Name: identification of alternative splicing and polyadenylation in rna-seq data
Uploaded: 2021-06-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data at JoVE.com

Este estudo foi apoiado por um Conselho Australiano de Pesquisa (ARC) Future Fellowship (FT16010043) e ANU Futures Scheme.

1. Instalação de ferramentas e pacotes R utilizados na análise
<ol><li>Conda é um gerenciador de pacotes popular e flexível que permite a instalação conveniente de pacotes com suas dependências em todas as plataformas. Use 'Anaconda' (gerenciador de pacotes conda) para instalar 'conda', que pode ser usado para instalar as ferramentas/pacotes necessários para a análise.</li>
	<li>Baixe 'Anaconda' de acordo com os requisitos do sistema de https://www.anaconda.com/products/individual#Downloads e i...

<ol>
	<li>Katz, Y., Wang, E. T., Airoldi, E. M., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+design+of+RNA+sequencing+experiments+for+identifying+isoform+regulation.">Analysis and design of RNA sequencing experiments for identifying isoform regulation.</a> Nature Methods. 7 (12), 1009-1015 (2010).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+alternative+splicing+and+its+regulation.">Mechanism of alternative splicing and its regulation.</a> Biomedical Reports. 3 (2), 152-158 (2015).</li><li>Mehmood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+differential+splicing+tools+for+RNA-seq+studies.">Systematic evaluation of differential splicing tools for RNA-seq studies.</a> Briefings in Bioinformatics. 21 (6), 2052-2065 (2020).</li><li>Movassat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+between+alternative+polyadenylation+and+alternative+splicing+is+limited+to+terminal+introns.">Coupling between alternative polyadenylation and alternative splicing is limited to terminal introns.</a> RNA Biology. 13 (7), 646-655 (2016).</li><li>Tian, B., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+polyadenylation+of+mRNA+precursors.">Alternative polyadenylation of mRNA precursors.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (1), 18-30 (2017).</li><li>Herrmann, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PolyASite+2.0:+a+consolidated+atlas+of+polyadenylation+sites+from+3'+end+sequencing.">PolyASite 2.0: a consolidated atlas of polyadenylation sites from 3' end sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 48 (1), 174-179 (2020).</li><li>Liu, R., Loraine, A. E., Dickerson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparisons+of+computational+methods+for+differential+alternative+splicing+detection+using+RNA-seq+in+plant+systems.">Comparisons of computational methods for differential alternative splicing detection using RNA-seq in plant systems.</a> BMC Bioinformatics. 15 (1), 364 (2014).</li><li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis.">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biology. 17 (1), 13 (2016).</li><li>Anders, S., Reyes, A., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+differential+usage+of+exons+from+RNA-seq+data.">Detecting differential usage of exons from RNA-seq data.</a> Genome Research. 22 (10), 2008-2017 (2012).</li><li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies.">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), 47 (2014).</li><li>Shen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rMATS:+Robust+and+flexible+detection+of+differential+alternative+splicing+from+replicate+RNA-Seq+data.">rMATS: Robust and flexible detection of differential alternative splicing from replicate RNA-Seq data.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (51), 5593-5601 (2014).</li><li>Mehmood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+differential+splicing+tools+for+RNA-seq+studies.">Systematic evaluation of differential splicing tools for RNA-seq studies.</a> Briefings in bioinformatics. 21 (6), 2052-2065 (2020).</li><li>Kanitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+assessment+of+methods+for+the+computational+inference+of+transcript+isoform+abundance+from+RNA-seq+data.">Comparative assessment of methods for the computational inference of transcript isoform abundance from RNA-seq data.</a> Genome biology. 16 (1), 1-26 (2015).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Sznajder, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+MBNL1+induces+RNA+misprocessing+in+the+thymus+and+peripheral+blood.">Loss of MBNL1 induces RNA misprocessing in the thymus and peripheral blood.</a> Nature Communications. 11, 1-11 (2020).</li><li>Batra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+MBNL+leads+to+disruption+of+developmentally+regulated+alternative+polyadenylation+in+RNA-mediated+disease.">Loss of MBNL leads to disruption of developmentally regulated alternative polyadenylation in RNA-mediated disease.</a> Molecular Cell. 56 (2), 311-322 (2014).</li><li>Leinonen, R., Sugawara, H., Shumway, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sequence+read+archive.">The sequence read archive.</a> Nucleic acids research. 39, 19-21 (2010).</li><li>Tange, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> GNU parallel-the command-line power tool. 36, 42-47 (2011).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAR:+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner.">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li><li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=edgeR:+a+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data.">edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).</li><li>Robinson, M. D., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scaling+normalization+method+for+differential+expression+analysis+of+RNA-seq+data.">A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data.</a> Genome Biology. 11 (3), 25 (2010).</li><li>Veiga, D. F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=maser:+Mapping+Alternative+Splicing+Events+to+pRoteins.">maser: Mapping Alternative Splicing Events to pRoteins.</a> R package version 1.4.0. , (2019).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10 (13), 25 (2009).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Ram&#237;rez, F., D&#252;ndar, F., Diehl, S., Gr&#252;ning, B. A., Manke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=deepTools:+a+flexible+platform+for+exploring+deep-sequencing+data.">deepTools: a flexible platform for exploring deep-sequencing data.</a> Nucleic acids research. 42 (1), 187-191 (2014).</li><li>Merino, G. A., Conesa, A., Fern&#225;ndez, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+benchmarking+of+workflows+for+detecting+differential+splicing+and+differential+expression+at+isoform+level+in+human+RNA-seq+studies.">A benchmarking of workflows for detecting differential splicing and differential expression at isoform level in human RNA-seq studies.</a> Briefings in bioinformatics. 20 (2), 471-481 (2019).</li><li>Chhangawala, S., Rudy, G., Mason, C. E., Rosenfeld, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+read+length+on+quantification+of+differentially+expressed+genes+and+splice+junction+detection.">The impact of read length on quantification of differentially expressed genes and splice junction detection.</a> Genome biology. 16 (1), 1-10 (2015).</li><li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis.">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biol. 17, 13 (2016).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks.">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat Protoc. 7 (3), 562-578 (2012).</li><li>Li, B., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RSEM:+accurate+transcript+quantification+from+RNA-Seq+data+with+or+without+a+reference+genome.">RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome.</a> BMC Bioinformatics. 12, 323 (2011).</li><li>Bray, N. L., Pimentel, H., Melsted, P., Pachter, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-optimal+probabilistic+RNA-seq+quantification.">Near-optimal probabilistic RNA-seq quantification.</a> Nat Biotechnol. 34 (5), 525-527 (2016).</li></ol>

Neste estudo, avaliamos abordagens baseadas em éxons e eventos para detectar EA e APA em dados de RNA-Seq e sequenciamento final de 3'. As abordagens AS baseadas em éxons produzem uma lista de éxons diferencialmente expressos e uma classificação em nível de gene ordenada pela significância estatística da atividade de splicing diferencial geral em nível de gene (Tabelas 1-2, 4-5). Para o pacote diffSplice, o uso diferencial é determinado pelo ajuste de modelos lineares ponderados em um nível de...

O RNA-seq tem sido amplamente utilizado ao longo dos anos, tipicamente para estimar a expressão gênica diferencial e a descoberta de genes1. Além disso, também pode ser utilizado para estimar o uso variável do nível de éxons devido ao gene que expressa diferentes isoformas, contribuindo assim para uma melhor compreensão da regulação gênica no nível pós-transcricional. A maioria dos genes eucarióticos gera diferentes isoformas por splicing alternativo (AS) para aumentar a diversidade de expressão de mRNA. Os eventos AS podem ser divididos em diferentes padrões: pulando éxons completos (SE), onde um éxon ("") é completamente removido da transcrição junto com seus íntrons flanqueadores; seleção alternativa (doador) de local de emenda de 5' (A5SS) e seleção de local de emenda alternativa de 3' (aceitador) (A3SS) quando dois ou mais locais de emenda estiverem presentes em cada extremidade de um éxon; retenção de íntrons (IR) quando um íntron é retido dentro do transcrito de mRNA maduro e exclusão mútua do uso de éxons (MXE) onde apenas um dos dois éxons disponíveis pode ser retido de cada vez 2,3. A poliadenilação alternativa (APA) também desempenha um papel importante na regulação da expressão gênica usando sítios alternativos de poli (A) para gerar múltiplas isoformas de mRNA a partir de um único transcrito4. A maioria dos sítios de poliadenilação (pAs) está localizada na região não traduzida de 3' (UTRs de 3'), gerando isoformas de mRNA com diversos comprimentos UTR de 3'. Como a UTR de 3' é o hub central para o reconhecimento de elementos regulatórios, diferentes comprimentos de UTR de 3' podem afetar a localização, a estabilidade e a tradução do mRNA5. Há uma classe de ensaios de sequenciamento final de 3' otimizados para detectar APA que diferem nos detalhes do protocolo6. O pipeline descrito aqui é projetado para PolyA-seq, mas pode ser adaptado para outros protocolos, conforme descrito.
Neste estudo, apresentamos um pipeline de métodos diferenciais de análise de éxons7,8 (Figura 1), que podem ser divididos em duas grandes categorias: baseada em éxons (DEXSeq9, diffSplice 10) e baseada em eventos (replicate Multivariate Analysis of Transcript Splicing (rMATS)11). Os métodos baseados em éxons comparam a mudança de dobra entre as condições de éxons individuais, contra uma medida de mudança geral de dobra gênica para chamar o uso de éxons diferencialmente expressos e, a partir disso, calculam uma medida em nível de gene da atividade EA. Os métodos baseados em eventos usam leituras de junção de abrangência de exon-intron para detectar e classificar eventos de splicing específicos, como pulo de éxon ou retenção de íntrons, e distinguir esses tipos de AS na saída3. Assim, esses métodos fornecem visões complementares para uma análise completa da EA12,13. Selecionamos o DEXSeq (baseado no pacote DESeq214 DGE) e o diffSplice (baseado no pacote Limma10 DGE) para o estudo, pois estão entre os pacotes mais utilizados para análise de splicing diferencial. O rMATS foi escolhido como um método popular para análise baseada em eventos. Outro método popular baseado em eventos é o MISO (Mix of Isoforms)1. Para a APA, adaptamos a abordagem baseada em exons.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62636/62636fig01.jpg"> Figura 1. Análise de pipeline. Fluxograma das etapas utilizadas na análise. As etapas incluem: obtenção dos dados, realização de verificações de qualidade e alinhamento de leitura seguidas de contagem de leituras usando anotações para éxons, íntrons e sites pA conhecidos, filtragem para remover contagens baixas e normalização. Os dados de PolyA-seq foram analisados para sítios alternativos de pA usando os métodos diffSplice/DEXSeq, o RNA-Seq em massa foi analisado para splicing alternativo no nível do éxon com os métodos diffSplice/DEXseq e os eventos AS analisados com rMATS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62636/62636fig01large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Os dados de RNA-seq utilizados neste levantamento foram adquiridos do Gene Expression Omnibus (GEO) (GSE138691)15. Utilizamos dados de RNA-seq de camundongos deste estudo com dois grupos de condições: wild-type (WT) e Muscleblind-like type 1 knockout (Mbnl1 KO) com três repetições cada. Para demonstrar a análise diferencial do uso do sítio de poliadenilação, obtivemos dados PolyA-seq de fibroblastos embrionários de camundongos (MEFs) (GEO Accession GSE60487)16. Os dados têm quatro grupos de condições: Wild-type (WT), Muscleblind-like type1/type 2 double knockout (Mbnl1/2 DKO), Mbnl 1/2 DKO com Mbnl3 knockdown (KD) e Mbnl1/2 DKO com controle Mbnl3 (Ctrl). Cada grupo de condições consiste em duas replicações.
<table border="1" fo:font-size="5px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Adesão ao GEO</td>
			<td>Número de execução SRA</td>
			<td>Nome do exemplo</td>
			<td>Condição</td>
			<td>Replicar</td>
			<td>Tecido</td>
			<td>Seqüenciamento</td>
			<td>Comprimento de leitura</td>
		</tr><tr><td rowspan="6">RNA-Seq</td>
			<td>Telemóvel GSM4116218</td>
			<td>SRR10261601</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_1</td>
			<td>Nocaute Mbnl1</td>
			<td>Rep 1</td>
			<td>Timo</td>
			<td>Extremidade emparelhada</td>
			<td>100 pb</td>
		</tr><tr><td>Telemóvel GSM4116219</td>
			<td>SRR10261602</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_2</td>
			<td>Nocaute Mbnl1</td>
			<td>Rep 2</td>
			<td>Timo</td>
			<td>Extremidade emparelhada</td>
			<td>100 pb</td>
		</tr><tr><td>Telemóvel GSM4116220</td>
			<td>SRR10261603</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_3</td>
			<td>Nocaute Mbnl1</td>
			<td>Rep 3</td>
			<td>Timo</td>
			<td>Extremidade emparelhada</td>
			<td>100 pb</td>
		</tr><tr><td>Telemóvel GSM4116221</td>
			<td>SRR10261604</td>
			<td>WT_Thymus_1</td>
			<td>Tipo selvagem</td>
			<td>Rep 1</td>
			<td>Timo</td>
			<td>Extremidade emparelhada</td>
			<td>100 pb</td>
		</tr><tr><td>Telemóvel GSM4116222</td>
			<td>SRR10261605</td>
			<td>WT_Thymus_2</td>
			<td>Tipo selvagem</td>
			<td>Rep 2</td>
			<td>Timo</td>
			<td>Extremidade emparelhada</td>
			<td>100 pb</td>
		</tr><tr><td>Telemóvel GSM4116223</td>
			<td>SRR10261606</td>
			<td>WT_Thymus_3</td>
			<td>Tipo selvagem</td>
			<td>Rep 3</td>
			<td>Timo</td>
			<td>Extremidade emparelhada</td>
			<td>100 pb</td>
		</tr><tr><td rowspan="8">3P-Seq</td>
			<td>Mensagem GSM1480973</td>
			<td>SRR1553129</td>
			<td>WT_1</td>
			<td>Tipo selvagem (WT)</td>
			<td>Rep 1</td>
			<td>Fibroblastos embrionários de camundongos (MEFs)</td>
			<td>Extremidade única</td>
			<td>40 pb</td>
		</tr><tr><td>Telemóvel 1480974</td>
			<td>SRR1553130</td>
			<td>WT_2</td>
			<td>Tipo selvagem (WT)</td>
			<td>Rep 2</td>
			<td>Fibroblastos embrionários de camundongos (MEFs)</td>
			<td>Extremidade única</td>
			<td>40 pb</td>
		</tr><tr><td>Telemóvel 1480975</td>
			<td>SRR1553131</td>
			<td>DKO_1</td>
			<td>Mbnl 1/2 nocaute duplo (DKO)</td>
			<td>Rep 1</td>
			<td>Fibroblastos embrionários de camundongos (MEFs)</td>
			<td>Extremidade única</td>
			<td>40 pb</td>
		</tr><tr><td>Mensagem GSM1480976</td>
			<td>SRR1553132</td>
			<td>DKO_2</td>
			<td>Mbnl 1/2 nocaute duplo (DKO)</td>
			<td>Rep 2</td>
			<td>Fibroblastos embrionários de camundongos (MEFs)</td>
			<td>Extremidade única</td>
			<td>40 pb</td>
		</tr><tr><td>Telemóvel 1480977</td>
			<td>SRR1553133</td>
			<td>DKOsiRNA_1</td>
			<td>Mbnl 1/2 nocaute duplo com Mbnl 3 siRNA (KD)</td>
			<td>Rep 1</td>
			<td>Fibroblastos embrionários de camundongos (MEFs)</td>
			<td>Extremidade única</td>
			<td>40 pb</td>
		</tr><tr><td>Telemóvel 1480978</td>
			<td>SRR1553134</td>
			<td>DKOsiRNA_2</td>
			<td>Mbnl 1/2 nocaute duplo com Mbnl 3 siRNA (KD)</td>
			<td>Rep 2</td>
			<td>Fibroblastos embrionários de camundongos (MEFs)</td>
			<td>Extremidade única</td>
			<td>36 pb</td>
		</tr><tr><td>Telemóvel 1480979</td>
			<td>SRR1553135</td>
			<td>DKONTsiRNA_1</td>
			<td>Mbnl 1/2 nocaute duplo com siRNA não direcionado (Ctrl)</td>
			<td>Rep 1</td>
			<td>Fibroblastos embrionários de camundongos (MEFs)</td>
			<td>Extremidade única</td>
			<td>40 pb</td>
		</tr><tr><td>Telemóvel 1480980</td>
			<td>SRR1553136</td>
			<td>DKONTsiRNA_2</td>
			<td>Mbnl 1/2 nocaute duplo com siRNA não direcionado (Ctrl)</td>
			<td>Rep 2</td>
			<td>Fibroblastos embrionários de camundongos (MEFs)</td>
			<td>Extremidade única</td>
			<td>40 pb</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1. Resumo dos conjuntos de dados de RNA-Seq e PolyA-seq utilizados para a análise.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Not relevent for computational study</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of alternative splicing and polyadenylation in rna-seq data

Assim como a análise típica de RNA-Seq para medir a expressão gênica diferencial (DGE) em condições experimentais / biológicas, os dados de RNA-seq também podem ser utilizados para explorar outros mecanismos regulatórios complexos no nível do éxon. O splicing alternativo e a poliadenilação desempenham um papel crucial na diversidade funcional de um gene, gerando diferentes isoformas para regular a expressão gênica no nível pós-transcricional, e limitar as análises a todo o nível do gene pode perder essa importante camada reguladora. Aqui, demonstramos análises detalhadas passo a passo para identificação e visualização do uso diferencial do éxon e do local de poliadenilação em todas as condições, usando Bioconductor e outros pacotes e funções, incluindo DEXSeq, diffSplice do pacote Limma e rMATS.

Depois de executar o fluxo de trabalho passo a passo acima, as saídas de análise AS e APA e os resultados representativos estão na forma de tabelas e gráficos de dados, gerados da seguinte maneira.
COMO: O principal resultado da análise AS (Tabela Suplementar 1 para diffSplice; Tabela 2 para DEXSeq) é uma lista de éxons mostrando o uso diferencial entre as condições, e uma lista de genes mostrando atividade de splicing global signi...

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Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data

O splicing alternativo (AS) e a poliadenilação alternativa (APA) expandem a diversidade de isoformas de transcritos e seus produtos. Aqui, descrevemos protocolos de bioinformática para analisar ensaios de RNA-seq em massa e sequenciamento final de 3' para detectar e visualizar AS e APA variando entre condições experimentais.

Identificação de Splicing Alternativo e Poliadenilação em Dados de RNA-seq

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also ...

Este protocolo fornece uma compreensão abrangente das isoformas genéticas geradas por splicing alternativo e poliadenilação, fornecendo um fluxo de trabalho passo-a-passo para identificar locais de splicing diferenciais, éxons diferencialmente expressos e poli(A)sítios. A principal vantagem deste protocolo é que ele avalia métodos baseados em exons e baseados em eventos para estudar splicing alternativo. Também aplica o método baseado em éxons para estudar a poliadenilação alternativa.Os arquivos R Markdown que incluem os códigos e notas para análise AS e AP foram fornecidos. Seria aconselhável seguir as etapas no arquivo R Markdown e chegar à nota para cada etapa com cuidado. Para identificar o splicing diferencial usando diffSplice de limma, siga o arquivo de bloco de anotações R.Prepare os arquivos de entrada conforme descrito no manuscrito do texto. Certifique-se de que as etapas de um a três no manuscrito tenham sido seguidas sequencialmente para preparar os arquivos de entrada antes de prosseguir. Comece carregando as bibliotecas necessárias.Para executar a filtragem não específica, primeiro extraia a matriz de contagens de leitura obtidas anteriormente e crie uma lista de recursos usando a função DGEList do pacote edgeR, onde linhas representam genes e colunas representam amostras. Em seguida, transforme os dados da escala bruta em contagens por milhão usando a função CPM do pacote edgeR e mantenha os éxons com contagens maiores que um limite definível. Este conjunto de dados contém seis amostras.Assim, o CPM é definido em maior que uma e pelo menos três amostras de seis. Normalize as contagens entre amostras com a função calcNormFactors do pacote edgeR usando a Média Aparada dos valores M. Essa função calculará fatores de dimensionamento para ajustar os tamanhos das bibliotecas.Use a tabela de amostra gerada anteriormente para criar a matriz de projeto para definir as condições experimentais para cada amostra. Execute a função voom do pacote limma para processar dados de sequenciamento de RNA para estimar a variância. Essa função gerará pesos de precisão para corrigir o ruído de contagem de Poisson e transformar as contagens de nível de éxon para registrar duas contagens por milhão ou logCPM.Execute a função lmfit para ajustar modelos lineares aos dados de expressão para cada éxon. Em seguida, execute a função eBayes para calcular estatísticas empíricas para o modelo ajustado para detectar a expressão diferencial do éxon. Defina uma matriz de contraste para as comparações experimentais de interesse.Use os contrastes. função de ajuste para obter coeficientes e erros-padrão para cada par de comparações. Execute diffSplice no modelo ajustado para testar as diferenças no uso de éxons de genes entre o tipo selvagem e o nocaute.Explore os resultados mais bem classificados usando a função topSplice onde um teste igual a t dá uma classificação de éxons AS e teste igual a simes dá uma classificação de genes. Execute a função plotSplice para plotar os resultados. Ao colocar o gene de interesse no argumento do gene ID, os pontos vermelhos mostram os éxons diferencialmente expressos.Gere um gráfico de vulcão usando o pacote biocondutor EnhancedVolcano para exibir os éxons diferencialmente expressos. Para usar o rMATS, verifique se a versão mais recente do rMATS versão 4.1.1 está instalada usando conda ou GitHub no diretório de trabalho. Vá para a pasta que contém os arquivos bam obtidos após o mapeamento.Prepare arquivos de texto conforme exigido pelo rMATS para as duas condições de copiar o nome dos arquivos bam e seu caminho separados por uma vírgula. Execute rmas. py usando os dois arquivos de texto de entrada gerados descrevendo o caminho dos arquivos bam e a anotação.gtf obtido anteriormente. Isso gera uma pasta de saída rmats_out contendo arquivos de texto que descrevem estatísticas, incluindo valores P e níveis de inclusão para cada evento de splicing separadamente. Use o pacote de biocondutores maser para explorar os resultados do rMATS.Carregue a junção e o éxon conte arquivos de texto com a extensão JCEC no objeto maser e inclua pelo menos cinco leituras médias por evento de emenda para filtrar o resultado com base na cobertura. Para visualizar os resultados do rMATS, primeiro execute a função topEvents do pacote masser, selecionando os eventos de splicing significativos a uma taxa de descoberta falsa de 10% e uma alteração mínima de 10% na porcentagem emendada ou PSI. Verifique os eventos genéticos para genes individuais de interesse e plote os valores de PSI para cada evento de splicing desse gene.Gere um gráfico de vulcão especificando o tipo de evento. Use os resultados de eventos de splicing obtidos com rMATS na forma de arquivos de texto para gerar gráficos de sashimi usando o pacote rmats2sashimiplot. O gráfico de sashimi mostra um evento éxon ignorado no gene Wnk1.Cada linha representa uma amostra de RNA-seq, três repetições do tipo selvagem e nocaute Mbnl1. A altura mostra a cobertura de leitura em RPKM e os arcos de conexão retratam leituras de junção através de éxons. A parte inferior mostra isoformas alternativas do modelo de gene anotado.Uma mudança substancial de dobras e fortes evidências estatísticas de diferenças genuínas podem ser observadas nos genes localizados nos quadrantes superior esquerdo ou direito das parcelas vulcânicas obtidas usando diffSplice e DEXSeq. Verificou-se que um éxon em variava entre diferentes condições para o gene Wnk1. O gráfico de uso diferencial de éxons mostrou evidências de splicing diferencial em cinco locais de éxons perto de Wnk1.6.45, com os éxons destacados em rosa provavelmente sendo emendados em amostras de nocaute de Mbnl1 em comparação com o tipo selvagem.O gráfico vulcânico de genes que são alternativamente emendados ajudou a distinguir entre os genes que foram excluídos do tipo selvagem e aqueles que foram incluídos no tipo selvagem. Os tipos de eventos de splicing SE, A5SS, A3SS, MXE e RI foram visualizados usando gráficos de sashimi dos principais genes significativos desses eventos. A atividade diferencial da APA em três regiões primordiais não traduzidas de genes foi observada usando gráficos de vulcões.Os resultados significativamente diferenciais de uso do site de PA adquiridos de diferentes pipelines foram visualizados usando o gráfico de eventos. Um deslocamento distal para proximal significativo do uso do sítio da AF em nocautes duplos pode ser observado em ambos os genes FOSL1 e Papola. A cobertura média em regiões de flanco ancoradas em locais de clivagem de PA conhecidos no nível de todo o genoma foi determinada usando um gráfico de diagnóstico.Certifique-se de que os parâmetros, como informações tranespecíficas e permitir multi-sobreposição, sejam usados corretamente ao gerar métricas de contagem. O ajuste do modelo linear e a geração de pares de contraste são importantes para a comparação adequada. Para rMATS, verifique se todos os parâmetros estão definidos corretamente de acordo com seus dados antes de executar o comando.Os genes obtidos a partir da atividade de splicing diferencial poderiam ser usados para realizar a análise de enriquecimento do conjunto de genes. Outra ferramenta chamada MISO poderia ser usada para análises posteriores baseadas em eventos.

Research

JoVE Journal

Biology

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

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The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Biologia

Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

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The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity ...

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Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

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Detecção de splicing alternativo Durante epitelial-mesenquimal Transição

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Identificação rápida de químicos Genéticos Interações em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

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A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq

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Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus ...