korrekt verwendet werden. Die lineare Modellanpassung und das Erzeugen von Kontrastpaaren ist wichtig für den richtigen Vergleich. Stellen Sie für rMITS sicher, dass alle Parameter gemäß Ihren Daten korrekt eingestellt sind, bevor Sie den Befehl ausführen.Die Gene, die aus der differentiellen Spleißaktivität gewonnen werden, könnten verwendet werden, um eine Gensatzanreicherungsanalyse durchzuführen. Ein weiteres Tool namens MISO könnte für weitere ereignisbasierte Analysen verwendet werden.

Research

JoVE Journal

Biology

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

RNA-seq Analyse Transkriptomen Thrombin-behandelt und Control Human Pulmonary mikrovaskulären Endothelzellen

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Forschung

Biologie

Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

Depletion der ribosomalen RNA für Mosquito Gut metagenomische RNA-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Alternative Kulturen für menschlichen pluripotenten Stammzellen Produktion, Wartung und Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Nachweis von Alternative Splicing Während Epithelial-mesenchymale Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Eine experimentelle und Bioinformatik-Protokoll für die RNA-seq Analysen der Photoperiodische Diapause in den asiatischen Tigermücke,<em&gt; Aedes albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Schnelle Identifikation von chemischen Genetische Interaktionen in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Methods to Discover Alternative Promoter Usage and Transcriptional Regulation of Murine Bcrp1

Methoden Alternative Promoter Verwendung und Transkriptions-Verordnung von Murine Bcrp1 zu entdecken

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Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Identifizierung neuartiger Regulatoren der Pflanzentranspiration durch großangelegtes Thermisches Bildgebungsscreening in Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq

Eine Bioinformatik-Pipeline zur Untersuchung der molekularen Evolution und Genexpression mit RNA-seq

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus ...