Name: identification of alternative splicing and polyadenylation in rna-seq data
Uploaded: 2021-06-24T13:00:00
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Questo studio è stato supportato da una Future Fellowship dell'Australian Research Council (ARC) (FT16010043) e da ANU Futures Scheme.

1. Installazione di strumenti e pacchetti R utilizzati nell'analisi
<ol><li>Conda è un gestore di pacchetti popolare e flessibile che consente una comoda installazione dei pacchetti con le loro dipendenze su tutte le piattaforme. Utilizzare 'Anaconda' (conda package manager) per installare 'conda' che può essere utilizzato per installare gli strumenti/pacchetti necessari per l'analisi.</li>
	<li>Scarica 'Anaconda' secondo i requisiti di sistema da https://www.anaconda.com/products/individual#Downloads ...

<ol>
	<li>Katz, Y., Wang, E. T., Airoldi, E. M., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+design+of+RNA+sequencing+experiments+for+identifying+isoform+regulation.">Analysis and design of RNA sequencing experiments for identifying isoform regulation.</a> Nature Methods. 7 (12), 1009-1015 (2010).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+alternative+splicing+and+its+regulation.">Mechanism of alternative splicing and its regulation.</a> Biomedical Reports. 3 (2), 152-158 (2015).</li><li>Mehmood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+differential+splicing+tools+for+RNA-seq+studies.">Systematic evaluation of differential splicing tools for RNA-seq studies.</a> Briefings in Bioinformatics. 21 (6), 2052-2065 (2020).</li><li>Movassat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+between+alternative+polyadenylation+and+alternative+splicing+is+limited+to+terminal+introns.">Coupling between alternative polyadenylation and alternative splicing is limited to terminal introns.</a> RNA Biology. 13 (7), 646-655 (2016).</li><li>Tian, B., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+polyadenylation+of+mRNA+precursors.">Alternative polyadenylation of mRNA precursors.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (1), 18-30 (2017).</li><li>Herrmann, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PolyASite+2.0:+a+consolidated+atlas+of+polyadenylation+sites+from+3'+end+sequencing.">PolyASite 2.0: a consolidated atlas of polyadenylation sites from 3' end sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 48 (1), 174-179 (2020).</li><li>Liu, R., Loraine, A. E., Dickerson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparisons+of+computational+methods+for+differential+alternative+splicing+detection+using+RNA-seq+in+plant+systems.">Comparisons of computational methods for differential alternative splicing detection using RNA-seq in plant systems.</a> BMC Bioinformatics. 15 (1), 364 (2014).</li><li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis.">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biology. 17 (1), 13 (2016).</li><li>Anders, S., Reyes, A., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+differential+usage+of+exons+from+RNA-seq+data.">Detecting differential usage of exons from RNA-seq data.</a> Genome Research. 22 (10), 2008-2017 (2012).</li><li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies.">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), 47 (2014).</li><li>Shen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rMATS:+Robust+and+flexible+detection+of+differential+alternative+splicing+from+replicate+RNA-Seq+data.">rMATS: Robust and flexible detection of differential alternative splicing from replicate RNA-Seq data.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (51), 5593-5601 (2014).</li><li>Mehmood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+differential+splicing+tools+for+RNA-seq+studies.">Systematic evaluation of differential splicing tools for RNA-seq studies.</a> Briefings in bioinformatics. 21 (6), 2052-2065 (2020).</li><li>Kanitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+assessment+of+methods+for+the+computational+inference+of+transcript+isoform+abundance+from+RNA-seq+data.">Comparative assessment of methods for the computational inference of transcript isoform abundance from RNA-seq data.</a> Genome biology. 16 (1), 1-26 (2015).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Sznajder, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+MBNL1+induces+RNA+misprocessing+in+the+thymus+and+peripheral+blood.">Loss of MBNL1 induces RNA misprocessing in the thymus and peripheral blood.</a> Nature Communications. 11, 1-11 (2020).</li><li>Batra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+MBNL+leads+to+disruption+of+developmentally+regulated+alternative+polyadenylation+in+RNA-mediated+disease.">Loss of MBNL leads to disruption of developmentally regulated alternative polyadenylation in RNA-mediated disease.</a> Molecular Cell. 56 (2), 311-322 (2014).</li><li>Leinonen, R., Sugawara, H., Shumway, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sequence+read+archive.">The sequence read archive.</a> Nucleic acids research. 39, 19-21 (2010).</li><li>Tange, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> GNU parallel-the command-line power tool. 36, 42-47 (2011).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAR:+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner.">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li><li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=edgeR:+a+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data.">edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).</li><li>Robinson, M. D., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scaling+normalization+method+for+differential+expression+analysis+of+RNA-seq+data.">A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data.</a> Genome Biology. 11 (3), 25 (2010).</li><li>Veiga, D. F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=maser:+Mapping+Alternative+Splicing+Events+to+pRoteins.">maser: Mapping Alternative Splicing Events to pRoteins.</a> R package version 1.4.0. , (2019).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10 (13), 25 (2009).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Ram&#237;rez, F., D&#252;ndar, F., Diehl, S., Gr&#252;ning, B. A., Manke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=deepTools:+a+flexible+platform+for+exploring+deep-sequencing+data.">deepTools: a flexible platform for exploring deep-sequencing data.</a> Nucleic acids research. 42 (1), 187-191 (2014).</li><li>Merino, G. A., Conesa, A., Fern&#225;ndez, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+benchmarking+of+workflows+for+detecting+differential+splicing+and+differential+expression+at+isoform+level+in+human+RNA-seq+studies.">A benchmarking of workflows for detecting differential splicing and differential expression at isoform level in human RNA-seq studies.</a> Briefings in bioinformatics. 20 (2), 471-481 (2019).</li><li>Chhangawala, S., Rudy, G., Mason, C. E., Rosenfeld, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+read+length+on+quantification+of+differentially+expressed+genes+and+splice+junction+detection.">The impact of read length on quantification of differentially expressed genes and splice junction detection.</a> Genome biology. 16 (1), 1-10 (2015).</li><li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis.">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biol. 17, 13 (2016).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks.">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat Protoc. 7 (3), 562-578 (2012).</li><li>Li, B., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RSEM:+accurate+transcript+quantification+from+RNA-Seq+data+with+or+without+a+reference+genome.">RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome.</a> BMC Bioinformatics. 12, 323 (2011).</li><li>Bray, N. L., Pimentel, H., Melsted, P., Pachter, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-optimal+probabilistic+RNA-seq+quantification.">Near-optimal probabilistic RNA-seq quantification.</a> Nat Biotechnol. 34 (5), 525-527 (2016).</li></ol>

In questo studio, abbiamo valutato approcci basati su esoni e basati su eventi per rilevare AS e APA in massa RNA-Seq e 3' dati di sequenziamento finale. Gli approcci AS basati sugli esoni producono sia un elenco di esoni differenzialmente espressi sia una classificazione a livello genico ordinata in base alla significatività statistica dell'attività complessiva di splicing differenziale a livello genetico (Tabelle 1-2, 4-5). Per il pacchetto diffSplice, l'uso differenziale è determinato adattando mod...

L'RNA-seq è stato ampiamente utilizzato nel corso degli anni, tipicamente per stimare l'espressione genica differenziale e la scopertagenica 1. Inoltre, può anche essere utilizzato per stimare l'uso variabile del livello di esone a causa del gene che esprime diverse isoforme, contribuendo così a una migliore comprensione della regolazione genica a livello post-trascrizionale. La maggior parte dei geni eucariotici genera diverse isoforme mediante splicing alternativo (AS) per aumentare la diversità dell'espressione dell'mRNA. Gli eventi AS possono essere suddivisi in diversi modelli: salto di esoni completi (SE) in cui un esone ("cassetta") viene completamente rimosso dalla trascrizione insieme ai suoi introni laterali; selezione alternativa (donatore) del sito di giunzione 5' (A5SS) e selezione alternativa del sito di giunzione 3' (accettore) (A3SS) quando due o più siti di giunzione sono presenti su entrambe le estremità di un esone; ritenzione degli introni (RI) quando un introne viene trattenuto all'interno del trascritto dell'mRNA maturo e mutua esclusione dell'uso dell'esone (MXE) in cui solo uno dei due esoni disponibili può essere trattenuto alla volta 2,3. La poliadenilazione alternativa (APA) svolge anche un ruolo importante nella regolazione dell'espressione genica utilizzando siti di poli alternativi (A) per generare più isoforme di mRNA da una singola trascrizione4. La maggior parte dei siti di poliadenilazione (pAs) si trovano nella regione 3' non tradotta (3' UTR), generando isoforme di mRNA con diverse lunghezze UTR 3'. Poiché l'UTR 3' è l'hub centrale per il riconoscimento degli elementi regolatori, diverse lunghezze UTR 3' possono influenzare la localizzazione, la stabilità e la traduzione dell'mRNA5. Esistono saggi di sequenziamento finale di classe 3' ottimizzati per rilevare APA che differiscono nei dettagli del protocollo6. La pipeline qui descritta è progettata per PolyA-seq, ma può essere adattata per altri protocolli come descritto.
In questo studio, presentiamo una pipeline di metodi di analisi differenziale degli esoni7,8 (Figura 1), che possono essere suddivisi in due grandi categorie: basati sull'esone (DEXSeq9, diffSplice 10) e basati sugli eventi (replicate Multivariate Analysis of Transcript Splicing (rMATS)11). I metodi basati sull'esone confrontano il cambiamento di piega tra le condizioni dei singoli esoni, contro una misura del cambiamento complessivo della piega genica per chiamare l'uso differenziale dell'esone, e da ciò calcolare una misura a livello genetico dell'attività AS. I metodi basati su eventi utilizzano letture di giunzione esone-introne per rilevare e classificare eventi di splicing specifici come il salto dell'esone o la ritenzione di introni e distinguere questi tipi di AS nell'output3. Pertanto, questi metodi forniscono punti di vista complementari per un'analisi completa di AS12,13. Abbiamo selezionato DEXSeq (basato sul pacchetto DESeq214 DGE) e diffSplice (basato sul pacchetto Limma10 DGE) per lo studio in quanto sono tra i pacchetti più utilizzati per l'analisi di splicing differenziale. rMATS è stato scelto come metodo popolare per l'analisi basata sugli eventi. Un altro metodo popolare basato su eventi è MISO (Mixture of Isoforms)1. Per l'APA adattiamo l'approccio basato sull'esone.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62636/62636fig01.jpg"> Figura 1. Pipeline di analisi. Diagramma di flusso dei passaggi utilizzati nell'analisi. I passaggi includono: ottenere i dati, eseguire controlli di qualità e allineamento delle letture seguito dal conteggio delle letture utilizzando annotazioni per esoni, introni e siti pA noti, filtraggio per rimuovere conteggi bassi e normalizzazione. I dati di PolyA-seq sono stati analizzati per siti pA alternativi utilizzando metodi diffSplice/DEXSeq, RNA-Seq di massa sono stati analizzati per lo splicing alternativo a livello di esone con metodi diffSplice/DEXseq e gli eventi AS analizzati con rMATS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62636/62636fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
I dati RNA-seq utilizzati in questa indagine sono stati acquisiti da Gene Expression Omnibus (GEO) (GSE138691)15. Abbiamo utilizzato i dati RNA-seq di topo di questo studio con due gruppi di condizioni: wild-type (WT) e Muscleblind-like type 1 knockout (Mbnl1 KO) con tre repliche ciascuno. Per dimostrare l'analisi differenziale dell'utilizzo del sito di poliadenilazione, abbiamo ottenuto dati PolyA-seq di fibroblasti embrionali di topo (MEF) (GEO Accession GSE60487)16. I dati hanno quattro gruppi di condizioni: Wild-type (WT), Muscleblind-like type1/type 2 double knockout (Mbnl1/2 DKO), Mbnl 1/2 DKO con Mbnl3 knockdown (KD) e Mbnl1/2 DKO con controllo Mbnl3 (Ctrl). Ogni gruppo di condizioni è costituito da due repliche.
<table border="1" fo:font-size="5px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Adesione GEO</td>
			<td>Numero di esecuzione SRA</td>
			<td>Nome del campione</td>
			<td>Condizione</td>
			<td>Replicare</td>
			<td>Fazzoletto</td>
			<td>Sequenziamento</td>
			<td>Lunghezza di lettura</td>
		</tr><tr><td rowspan="6">RNA-Seq</td>
			<td>GSM4116218</td>
			<td>SRR10261601</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_1</td>
			<td>Mbnl1 knockout</td>
			<td>Rappresentante 1</td>
			<td>Timo</td>
			<td>Estremità accoppiata</td>
			<td>100 pb</td>
		</tr><tr><td>GSM4116219</td>
			<td>SRR10261602</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_2</td>
			<td>Mbnl1 knockout</td>
			<td>Rappresentante 2</td>
			<td>Timo</td>
			<td>Estremità accoppiata</td>
			<td>100 pb</td>
		</tr><tr><td>GSM4116220</td>
			<td>SRR10261603</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_3</td>
			<td>Mbnl1 knockout</td>
			<td>Rappresentante 3</td>
			<td>Timo</td>
			<td>Estremità accoppiata</td>
			<td>100 pb</td>
		</tr><tr><td>GSM4116221</td>
			<td>SRR10261604</td>
			<td>WT_Thymus_1</td>
			<td>Tipo selvaggio</td>
			<td>Rappresentante 1</td>
			<td>Timo</td>
			<td>Estremità accoppiata</td>
			<td>100 pb</td>
		</tr><tr><td>GSM4116222</td>
			<td>SRR10261605</td>
			<td>WT_Thymus_2</td>
			<td>Tipo selvaggio</td>
			<td>Rappresentante 2</td>
			<td>Timo</td>
			<td>Estremità accoppiata</td>
			<td>100 pb</td>
		</tr><tr><td>GSM4116223</td>
			<td>SRR10261606</td>
			<td>WT_Thymus_3</td>
			<td>Tipo selvaggio</td>
			<td>Rappresentante 3</td>
			<td>Timo</td>
			<td>Estremità accoppiata</td>
			<td>100 pb</td>
		</tr><tr><td rowspan="8">3P-Seq</td>
			<td>GSM1480973</td>
			<td>SRR1553129</td>
			<td>WT_1</td>
			<td>Tipo selvatico (WT)</td>
			<td>Rappresentante 1</td>
			<td>Fibroblasti embrionali di topo (MEF)</td>
			<td>Estremità singola</td>
			<td>40 pb</td>
		</tr><tr><td>GSM1480974</td>
			<td>SRR1553130</td>
			<td>WT_2</td>
			<td>Tipo selvatico (WT)</td>
			<td>Rappresentante 2</td>
			<td>Fibroblasti embrionali di topo (MEF)</td>
			<td>Estremità singola</td>
			<td>40 pb</td>
		</tr><tr><td>GSM1480975</td>
			<td>SRR1553131</td>
			<td>DKO_1</td>
			<td>Mbnl 1/2 doppio knockout (DKO)</td>
			<td>Rappresentante 1</td>
			<td>Fibroblasti embrionali di topo (MEF)</td>
			<td>Estremità singola</td>
			<td>40 pb</td>
		</tr><tr><td>GSM1480976</td>
			<td>SRR1553132</td>
			<td>DKO_2</td>
			<td>Mbnl 1/2 doppio knockout (DKO)</td>
			<td>Rappresentante 2</td>
			<td>Fibroblasti embrionali di topo (MEF)</td>
			<td>Estremità singola</td>
			<td>40 pb</td>
		</tr><tr><td>GSM1480977</td>
			<td>SRR1553133</td>
			<td>DKOsiRNA_1</td>
			<td>Mbnl 1/2 doppio knockout con Mbnl 3 siRNA (KD)</td>
			<td>Rappresentante 1</td>
			<td>Fibroblasti embrionali di topo (MEF)</td>
			<td>Estremità singola</td>
			<td>40 pb</td>
		</tr><tr><td>GSM1480978</td>
			<td>SRR1553134</td>
			<td>DKOsiRNA_2</td>
			<td>Mbnl 1/2 doppio knockout con Mbnl 3 siRNA (KD)</td>
			<td>Rappresentante 2</td>
			<td>Fibroblasti embrionali di topo (MEF)</td>
			<td>Estremità singola</td>
			<td>36 pb</td>
		</tr><tr><td>GSM1480979</td>
			<td>SRR1553135</td>
			<td>DKONTsiRNA_1</td>
			<td>Mbnl 1/2 doppio knockout con siRNA non mirato (Ctrl)</td>
			<td>Rappresentante 1</td>
			<td>Fibroblasti embrionali di topo (MEF)</td>
			<td>Estremità singola</td>
			<td>40 pb</td>
		</tr><tr><td>GSM1480980</td>
			<td>SRR1553136</td>
			<td>DKONTsiRNA_2</td>
			<td>Mbnl 1/2 doppio knockout con siRNA non mirato (Ctrl)</td>
			<td>Rappresentante 2</td>
			<td>Fibroblasti embrionali di topo (MEF)</td>
			<td>Estremità singola</td>
			<td>40 pb</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1. Riepilogo dei set di dati RNA-Seq e PolyA-seq utilizzati per l'analisi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Not relevent for computational study</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of alternative splicing and polyadenylation in rna-seq data

Oltre all'analisi tipica dell'RNA-Seq per misurare l'espressione genica differenziale (DGE) in condizioni sperimentali/biologiche, i dati di RNA-seq possono anche essere utilizzati per esplorare altri complessi meccanismi regolatori a livello di esone. Lo splicing alternativo e la poliadenilazione svolgono un ruolo cruciale nella diversità funzionale di un gene generando diverse isoforme per regolare l'espressione genica a livello post-trascrizionale e limitando le analisi all'intero livello genico può mancare questo importante strato regolatore. Qui, dimostriamo analisi dettagliate passo dopo passo per l'identificazione e la visualizzazione dell'utilizzo differenziale del sito di esone e poliadenilazione in tutte le condizioni, utilizzando Bioconductor e altri pacchetti e funzioni, tra cui DEXSeq, diffSplice dal pacchetto Limma e rMATS.

Dopo aver eseguito il flusso di lavoro dettagliato di cui sopra, i risultati dell'analisi AS e APA e i risultati rappresentativi sono sotto forma di tabelle e grafici di dati, generati come segue.
COME: Il principale risultato dell'analisi AS (Tabella supplementare 1 per diffSplice; La tabella 2 per DEXSeq) è un elenco di esoni che mostrano un uso differenziale tra le condizioni e un elenco di geni che mostrano una significativa attività ...

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Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data

Lo splicing alternativo (AS) e la poliadenilazione alternativa (APA) espandono la diversità delle isoforme di trascrizione e dei loro prodotti. Qui, descriviamo i protocolli bioinformatici per analizzare i saggi di sequenziamento di massa dell'RNA-seq e 3' per rilevare e visualizzare AS e APA che variano in base alle condizioni sperimentali.

Identificazione di splicing alternativo e poliadenilazione in dati di RNA-seq

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also ...

Questo protocollo fornisce una comprensione completa delle isoforme geniche generate dallo splicing alternativo e dalla poliadenilazione fornendo un flusso di lavoro passo-passo per identificare i siti di splicing differenziale, gli esoni differenzialmente espressi e i siti poli(A). Il vantaggio principale di questo protocollo è che valuta sia i metodi basati sugli esoni che quelli basati sugli eventi per lo studio dello splicing alternativo. Applica anche il metodo basato sull'esone per studiare la poliadenilazione alternativa.Sono stati forniti i file R Markdown che includono i codici e le note per l'analisi AS e AP. Sarebbe consigliabile seguire i passaggi nel file R Markdown e raggiungere attentamente la nota per ogni passaggio. Per identificare lo splicing differenziale usando diffSplice da limma, seguire il file R notebook.Preparare i file di input come descritto nel testo manuscritto. Assicurati che i passaggi da uno a tre del manoscritto siano stati seguiti in sequenza per preparare i file di input prima di procedere ulteriormente. Inizia caricando le librerie necessarie.Per eseguire il filtraggio non specifico, estrarre innanzitutto la matrice dei conteggi di lettura ottenuti in precedenza e creare un elenco di funzionalità utilizzando la funzione DGEList dal pacchetto edgeR, dove le righe rappresentano i geni e le colonne rappresentano i campioni. Quindi, trasforma i dati da scala grezza a conteggi per milione usando la funzione CPM dal pacchetto edgeR e mantieni gli esoni con conteggi superiori a una soglia impostabile. Questo set di dati contiene sei esempi.Pertanto, il CPM è fissato a più di uno e almeno tre campioni su sei. Normalizzare i conteggi tra i campioni con la funzione calcNormFactors dal pacchetto edgeR utilizzando i valori Trimmed Mean of M. Questa funzione calcolerà i fattori di ridimensionamento per regolare le dimensioni della libreria.Utilizzare la tabella di esempio generata in precedenza per creare la matrice di progettazione per definire le condizioni sperimentali per ogni campione. Eseguire la funzione voom del pacchetto limma per elaborare i dati di sequenziamento dell'RNA per stimare la varianza. Questa funzione genererà pesi di precisione per correggere il rumore del conteggio di Poisson e trasformare i conteggi del livello di esone in registrare due conteggi per milione o logCPM.Eseguire la funzione lmfit per adattare i modelli lineari ai dati di espressione per ogni esone. Quindi eseguire la funzione eBayes per calcolare statistiche empiriche per il modello adattato per rilevare l'espressione differenziale dell'esone. Definire una matrice di contrasto per i confronti sperimentali di interesse.Usa i contrasti. Funzione fit per ottenere coefficienti ed errori standard per ogni coppia di confronti. Eseguire diffSplice sul modello adattato per testare le differenze nell'uso dell'esone dei geni tra wild type e knockout.Esplora i risultati migliori usando la funzione topSplice dove un test uguale a t fornisce una classificazione degli esoni AS e il test uguale a simes fornisce una classificazione dei geni. Eseguire la funzione plotSplice per tracciare i risultati. Nel mettere il gene di interesse nell'argomento dell'ID genico, i punti rossi mostrano gli esoni differenzialmente espressi.Genera un grafico vulcanico utilizzando il pacchetto di bioconduttori EnhancedVolcano per mostrare gli esoni espressi in modo differenziale. Per utilizzare rMATS, assicurarsi che la versione più recente di rMATS versione 4.1.1 sia installata utilizzando conda o GitHub nella directory di lavoro. Passare alla cartella contenente i file bam ottenuti dopo la mappatura.Preparare i file di testo come richiesto da rMATS per le due condizioni di copia del nome dei file bam e del loro percorso separati da una virgola. Eseguire rmas. py utilizzando i due file di testo di input generati che descrivono il percorso dei file BAM e l'annotazione.GTF ottenuto in precedenza. In questo modo viene generata una cartella di output contenente rmats_out file di testo che descrivono separatamente le statistiche, inclusi i valori P e i livelli di inclusione per ciascun evento di giunzione. Utilizzare il maser del pacchetto bioconduttore per esplorare i risultati di rMATS.Caricare i file di testo con estensione JCEC nell'oggetto maser e includere almeno cinque letture medie per evento di giunzione per filtrare il risultato in base alla copertura. Per visualizzare i risultati di rMATS, eseguire innanzitutto la funzione topEvents dal pacchetto maser, selezionando gli eventi di giunzione significativi con una frequenza di falsa individuazione del 10% e una variazione minima del 10% della percentuale di giunzione in o PSI. Controllare gli eventi genetici per i singoli geni di interesse e tracciare i valori PSI per ogni evento di splicing di quel gene.Generare un grafico a vulcano specificando il tipo di evento. Utilizzare i risultati degli eventi di giunzione ottenuti con rMATS sotto forma di file di testo per generare grafici di sashimi utilizzando il pacchetto rmats2sashimiplot. Il grafico del sashimi mostra un evento di esone saltato nel gene Wnk1.Ogni riga rappresenta un campione di RNA-seq, tre repliche di wild type e Mbnl1 knockout. L'altezza mostra la copertura di lettura in RPKM e gli archi di collegamento raffigurano le letture di giunzione attraverso gli esoni. La parte inferiore mostra isoforme alternative annotate del modello genetico.Un sostanziale cambiamento di piega e una forte evidenza statistica di differenze reali possono essere osservati nei geni situati nei quadranti in alto a sinistra o a destra dei grafici vulcanici ottenuti utilizzando diffSplice e DEXSeq. Si è scoperto che un esone a cassetta varia tra le diverse condizioni per il gene Wnk1. Il grafico di utilizzo differenziale dell'esone ha mostrato prove di splicing differenziale in cinque siti di esoni vicino a Wnk1.6.45, con gli esoni evidenziati in rosa che probabilmente saranno giuntati nei campioni knockout Mbnl1 rispetto al wild type.La trama vulcanica di geni che sono alternativamente giuntati ha aiutato a distinguere tra i geni che sono stati esclusi dal wild type e quelli che sono stati inclusi nel wild type. I tipi di eventi di splicing SE, A5SS, A3SS, MXE e RI sono stati visualizzati utilizzando grafici di sashimi dei principali geni significativi di tali eventi. L'attività differenziale dell'APA in tre regioni primarie non tradotte di geni è stata osservata utilizzando grafici vulcanici.I risultati di utilizzo del sito PA significativamente differenziati acquisiti da diverse pipeline sono stati visualizzati utilizzando il grafico degli eventi. Un significativo spostamento da distale a prossimale dell'uso del sito PA in doppi knockout può essere osservato in entrambi i geni FOSL1 e Papola. La copertura media nelle regioni fiancheggianti ancorate a siti di scissione PA noti a livello dell'intero genoma è stata determinata utilizzando un grafico diagnostico.Assicurarsi che i parametri come le informazioni transspecifiche e consentire la sovrapposizione multipla siano utilizzati correttamente durante la generazione delle metriche di conteggio. L'adattamento del modello lineare e la generazione di coppie di contrasto è importante per un corretto confronto. Per rMATS, assicurarsi che tutti i parametri siano impostati correttamente in base ai dati prima di eseguire il comando.I geni ottenuti dall'attività di splicing differenziale potrebbero essere utilizzati per eseguire analisi di arricchimento del set genico. Un altro strumento chiamato MISO potrebbe essere utilizzato per ulteriori analisi basate sugli eventi.

Research

JoVE Journal

Biology

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Ricerca

Biologia

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