Name: identification of alternative splicing and polyadenylation in rna-seq data
Uploaded: 2021-06-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data at JoVE.com

इस अध्ययन को ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद (एआरसी) फ्यूचर फैलोशिप (एफटी 16010043) और एएनयू फ्यूचर्स स्कीम द्वारा समर्थित किया गया था।

1. विश्लेषण में उपयोग किए जाने वाले उपकरण और आर पैकेज की स्थापना
<ol><li>कोंडा एक लोकप्रिय और लचीला पैकेज प्रबंधक है जो सभी प्लेटफार्मों पर उनकी निर्भरता के साथ पैकेज की सुविधाजनक स्थापना की अनुमति द?...

<ol>
	<li>Katz, Y., Wang, E. T., Airoldi, E. M., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+design+of+RNA+sequencing+experiments+for+identifying+isoform+regulation.">Analysis and design of RNA sequencing experiments for identifying isoform regulation.</a> Nature Methods. 7 (12), 1009-1015 (2010).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+alternative+splicing+and+its+regulation.">Mechanism of alternative splicing and its regulation.</a> Biomedical Reports. 3 (2), 152-158 (2015).</li><li>Mehmood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+differential+splicing+tools+for+RNA-seq+studies.">Systematic evaluation of differential splicing tools for RNA-seq studies.</a> Briefings in Bioinformatics. 21 (6), 2052-2065 (2020).</li><li>Movassat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+between+alternative+polyadenylation+and+alternative+splicing+is+limited+to+terminal+introns.">Coupling between alternative polyadenylation and alternative splicing is limited to terminal introns.</a> RNA Biology. 13 (7), 646-655 (2016).</li><li>Tian, B., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+polyadenylation+of+mRNA+precursors.">Alternative polyadenylation of mRNA precursors.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (1), 18-30 (2017).</li><li>Herrmann, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PolyASite+2.0:+a+consolidated+atlas+of+polyadenylation+sites+from+3'+end+sequencing.">PolyASite 2.0: a consolidated atlas of polyadenylation sites from 3' end sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 48 (1), 174-179 (2020).</li><li>Liu, R., Loraine, A. E., Dickerson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparisons+of+computational+methods+for+differential+alternative+splicing+detection+using+RNA-seq+in+plant+systems.">Comparisons of computational methods for differential alternative splicing detection using RNA-seq in plant systems.</a> BMC Bioinformatics. 15 (1), 364 (2014).</li><li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis.">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biology. 17 (1), 13 (2016).</li><li>Anders, S., Reyes, A., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+differential+usage+of+exons+from+RNA-seq+data.">Detecting differential usage of exons from RNA-seq data.</a> Genome Research. 22 (10), 2008-2017 (2012).</li><li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies.">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), 47 (2014).</li><li>Shen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rMATS:+Robust+and+flexible+detection+of+differential+alternative+splicing+from+replicate+RNA-Seq+data.">rMATS: Robust and flexible detection of differential alternative splicing from replicate RNA-Seq data.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (51), 5593-5601 (2014).</li><li>Mehmood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+differential+splicing+tools+for+RNA-seq+studies.">Systematic evaluation of differential splicing tools for RNA-seq studies.</a> Briefings in bioinformatics. 21 (6), 2052-2065 (2020).</li><li>Kanitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+assessment+of+methods+for+the+computational+inference+of+transcript+isoform+abundance+from+RNA-seq+data.">Comparative assessment of methods for the computational inference of transcript isoform abundance from RNA-seq data.</a> Genome biology. 16 (1), 1-26 (2015).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Sznajder, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+MBNL1+induces+RNA+misprocessing+in+the+thymus+and+peripheral+blood.">Loss of MBNL1 induces RNA misprocessing in the thymus and peripheral blood.</a> Nature Communications. 11, 1-11 (2020).</li><li>Batra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+MBNL+leads+to+disruption+of+developmentally+regulated+alternative+polyadenylation+in+RNA-mediated+disease.">Loss of MBNL leads to disruption of developmentally regulated alternative polyadenylation in RNA-mediated disease.</a> Molecular Cell. 56 (2), 311-322 (2014).</li><li>Leinonen, R., Sugawara, H., Shumway, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sequence+read+archive.">The sequence read archive.</a> Nucleic acids research. 39, 19-21 (2010).</li><li>Tange, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> GNU parallel-the command-line power tool. 36, 42-47 (2011).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAR:+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner.">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li><li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=edgeR:+a+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data.">edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).</li><li>Robinson, M. D., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scaling+normalization+method+for+differential+expression+analysis+of+RNA-seq+data.">A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data.</a> Genome Biology. 11 (3), 25 (2010).</li><li>Veiga, D. F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=maser:+Mapping+Alternative+Splicing+Events+to+pRoteins.">maser: Mapping Alternative Splicing Events to pRoteins.</a> R package version 1.4.0. , (2019).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10 (13), 25 (2009).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Ram&#237;rez, F., D&#252;ndar, F., Diehl, S., Gr&#252;ning, B. A., Manke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=deepTools:+a+flexible+platform+for+exploring+deep-sequencing+data.">deepTools: a flexible platform for exploring deep-sequencing data.</a> Nucleic acids research. 42 (1), 187-191 (2014).</li><li>Merino, G. A., Conesa, A., Fern&#225;ndez, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+benchmarking+of+workflows+for+detecting+differential+splicing+and+differential+expression+at+isoform+level+in+human+RNA-seq+studies.">A benchmarking of workflows for detecting differential splicing and differential expression at isoform level in human RNA-seq studies.</a> Briefings in bioinformatics. 20 (2), 471-481 (2019).</li><li>Chhangawala, S., Rudy, G., Mason, C. E., Rosenfeld, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+read+length+on+quantification+of+differentially+expressed+genes+and+splice+junction+detection.">The impact of read length on quantification of differentially expressed genes and splice junction detection.</a> Genome biology. 16 (1), 1-10 (2015).</li><li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis.">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biol. 17, 13 (2016).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks.">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat Protoc. 7 (3), 562-578 (2012).</li><li>Li, B., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RSEM:+accurate+transcript+quantification+from+RNA-Seq+data+with+or+without+a+reference+genome.">RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome.</a> BMC Bioinformatics. 12, 323 (2011).</li><li>Bray, N. L., Pimentel, H., Melsted, P., Pachter, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-optimal+probabilistic+RNA-seq+quantification.">Near-optimal probabilistic RNA-seq quantification.</a> Nat Biotechnol. 34 (5), 525-527 (2016).</li></ol>

इस अध्ययन में, हमने थोक आरएनए-सेक और 3 'अंत अनुक्रमण डेटा में एएस और एपीए का पता लगाने के लिए एक्सॉन-आधारित और घटना-आधारित दृष्टिकोणों का मूल्यांकन किया। एक्सॉन-आधारित एएस दृष्टिकोण अलग-अलग व्यक्त एक्सॉ...

आरएनए-सेक का व्यापक रूप से वर्षों से व्यापक रूप से उपयोग किया गया है आमतौर पर अंतर जीन अभिव्यक्ति और जीन खोज1 का आकलन करने के लिए। इसके अलावा, इसका उपयोग विभिन्न आइसोफॉर्म व्यक्त करने वाले जीन के कारण अलग-अलग एक्सॉन स्तर के उपयोग का अनुमान लगाने के लिए भी किया जा सकता है, इसलिए पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल स्तर पर जीन विनियमन की बेहतर समझ में योगदान देता है। यूकेरियोटिक जीन के बहुमत एमआरएनए अभिव्यक्ति की विविधता को बढ़ाने के लिए वैकल्पिक स्प्लिसिंग (एएस) द्वारा विभिन्न आइसोफॉर्म उत्पन्न करते हैं। एएस घटनाओं को विभिन्न पैटर्नों में विभाजित किया जा सकता है: पूर्ण एक्सॉन (एसई) को छोड़ना जहां एक ("कैसेट") एक्सॉन को इसके फ्लैंकिंग इंट्रोन्स के साथ प्रतिलेख से पूरी तरह से हटा दिया जाता है; वैकल्पिक (दाता) 5 'स्प्लिस साइट चयन (ए 5 एसएस) और वैकल्पिक 3 ' (स्वीकर्ता) स्प्लिस साइट चयन (ए 3 एसएस) जब एक्सॉन के दोनों छोर पर दो या दो से अधिक स्प्लिस साइटें मौजूद होती हैं; इंट्रोन्स (आरआई) का प्रतिधारण जब एक इंट्रोन को परिपक्व एमआरएनए प्रतिलेख और एक्सॉन उपयोग (एमएक्सई) के पारस्परिक बहिष्करण के भीतर बनाए रखा जाता है, जहां दो उपलब्ध एक्सॉन में से केवल एक कोएक समय में बनाए रखा जा सकता है। वैकल्पिक पॉलीएडेनाइलेशन (एपीए) एक एकल प्रतिलेख4 से कई एमआरएनए आइसोफॉर्म उत्पन्न करने के लिए वैकल्पिक पॉली (ए) साइटों का उपयोग करके जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने में भी महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। अधिकांश पॉलीएडेनाइलेशन साइटें (पीए) 3 'अअनुवादित क्षेत्र (3' यूटीआर) में स्थित हैं, जो विविध 3 ' यूटीआर लंबाई के साथ एमआरएनए आइसोफॉर्म उत्पन्न करती हैं। चूंकि 3 'यूटीआर नियामक तत्वों को पहचानने के लिए केंद्रीय केंद्र है, इसलिए विभिन्न 3 'यूटीआर लंबाई एमआरएनए स्थानीयकरण, स्थिरता और अनुवाद5 को प्रभावित कर सकती है। एपीए का पता लगाने के लिए अनुकूलित 3 'अंत अनुक्रमण परखों का एक वर्ग है जो प्रोटोकॉल6 के विवरण में भिन्न है। यहां वर्णित पाइपलाइन पॉलीए-सेक के लिए डिज़ाइन की गई है, लेकिन वर्णित अन्य प्रोटोकॉल के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
इस अध्ययन में, हम विभेदक एक्सॉन विश्लेषण विधियों 7,8 (चित्रा 1) की एक पाइपलाइन प्रस्तुत करते हैं, जिसे दो व्यापक श्रेणियों में विभाजित किया जा सकता है: एक्सॉन-आधारित (DEXSeq9, डिफस्पिस्प्लिस10) और इवेंट-आधारित (ट्रांसक्रिप्ट स्प्लिसिंग के मल्टीवेरिएट विश्लेषण (rMATS)11 को दोहराएं)। एक्सॉन-आधारित विधियां अलग-अलग एक्सॉन की स्थितियों में गुना परिवर्तन की तुलना करती हैं, समग्र जीन फोल्ड परिवर्तन के माप के खिलाफ अलग-अलग व्यक्त एक्सॉन उपयोग को कॉल करती हैं, और इससे एएस गतिविधि के जीन-स्तर माप की गणना करती हैं। इवेंट-आधारित विधियां एक्सॉन-इंट्रॉन-पैनिंग जंक्शन रीड का उपयोग विशिष्ट स्प्लिसिंग घटनाओं का पता लगाने और वर्गीकृत करने के लिए करती हैं जैसे कि एक्सॉन स्किपिंग या इंट्रोन्स के प्रतिधारण, और आउटपुट3 में इन एएस प्रकारों को अलग करना। इस प्रकार, ये विधियां एएस12,13 के पूर्ण विश्लेषण के लिए पूरक विचार प्रदान करती हैं। हमने अध्ययन के लिए DEXSeq (DESeq214 DGE पैकेज के आधार पर) और डिफस्प्लिस (लिम्मा10 DGE पैकेज के आधार पर) का चयन किया क्योंकि वे विभेदक स्प्लिसिंग विश्लेषण के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले पैकेजों में से हैं। आरएमएटीएस को घटना-आधारित विश्लेषण के लिए एक लोकप्रिय विधि के रूप में चुना गया था। एक और लोकप्रिय घटना-आधारित विधि एमआईएसओ (आइसोफॉर्म का मिश्रण) 1 है। एपीए के लिए हम एक्सॉन-आधारित दृष्टिकोण को अनुकूलित करते हैं।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62636/62636fig01.jpg"> चित्र 1. विश्लेषण पाइपलाइन। विश्लेषण में उपयोग किए गए चरणों का फ़्लोचार्ट। चरणों में शामिल हैं: डेटा प्राप्त करना, गुणवत्ता जांच करना और संरेखण पढ़ना, जिसके बाद ज्ञात एक्सॉन, इंट्रोन्स और पीए साइटों के लिए एनोटेशन का उपयोग करके रीड की गिनती, कम गिनती को हटाने और सामान्यीकरण के लिए फ़िल्टर करना। डिफस्प्लिस/डीईएक्ससेक विधियों का उपयोग करके वैकल्पिक पीए साइटों के लिए पॉलीए-सेक डेटा का विश्लेषण किया गया था, थोक आरएनए-सेक का विश्लेषण एक्सॉन स्तर पर वैकल्पिक स्प्लिसिंग के लिए डिफस्प्लिस / डीईएक्ससेक विधियों के साथ किया गया था, और एएस घटनाओं का विश्लेषण आरएमएटीएस के साथ किया गया था। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62636/62636fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
इस सर्वेक्षण में उपयोग किए गए आरएनए-सेक डेटा को जीन एक्सप्रेशन ओमनीबस (जीईओ) (जीएसई 138691)15 से प्राप्त किया गया था। हमने इस अध्ययन से माउस आरएनए-सेक डेटा का उपयोग दो स्थिति समूहों के साथ किया: वाइल्ड-टाइप (डब्ल्यूटी) और मसलब्लाइंड जैसे टाइप 1 नॉकआउट (एमबीएनएल 1 केओ) प्रत्येक में तीन प्रतिकृतियां थीं। विभेदक पॉलीएडेनाइलेशन साइट उपयोग विश्लेषण का प्रदर्शन करने के लिए, हमने माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट (एमईएफ) पॉलीए-सेक डेटा (जीईओ परिग्रहण जीएसई 60487)16 प्राप्त किया। डेटा में चार स्थिति समूह हैं: वाइल्ड-टाइप (डब्ल्यूटी), मसलब्लाइंड जैसे टाइप 1/टाइप 2 डबल नॉकआउट (एमबीएनएल 1/2 डीकेओ), एमबीएनएल 1/2 डीकेओ के साथ एमबीएनएल 3 वध (केडी) और एमबीएनएल 3 नियंत्रण (सीटीआरएल) के साथ एमबीएनएल 1/2 डीकेओ। प्रत्येक स्थिति समूह में दो प्रतिकृतियां होती हैं।
<table border="1" fo:font-size="5px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>जीईओ परिग्रहण</td>
			<td>SRA रन नंबर</td>
			<td>नमूना नाम</td>
			<td>दशा</td>
			<td>प्रतिकृति</td>
			<td>ऊतक</td>
			<td>अनुक्रमण</td>
			<td>पढ़ने की लंबाई</td>
		</tr><tr><td rowspan="6">आरएनए-सेक</td>
			<td>GSM4116218</td>
			<td>SRR10261601</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_1</td>
			<td>Mbnl1 नॉकआउट</td>
			<td>प्रतिनिधि 1</td>
			<td>थाइमस</td>
			<td>पेयर-एंड</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM4116219</td>
			<td>SRR10261602</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_2</td>
			<td>Mbnl1 नॉकआउट</td>
			<td>प्रतिनिधि 2</td>
			<td>थाइमस</td>
			<td>पेयर-एंड</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM4116220</td>
			<td>SRR10261603</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_3</td>
			<td>Mbnl1 नॉकआउट</td>
			<td>प्रतिनिधि 3</td>
			<td>थाइमस</td>
			<td>पेयर-एंड</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM4116221</td>
			<td>SRR10261604</td>
			<td>WT_Thymus_1</td>
			<td>जंगली प्रकार</td>
			<td>प्रतिनिधि 1</td>
			<td>थाइमस</td>
			<td>पेयर-एंड</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM4116222</td>
			<td>SRR10261605</td>
			<td>WT_Thymus_2</td>
			<td>जंगली प्रकार</td>
			<td>प्रतिनिधि 2</td>
			<td>थाइमस</td>
			<td>पेयर-एंड</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM4116223</td>
			<td>SRR10261606</td>
			<td>WT_Thymus_3</td>
			<td>जंगली प्रकार</td>
			<td>प्रतिनिधि 3</td>
			<td>थाइमस</td>
			<td>पेयर-एंड</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td rowspan="8">3P-Seq</td>
			<td>GSM1480973</td>
			<td>SRR1553129</td>
			<td>WT_1</td>
			<td>जंगली प्रकार (WT)</td>
			<td>प्रतिनिधि 1</td>
			<td>माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट (एमईएफ)</td>
			<td>सिंगल-एंड</td>
			<td>40 बीपी</td>
		</tr><tr><td>GSM1480974</td>
			<td>SRR1553130</td>
			<td>WT_2</td>
			<td>जंगली प्रकार (WT)</td>
			<td>प्रतिनिधि 2</td>
			<td>माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट (एमईएफ)</td>
			<td>सिंगल-एंड</td>
			<td>40 बीपी</td>
		</tr><tr><td>GSM1480975</td>
			<td>SRR1553131</td>
			<td>DKO_1</td>
			<td>एमबीएनएल 1/2 डबल नॉकआउट (डीकेओ)</td>
			<td>प्रतिनिधि 1</td>
			<td>माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट (एमईएफ)</td>
			<td>सिंगल-एंड</td>
			<td>40 बीपी</td>
		</tr><tr><td>GSM1480976</td>
			<td>SRR1553132</td>
			<td>DKO_2</td>
			<td>एमबीएनएल 1/2 डबल नॉकआउट (डीकेओ)</td>
			<td>प्रतिनिधि 2</td>
			<td>माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट (एमईएफ)</td>
			<td>सिंगल-एंड</td>
			<td>40 बीपी</td>
		</tr><tr><td>GSM1480977</td>
			<td>SRR1553133</td>
			<td>DKOsiRNA_1</td>
			<td>Mbnl 3 sirna (KD) के साथ Mbnl 1/2 डबल नॉकआउट</td>
			<td>प्रतिनिधि 1</td>
			<td>माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट (एमईएफ)</td>
			<td>सिंगल-एंड</td>
			<td>40 बीपी</td>
		</tr><tr><td>GSM1480978</td>
			<td>SRR1553134</td>
			<td>DKOsiRNA_2</td>
			<td>Mbnl 3 sirna (KD) के साथ Mbnl 1/2 डबल नॉकआउट</td>
			<td>प्रतिनिधि 2</td>
			<td>माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट (एमईएफ)</td>
			<td>सिंगल-एंड</td>
			<td>36 बीपी</td>
		</tr><tr><td>GSM1480979</td>
			<td>SRR1553135</td>
			<td>DKONTsiRNA_1</td>
			<td>गैर-लक्ष्यीकरण सीआरएनए (Ctrl) के साथ Mbnl 1/2 डबल नॉकआउट</td>
			<td>प्रतिनिधि 1</td>
			<td>माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट (एमईएफ)</td>
			<td>सिंगल-एंड</td>
			<td>40 बीपी</td>
		</tr><tr><td>GSM1480980</td>
			<td>SRR1553136</td>
			<td>DKONTsiRNA_2</td>
			<td>गैर-लक्ष्यीकरण सीआरएनए (Ctrl) के साथ Mbnl 1/2 डबल नॉकआउट</td>
			<td>प्रतिनिधि 2</td>
			<td>माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट (एमईएफ)</td>
			<td>सिंगल-एंड</td>
			<td>40 बीपी</td>
		</tr></tbody></table>तालिका 1. विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले आरएनए-सेक और पॉलीए-सेक डेटासेट का सारांश।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Not relevent for computational study</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of alternative splicing and polyadenylation in rna-seq data

जैविक स्थितियों में विभेदक जीन अभिव्यक्ति (डीजीई) को मापने के लिए आरएनए-सेक के विशिष्ट विश्लेषण के साथ-साथ, आरएनए-सेक डेटा का उपयोग एक्सॉन स्तर पर अन्य जटिल नियामक तंत्रों का पता लगाने के लिए भी किया जा सकता है। वैकल्पिक स्प्लिसिंग और पॉलीएडेनाइलेशन पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल स्तर पर जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए विभिन्न आइसोफॉर्म उत्पन्न करके जीन की कार्यात्मक विविधता में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और पूरे जीन स्तर तक विश्लेषण को सीमित करने से इस महत्वपूर्ण नियामक परत को याद किया जा सकता है। यहां, हम बायोकंडक्टर और अन्य पैकेजों और कार्यों का उपयोग करके स्थितियों में अंतर एक्सॉन और पॉलीएडेनाइलेशन साइट उपयोग की पहचान और विज़ुअलाइज़ेशन के लिए विस्तृत चरण-दर-चरण विश्लेषण प्रदर्शित करते हैं, जिसमें डेक्ससेक, लिम्मा पैकेज से डिफस्प्लिस और आरएमएटीएस शामिल हैं।

उपरोक्त चरण-दर-चरण वर्कफ़्लो चलाने के बाद, एएस और एपीए विश्लेषण आउटपुट और प्रतिनिधि परिणाम तालिकाओं और डेटा प्लॉट के रूप में होते हैं, जो निम्नानुसार उत्पन्न होते हैं।
जैसा: एएस विश्?...

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Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data

वैकल्पिक स्प्लिसिंग (एएस) और वैकल्पिक पॉलीएडेनाइलेशन (एपीए) ट्रांसक्रिप्ट आइसोफॉर्म और उनके उत्पादों की विविधता का विस्तार करते हैं। यहां, हम प्रयोगात्मक स्थितियों में अलग-अलग एएस और एपीए का पता लगाने और कल्पना करने के लिए थोक आरएनए-सेक और 3 'एंड सीक्वेंसिंग परख का विश्लेषण करने के लिए जैव सूचना विज्ञान प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

आरएनए-सेक डेटा में वैकल्पिक स्प्लिसिंग और पॉलीएडेनाइलेशन की पहचान

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also ...

यह प्रोटोकॉल वैकल्पिक स्प्लिसिंग और पॉलीएडेनाइलेशन द्वारा उत्पन्न जीन आइसोफॉर्म की व्यापक समझ प्रदान करता है, जो अंतर स्प्लिसिंग साइटों, विभेदक रूप से व्यक्त एक्सॉन और पॉली (ए) साइटों की पहचान करने के लिए चरण-दर-चरण वर्कफ़्लो प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल का मुख्य लाभ यह है कि यह वैकल्पिक स्प्लिसिंग का अध्ययन करने के लिए एक्सॉन-आधारित और इवेंट-आधारित दोनों तरीकों का मूल्यांकन करता है। यह वैकल्पिक पॉलीएडेनाइलेशन का अध्ययन करने के लिए एक्सॉन-आधारित विधि भी लागू करता है।आर मार्कडाउन फाइलें जिनमें एएस और एपी विश्लेषण के लिए कोड और नोट्स शामिल हैं, प्रदान किए गए हैं। आर मार्कडाउन फ़ाइल में दिए गए चरणों का पालन करना और प्रत्येक चरण के लिए नोट पर सावधानीपूर्वक पहुंचना उचित होगा। लिम्मा से डिफरेंशियल स्प्लिस का उपयोग कर के डिफरेंशियल स्प्लिसिंग की पहचान करने के लिए, R नोटबुक फ़ाइल का पालन करें।पाठ पांडुलिपि में वर्णित इनपुट फ़ाइलों को तैयार करें। सुनिश्चित करें कि आगे बढ़ने से पहले इनपुट फाइलें तैयार करने के लिए पांडुलिपि में एक से तीन चरणों का क्रमिक रूप से पालन किया गया है। आवश्यक पुस्तकालयों को लोड करके शुरू करें।गैर-विशिष्ट फ़िल्टरिंग करने के लिए, पहले पहले प्राप्त रीड काउंट के मैट्रिक्स को निकालें और एजआर पैकेज से डीजीईलिस्ट फ़ंक्शन का उपयोग करके सुविधाओं की एक सूची बनाएं, जहां पंक्तियां जीन का प्रतिनिधित्व करती हैं और कॉलम नमूने का प्रतिनिधित्व करते हैं। फिर, एजआर पैकेज से सीपीएम फ़ंक्शन का उपयोग करके डेटा को कच्चे पैमाने से प्रति मिलियन गणना में बदलें, और एक्सॉन को एक सेटटेबल सीमा से अधिक गिनती के साथ रखें। इस डेटा सेट में छह नमूने हैं।इसलिए, सीपीएम को छह में से एक से अधिक और कम से कम तीन नमूनों पर सेट किया गया है। एम मानों के ट्रिम्ड मीन का उपयोग करके एजआर पैकेज से कैल्सनॉर्म फैक्टर्स फ़ंक्शन के साथ नमूनों में गणना को सामान्य करें। यह फ़ंक्शन लाइब्रेरी आकार को समायोजित करने के लिए स्केलिंग कारकों की गणना करेगा।प्रत्येक नमूने के लिए प्रयोगात्मक स्थितियों को परिभाषित करने के लिए डिज़ाइन मैट्रिक्स बनाने के लिए पहले से उत्पन्न नमूना तालिका का उपयोग करें। विचरण का अनुमान लगाने के लिए आरएनए अनुक्रमण डेटा को संसाधित करने के लिए लिम्मा पैकेज के वूम फ़ंक्शन को चलाएं। यह फ़ंक्शन पॉइसन गिनती शोर को सही करने के लिए सटीक वजन उत्पन्न करेगा और एक्सॉन स्तर की गिनती को प्रति मिलियन या लॉगसीपीएम में दो गणनाओं में बदल देगा।प्रत्येक एक्सॉन के लिए अभिव्यक्ति डेटा के लिए रैखिक मॉडल फिट करने के लिए एलएमफिट फ़ंक्शन चलाएं। फिर विभेदक एक्सॉन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए फिट किए गए मॉडल के लिए अनुभवजन्य-आधारित आंकड़ों की गणना करने के लिए ईबेज़ फ़ंक्शन चलाएं। रुचि की प्रयोगात्मक तुलना के लिए एक विपरीत मैट्रिक्स को परिभाषित करें।विरोधाभासों का उपयोग करें। तुलना की प्रत्येक जोड़ी के लिए गुणांक और मानक त्रुटियां प्राप्त करने के लिए फिट फ़ंक्शन। जंगली प्रकार और नॉकआउट के बीच जीन के एक्सॉन उपयोग में अंतर का परीक्षण करने के लिए फिट किए गए मॉडल पर डिफस्प्लिस चलाएं।टॉपस्प्लिस फ़ंक्शन का उपयोग करके शीर्ष क्रम के परिणामों का अन्वेषण करें जहां टी के बराबर एक परीक्षण एएस एक्सॉन की रैंकिंग देता है और सिम के बराबर परीक्षण जीन की रैंकिंग देता है। परिणामों को प्लॉट करने के लिए प्लॉटस्प्लाई फ़ंक्शन चलाएँ। जीन आईडी तर्क में रुचि के जीन को रखने में, लाल बिंदु अलग-अलग व्यक्त एक्सॉन दिखाते हैं।विभेदक रूप से व्यक्त एक्सॉन प्रदर्शित करने के लिए एन्हांस्ड वोल्कानो बायोकंडक्टर पैकेज का उपयोग करके एक ज्वालामुखी प्लॉट उत्पन्न करें। rMATS का उपयोग करने के लिए, सुनिश्चित करें कि rMATS संस्करण 4.1.1 का नवीनतम संस्करण या तो कार्यशील निर्देशिका में conda या GitHub का उपयोग करके स्थापित किया गया है। मैपिंग के बाद प्राप्त बीएएम फ़ाइलों वाले फ़ोल्डर पर जाएं।बीएएम फाइलों के नाम की प्रतिलिपि बनाने की दो शर्तों और अल्पविराम द्वारा अलग किए गए उनके पथ के लिए आरएमएटीएस द्वारा आवश्यक पाठ फाइलें तैयार करें। आरएमएएस चलाएं। दो उत्पन्न इनपुट टेक्स्ट फ़ाइलों का उपयोग करके बीएएम फ़ाइलों और एनोटेशन के पथ का वर्णन किया गया है।gtf फ़ाइल पहले प्राप्त की गई. यह एक आउटपुट फ़ोल्डर उत्पन्न करता है rmats_out जिसमें प्रत्येक स्प्लिसिंग ईवेंट के लिए पी-मान और समावेश स्तर सहित आंकड़ों का वर्णन करने वाली पाठ फ़ाइलें अलग-अलग होती हैं। RMATS परिणामों का पता लगाने के लिए बायोकंडक्टर पैकेज मैसर का उपयोग करें।मासर ऑब्जेक्ट में एक्सटेंशन जेसीईसी के साथ जंक्शन और एक्सॉन काउंट टेक्स्ट फाइलों को लोड करें और कवरेज के आधार पर परिणाम को फ़िल्टर करने के लिए प्रति स्प्लिसिंग इवेंट में कम से कम पांच औसत रीड शामिल करें। RMATS परिणामों की कल्पना करने के लिए, पहले मैसर पैकेज से TopEvents फ़ंक्शन चलाएं, 10% की झूठी खोज दर पर महत्वपूर्ण स्प्लिसिंग घटनाओं का चयन करें और प्रतिशत स्प्लिस्ड या पीएसआई में न्यूनतम 10% परिवर्तन करें। रुचि के व्यक्तिगत जीनों के लिए जीन घटनाओं की जांच करें और उस जीन के प्रत्येक स्प्लिसिंग घटना के लिए पीएसआई मूल्यों को प्लॉट करें।घटना प्रकार निर्दिष्ट करके एक ज्वालामुखी प्लॉट उत्पन्न करें। RMATs2sashimiplot पैकेज का उपयोग करके Sashimi प्लॉट उत्पन्न करने के लिए पाठ फ़ाइलों के रूप में RMATS के साथ प्राप्त स्प्लिसिंग ईवेंट परिणामों का उपयोग करें। साशिमी प्लॉट में डब्ल्यूएनके 1 जीन में एक स्किप एक्सॉन घटना दिखाई गई है।प्रत्येक पंक्ति एक आरएनए-सेक नमूने का प्रतिनिधित्व करती है, जंगली प्रकार और एमबीएनएल 1 नॉकआउट की तीन प्रतिकृतियां। ऊंचाई आरपीकेएम में रीड कवरेज दिखाती है और कनेक्टिंग आर्क एक्सॉन में जंक्शन को दर्शाते हैं। निचला हिस्सा एनोटेटेड जीन मॉडल वैकल्पिक आइसोफॉर्म दिखाता है।डिफस्प्लिस और डेक्ससेक का उपयोग करके प्राप्त ज्वालामुखी भूखंडों के शीर्ष बाएं या दाएं चतुर्थांश में स्थित जीन में एक पर्याप्त गुना परिवर्तन और वास्तविक अंतर के मजबूत सांख्यिकीय प्रमाण देखे जा सकते हैं। एक कैसेट एक्सॉन जीन WNK1 के लिए विभिन्न स्थितियों के बीच भिन्न पाया गया था। डिफरेंशियल एक्सॉन उपयोग प्लॉट ने डब्ल्यूएनके 1.6.45 के पास पांच एक्सॉन साइटों पर अंतर स्प्लिसिंग के सबूत दिखाए, जिसमें गुलाबी रंग में हाइलाइट किए गए एक्सॉन को जंगली प्रकार की तुलना में एमबीएनएल 1 नॉकआउट नमूनों में विभाजित किए जाने की संभावना थी।जीन के ज्वालामुखी प्लॉट जो वैकल्पिक रूप से विभाजित होते हैं, ने उन जीनों के बीच अंतर करने में मदद की जिन्हें जंगली प्रकार से बाहर रखा गया था और जो जंगली प्रकार में शामिल थे। स्प्लिसिंग घटनाओं के प्रकार एसई, ए 5 एसएस, ए 3 एसएस, एमएक्सई, और आरआई को उन घटनाओं के शीर्ष महत्वपूर्ण जीनों के साशिमी भूखंडों का उपयोग करके कल्पना की गई थी। ज्वालामुखी भूखंडों का उपयोग करके जीन के तीन प्रमुख अअनुवादित क्षेत्रों में अंतर एपीए गतिविधि देखी गई थी।विभिन्न पाइपलाइनों से प्राप्त महत्वपूर्ण-अंतर पीए साइट उपयोग परिणामों को इवेंट प्लॉट का उपयोग करके देखा गया था। डबल नॉकआउट में पीए साइट के उपयोग के समीपस्थ बदलाव के लिए एक महत्वपूर्ण डिस्टल एफओएसएल 1 और पपोला दोनों जीनों में देखा जा सकता है। जीनोम-वाइड स्तर पर ज्ञात पीए दरार साइटों पर लंगर डालने वाले क्षेत्रों में औसत कवरेज एक नैदानिक भूखंड का उपयोग करके निर्धारित किया गया था।सुनिश्चित करें कि गणना मैट्रिक्स उत्पन्न करते समय ट्रांसस्पेसिफिक जानकारी जैसे पैरामीटर और मल्टी ओवरलैप का सही उपयोग किया जाता है। रैखिक मॉडल फिटिंग और कंट्रास्ट जोड़े उत्पन्न करना उचित तुलना के लिए महत्वपूर्ण है। RMATS के लिए, सुनिश्चित करें कि कमांड चलाने से पहले सभी पैरामीटर आपके डेटा के अनुसार सही ढंग से सेट किए गए हैं।विभेदक स्प्लिसिंग गतिविधि से प्राप्त जीन का उपयोग जीन सेट संवर्धन विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है। एमआईएसओ नामक एक अन्य उपकरण का उपयोग आगे की घटना-आधारित विश्लेषण के लिए किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Biology

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

थ्रोम्बिन इलाज में आरएनए - seq Transcriptomes का विश्लेषण और नियंत्रण मानव फेफड़े Microvascular endothelial कोशिकाओं

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

मच्छर आंत Metagenomic आरएनए - seq के लिए ribosomal शाही सेना की कमी

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

मानव pluripotent के लिए वैकल्पिक संस्कृतियों सेल उत्पादन, रखरखाव, और जेनेटिक विश्लेषण स्टेम

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

उपकला-Mesenchymal संक्रमण के दौरान वैकल्पिक Splicing की जांच

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

एशियाई टाइगर मच्छर में Photoperiodic diapause की शाही सेना seq के विश्लेषण के लिए एक प्रयोगात्मक और जैव सूचना विज्ञान प्रोटोकॉल,<em&gt; एडीज albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

में रासायनिक आनुवंशिक बातचीत की तेजी से पहचान<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Methods to Discover Alternative Promoter Usage and Transcriptional Regulation of Murine Bcrp1

तरीके वैकल्पिक प्रमोटर उपयोग और murine Bcrp1 की Transcriptional नियमन डिस्कवर के लिए

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually ...

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

हेलिएथस एन्युस में बड़े पैमाने पर थर्मल इमेजिंग स्क्रीनिंग द्वारा पौधों के वाष्पीकरण के उपन्यास नियामकों की पहचान

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq

आरएनए-एसईक्यू का उपयोग करके आणविक विकास और जीन अभिव्यक्ति की जांच के लिए एक बायोइन्फॉर्मेटिक्स पाइपलाइन

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus ...