Name: identification of alternative splicing and polyadenylation in rna-seq data
Uploaded: 2021-06-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data at JoVE.com

Это исследование было поддержано Австралийским исследовательским советом (ARC) Future Fellowship (FT16010043) и ANU Futures Scheme.

1. Установка инструментов и R пакетов, используемых в анализе
<ol><li>Conda - это популярный и гибкий менеджер пакетов, который позволяет удобно устанавливать пакеты с их зависимостями на всех платформах. Используйте 'Anaconda' (менеджер пакетов conda) для установки 'conda', который можно исполь...

<ol>
	<li>Katz, Y., Wang, E. T., Airoldi, E. M., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+design+of+RNA+sequencing+experiments+for+identifying+isoform+regulation.">Analysis and design of RNA sequencing experiments for identifying isoform regulation.</a> Nature Methods. 7 (12), 1009-1015 (2010).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+alternative+splicing+and+its+regulation.">Mechanism of alternative splicing and its regulation.</a> Biomedical Reports. 3 (2), 152-158 (2015).</li><li>Mehmood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+differential+splicing+tools+for+RNA-seq+studies.">Systematic evaluation of differential splicing tools for RNA-seq studies.</a> Briefings in Bioinformatics. 21 (6), 2052-2065 (2020).</li><li>Movassat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+between+alternative+polyadenylation+and+alternative+splicing+is+limited+to+terminal+introns.">Coupling between alternative polyadenylation and alternative splicing is limited to terminal introns.</a> RNA Biology. 13 (7), 646-655 (2016).</li><li>Tian, B., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+polyadenylation+of+mRNA+precursors.">Alternative polyadenylation of mRNA precursors.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (1), 18-30 (2017).</li><li>Herrmann, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PolyASite+2.0:+a+consolidated+atlas+of+polyadenylation+sites+from+3'+end+sequencing.">PolyASite 2.0: a consolidated atlas of polyadenylation sites from 3' end sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 48 (1), 174-179 (2020).</li><li>Liu, R., Loraine, A. E., Dickerson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparisons+of+computational+methods+for+differential+alternative+splicing+detection+using+RNA-seq+in+plant+systems.">Comparisons of computational methods for differential alternative splicing detection using RNA-seq in plant systems.</a> BMC Bioinformatics. 15 (1), 364 (2014).</li><li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis.">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biology. 17 (1), 13 (2016).</li><li>Anders, S., Reyes, A., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+differential+usage+of+exons+from+RNA-seq+data.">Detecting differential usage of exons from RNA-seq data.</a> Genome Research. 22 (10), 2008-2017 (2012).</li><li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies.">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), 47 (2014).</li><li>Shen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rMATS:+Robust+and+flexible+detection+of+differential+alternative+splicing+from+replicate+RNA-Seq+data.">rMATS: Robust and flexible detection of differential alternative splicing from replicate RNA-Seq data.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (51), 5593-5601 (2014).</li><li>Mehmood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+differential+splicing+tools+for+RNA-seq+studies.">Systematic evaluation of differential splicing tools for RNA-seq studies.</a> Briefings in bioinformatics. 21 (6), 2052-2065 (2020).</li><li>Kanitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+assessment+of+methods+for+the+computational+inference+of+transcript+isoform+abundance+from+RNA-seq+data.">Comparative assessment of methods for the computational inference of transcript isoform abundance from RNA-seq data.</a> Genome biology. 16 (1), 1-26 (2015).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Sznajder, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+MBNL1+induces+RNA+misprocessing+in+the+thymus+and+peripheral+blood.">Loss of MBNL1 induces RNA misprocessing in the thymus and peripheral blood.</a> Nature Communications. 11, 1-11 (2020).</li><li>Batra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+MBNL+leads+to+disruption+of+developmentally+regulated+alternative+polyadenylation+in+RNA-mediated+disease.">Loss of MBNL leads to disruption of developmentally regulated alternative polyadenylation in RNA-mediated disease.</a> Molecular Cell. 56 (2), 311-322 (2014).</li><li>Leinonen, R., Sugawara, H., Shumway, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sequence+read+archive.">The sequence read archive.</a> Nucleic acids research. 39, 19-21 (2010).</li><li>Tange, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> GNU parallel-the command-line power tool. 36, 42-47 (2011).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAR:+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner.">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li><li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=edgeR:+a+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data.">edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).</li><li>Robinson, M. D., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scaling+normalization+method+for+differential+expression+analysis+of+RNA-seq+data.">A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data.</a> Genome Biology. 11 (3), 25 (2010).</li><li>Veiga, D. F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=maser:+Mapping+Alternative+Splicing+Events+to+pRoteins.">maser: Mapping Alternative Splicing Events to pRoteins.</a> R package version 1.4.0. , (2019).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10 (13), 25 (2009).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Ram&#237;rez, F., D&#252;ndar, F., Diehl, S., Gr&#252;ning, B. A., Manke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=deepTools:+a+flexible+platform+for+exploring+deep-sequencing+data.">deepTools: a flexible platform for exploring deep-sequencing data.</a> Nucleic acids research. 42 (1), 187-191 (2014).</li><li>Merino, G. A., Conesa, A., Fern&#225;ndez, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+benchmarking+of+workflows+for+detecting+differential+splicing+and+differential+expression+at+isoform+level+in+human+RNA-seq+studies.">A benchmarking of workflows for detecting differential splicing and differential expression at isoform level in human RNA-seq studies.</a> Briefings in bioinformatics. 20 (2), 471-481 (2019).</li><li>Chhangawala, S., Rudy, G., Mason, C. E., Rosenfeld, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+read+length+on+quantification+of+differentially+expressed+genes+and+splice+junction+detection.">The impact of read length on quantification of differentially expressed genes and splice junction detection.</a> Genome biology. 16 (1), 1-10 (2015).</li><li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis.">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biol. 17, 13 (2016).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks.">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat Protoc. 7 (3), 562-578 (2012).</li><li>Li, B., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RSEM:+accurate+transcript+quantification+from+RNA-Seq+data+with+or+without+a+reference+genome.">RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome.</a> BMC Bioinformatics. 12, 323 (2011).</li><li>Bray, N. L., Pimentel, H., Melsted, P., Pachter, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-optimal+probabilistic+RNA-seq+quantification.">Near-optimal probabilistic RNA-seq quantification.</a> Nat Biotechnol. 34 (5), 525-527 (2016).</li></ol>

В этом исследовании мы оценили основанные на экзонах и событиях подходы к обнаружению AS и APA в объемных данных СЕКВЕНИРОВАНИЯ РНК-Seq и 3'. Подходы AS, основанные на экзонах, дают как список дифференциально экспрессированных экзонов, так и ранжирование на уровне генов, упорядоченное по стат...

RNA-seq широко использовался на протяжении многих лет, как правило, для оценки дифференциальной экспрессии генов и открытия генов1. Кроме того, он также может быть использован для оценки различного использования на уровне экзонов из-за генов, экспрессирующих различные изоформы, что способствует лучшему пониманию регуляции генов на посттранскрипционном уровне. Большинство эукариотических генов генерируют различные изоформы путем альтернативного сплайсинга (AS) для увеличения разнообразия экспрессии мРНК. События AS можно разделить на различные паттерны: пропуск полных экзонов (SE), где («кассетный») экзон полностью удаляется из стенограммы вместе с его фланкирующими интронами; альтернативный (донорский) 5-футовый выбор места сращивания (A5SS) и альтернативный 3-дюймовый (акцепторный) выбор места сращивания (A3SS), когда два или более участков сращивания присутствуют на обоих концах экзона; удержание интронов (RI), когда интрон сохраняется в зрелом транскрипте мРНК, и взаимное исключение использования экзона (MXE), где только один из двух доступных экзонов может быть сохранен за один раз 2,3. Альтернативное полиаденилирование (АПА) также играет важную роль в регулировании экспрессии генов с использованием альтернативных поли(А) сайтов для генерации нескольких изоформ мРНК из одного транскрипта4. Большинство участков полиаденилирования (pAs) расположены в 3' нетранслируемой области (3' UTR), генерируя изоформы мРНК с различными длинами UTR 3'. Поскольку 3' UTR является центральным узлом для распознавания регуляторных элементов, различные длины 3' UTR могут влиять на локализацию, стабильность и трансляцию мРНК5. Существует класс 3'-концевых анализов секвенирования, оптимизированных для обнаружения APA, которые отличаются деталями протокола6. Конвейер, описанный здесь, предназначен для PolyA-seq, но может быть адаптирован для других протоколов, как описано.
В данном исследовании мы представляем конвейер методов дифференциального анализа экзонов 7,8 (рисунок 1), которые можно разделить на две широкие категории: основанные на экзонах (DEXSeq9, diffSplice10) и событийные (реплицированный многомерный анализ сплайсинга транскриптов (rMATS)11). Методы, основанные на экзонах, сравнивают изменение складки в разных условиях отдельных экзонов с мерой общего изменения складки генов, чтобы вызвать дифференциально экспрессированное использование экзонов, и на основе этого вычисляют меру активности АС на уровне гена. Методы, основанные на событиях, используют считывание переходов, охватывающих экзон-интрон, для обнаружения и классификации конкретных событий сплайсинга, таких как пропуск экзона или удержание интронов, и различают эти типы AS в выходных данных3. Таким образом, эти методы обеспечивают взаимодополняющие взгляды для полного анализа AS 12,13. Мы выбрали DEXSeq (на основе пакета DESeq214 DGE) и diffSplice (на основе пакета Limma10 DGE) для исследования, поскольку они являются одними из наиболее широко используемых пакетов для дифференциального анализа сплайсинга. rMATS был выбран в качестве популярного метода для анализа на основе событий. Другим популярным методом, основанным на событиях, является MISO (Смесь изоформ)1. Для APA мы адаптируем подход, основанный на экзонах.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62636/62636fig01.jpg"> Рисунок 1. Конвейер анализа. Блок-схема шагов, используемых в анализе. Шаги включают в себя: получение данных, выполнение проверок качества и выравнивания считывания с последующим подсчетом считываний с использованием аннотаций для известных экзонов, интронов и участков pA, фильтрацию для удаления низких значений и нормализации. Данные PolyA-seq были проанализированы для альтернативных участков pA с использованием методов diffSplice/DEXSeq, объемная РНК-Seq была проанализирована для альтернативного сплайсинга на уровне экзона методами diffSplice/DEXseq, а события AS анализировались с помощью rMATS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62636/62636fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Данные RNA-seq, использованные в этом исследовании, были получены из Gene Expression Omnibus (GEO) (GSE138691)15. Мы использовали данные RNA-seq мышей из этого исследования с двумя группами состояний: дикий тип (WT) и Muscleblind-подобный нокаут типа 1 (Mbnl1 KO) с тремя репликами в каждой. Чтобы продемонстрировать дифференциальный анализ использования участка полиаденилирования, мы получили данные PolyA-seq о фибробластах эмбриона мыши (MEFs) (GEO Accession GSE60487)16. Данные имеют четыре группы условий: Wild-type (WT), Muscleblind-like type1/type 2 double knockout (Mbnl1/2 DKO), Mbnl 1/2 DKO с Mbnl3 knockdown (KD) и Mbnl1/2 DKO с управлением Mbnl3 (Ctrl). Каждая группа условий состоит из двух реплик.
<table border="1" fo:font-size="5px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Присоединение к ГЭП</td>
			<td>Номер запуска SRA</td>
			<td>Пример имени</td>
			<td>Состояние</td>
			<td>Повторять</td>
			<td>Ткань</td>
			<td>Секвенирование</td>
			<td>Длина чтения</td>
		</tr><tr><td rowspan="6">РНК-Сек</td>
			<td>GSM4116218</td>
			<td>СРР10261601</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_1</td>
			<td>Нокаут Mbnl1</td>
			<td>Представитель 1</td>
			<td>Тимус</td>
			<td>Сопряженный конец</td>
			<td>100 бит/с</td>
		</tr><tr><td>GSM4116219</td>
			<td>СРР10261602</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_2</td>
			<td>Нокаут Mbnl1</td>
			<td>Представитель 2</td>
			<td>Тимус</td>
			<td>Сопряженный конец</td>
			<td>100 бит/с</td>
		</tr><tr><td>GSM4116220</td>
			<td>СРР10261603</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_3</td>
			<td>Нокаут Mbnl1</td>
			<td>Представитель 3</td>
			<td>Тимус</td>
			<td>Сопряженный конец</td>
			<td>100 бит/с</td>
		</tr><tr><td>GSM4116221</td>
			<td>СРР10261604</td>
			<td>WT_Thymus_1</td>
			<td>Дикий тип</td>
			<td>Представитель 1</td>
			<td>Тимус</td>
			<td>Сопряженный конец</td>
			<td>100 бит/с</td>
		</tr><tr><td>GSM4116222</td>
			<td>СРР10261605</td>
			<td>WT_Thymus_2</td>
			<td>Дикий тип</td>
			<td>Представитель 2</td>
			<td>Тимус</td>
			<td>Сопряженный конец</td>
			<td>100 бит/с</td>
		</tr><tr><td>GSM4116223</td>
			<td>СРР10261606</td>
			<td>WT_Thymus_3</td>
			<td>Дикий тип</td>
			<td>Представитель 3</td>
			<td>Тимус</td>
			<td>Сопряженный конец</td>
			<td>100 бит/с</td>
		</tr><tr><td rowspan="8">3П-Сек</td>
			<td>GSM1480973</td>
			<td>СРР1553129</td>
			<td>WT_1</td>
			<td>Дикий тип (WT)</td>
			<td>Представитель 1</td>
			<td>Мышиные эмбриональные фибробласты (MEF)</td>
			<td>Однокомнатный</td>
			<td>40 бит/с</td>
		</tr><tr><td>GSM1480974</td>
			<td>СРР1553130</td>
			<td>WT_2</td>
			<td>Дикий тип (WT)</td>
			<td>Представитель 2</td>
			<td>Мышиные эмбриональные фибробласты (MEF)</td>
			<td>Однокомнатный</td>
			<td>40 бит/с</td>
		</tr><tr><td>GSM1480975</td>
			<td>СРР1553131</td>
			<td>DKO_1</td>
			<td>Mbnl 1/2 двойной нокаут (DKO)</td>
			<td>Представитель 1</td>
			<td>Мышиные эмбриональные фибробласты (MEF)</td>
			<td>Однокомнатный</td>
			<td>40 бит/с</td>
		</tr><tr><td>GSM1480976</td>
			<td>СРР1553132</td>
			<td>DKO_2</td>
			<td>Mbnl 1/2 двойной нокаут (DKO)</td>
			<td>Представитель 2</td>
			<td>Мышиные эмбриональные фибробласты (MEF)</td>
			<td>Однокомнатный</td>
			<td>40 бит/с</td>
		</tr><tr><td>GSM1480977</td>
			<td>СРР1553133</td>
			<td>DKOsiRNA_1</td>
			<td>Mbnl 1/2 двойной нокаут с Mbnl 3 siRNA (KD)</td>
			<td>Представитель 1</td>
			<td>Мышиные эмбриональные фибробласты (MEF)</td>
			<td>Однокомнатный</td>
			<td>40 бит/с</td>
		</tr><tr><td>GSM1480978</td>
			<td>СРР1553134</td>
			<td>DKOsiRNA_2</td>
			<td>Mbnl 1/2 двойной нокаут с Mbnl 3 siRNA (KD)</td>
			<td>Представитель 2</td>
			<td>Мышиные эмбриональные фибробласты (MEF)</td>
			<td>Однокомнатный</td>
			<td>36 бит/с</td>
		</tr><tr><td>GSM1480979</td>
			<td>СРР1553135</td>
			<td>DKONTsiRNA_1</td>
			<td>Mbnl 1/2 двойной нокаут с нецелевым siRNA (Ctrl)</td>
			<td>Представитель 1</td>
			<td>Мышиные эмбриональные фибробласты (MEF)</td>
			<td>Однокомнатный</td>
			<td>40 бит/с</td>
		</tr><tr><td>GSM1480980</td>
			<td>СРР1553136</td>
			<td>DKONTsiRNA_2</td>
			<td>Mbnl 1/2 двойной нокаут с нецелевым siRNA (Ctrl)</td>
			<td>Представитель 2</td>
			<td>Мышиные эмбриональные фибробласты (MEF)</td>
			<td>Однокомнатный</td>
			<td>40 бит/с</td>
		</tr></tbody></table>Таблица 1. Резюме наборов данных RNA-Seq и PolyA-seq, используемых для анализа.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Not relevent for computational study</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of alternative splicing and polyadenylation in rna-seq data

Наряду с типичным анализом RNA-Seq для измерения дифференциальной экспрессии генов (DGE) в экспериментальных / биологических условиях, данные RNA-seq также могут быть использованы для изучения других сложных регуляторных механизмов на уровне экзонов. Альтернативное сплайсинг и полиаденилирование играют решающую роль в функциональном разнообразии гена, генерируя различные изоформы для регулирования экспрессии генов на посттранскрипционном уровне, и ограничение анализа всем генным уровнем может пропустить этот важный регуляторный слой. Здесь мы демонстрируем подробный пошаговый анализ для идентификации и визуализации использования дифференциального экзона и полиаденилирования в разных условиях с использованием биопроводника и других пакетов и функций, включая DEXSeq, diffSplice из пакета Limma и rMATS.

После выполнения приведенного выше пошагового рабочего процесса выходные данные анализа AS и APA и репрезентативные результаты представляются в виде таблиц и графиков данных, генерируемых следующим образом.
КАК: Основные результаты анализа АС (Дополнитель...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data at JoVE.com

Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data

Альтернативное сплайсинг (AS) и альтернативное полиаденилирование (APA) расширяют разнообразие изоформ транскриптов и их продуктов. Здесь мы описываем биоинформационные протоколы для анализа объемных анализов РНК-seq и 3'-концевого секвенирования для обнаружения и визуализации AS и APA, варьирующихся в зависимости от экспериментальных условий.

Идентификация альтернативного сплайсинга и полиаденилирования в данных RNA-seq

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also ...

Этот протокол обеспечивает всестороннее понимание изоформ генов, генерируемых альтернативным сплайсингом и полиаденилированием, предоставляя пошаговый рабочий процесс для идентификации дифференциальных сайтов сплайсинга, дифференциально экспрессированных экзонов и поли(А)сайтов. Основным преимуществом этого протокола является то, что он оценивает как экзонные, так и событийные методы изучения альтернативного сплайсинга. Он также применяет метод на основе экзонов для изучения альтернативного полиаденилирования.Были предоставлены файлы R Markdown, содержащие коды и примечания для анализа AS и AP. Было бы целесообразно следовать шагам в файле R Markdown и тщательно добираться до примечания к каждому шагу. Чтобы определить дифференциальное сращивание с помощью diffSplice от limma, следуйте файлу записной книжки R.Подготовьте входные файлы, как описано в текстовой рукописи. Убедитесь, что шаги с первого по третий в рукописи были выполнены последовательно для подготовки входных файлов, прежде чем продолжить работу. Начните с загрузки необходимых библиотек.Чтобы выполнить неспецифическую фильтрацию, сначала извлеките матрицу счетчиков чтения, полученную ранее, и создайте список объектов с помощью функции DGEList из пакета edgeR, где строки представляют гены, а столбцы представляют образцы. Затем преобразуйте данные из необработанного масштаба в счетчики на миллион с помощью функции CPM из пакета edgeR и сохраните экзоны с количеством, превышающим заданное пороговое значение. Этот набор данных содержит шесть образцов.Следовательно, CPM устанавливается на более чем один и, по крайней мере, три образца из шести. Нормализуйте счетчики между выборками с помощью функции calcNormFactors из пакета edgeR, используя усеченное среднее значение значений M. Эта функция вычисляет коэффициенты масштабирования для настройки размеров библиотек.Используйте ранее созданную таблицу образцов для создания матрицы проектирования для определения экспериментальных условий для каждого образца. Запустите функцию voom пакета limma для обработки данных секвенирования РНК для оценки дисперсии. Эта функция будет генерировать прецизионные веса для исправления шума подсчета Пуассона и преобразования значений уровня экзона для регистрации двух подсчетов на миллион или logCPM.Запустите функцию lmfit, чтобы привести линейные модели в соответствие с данными выражения для каждого экзона. Затем запустите функцию eBayes для вычисления эмпирической статистики для установленной модели для обнаружения дифференциального выражения экзона. Определите контрастную матрицу для экспериментальных сравнений, представляющих интерес.Используйте контрасты. функция fit для получения коэффициентов и стандартных погрешностей для каждой пары сравнений. Запустите diffSplice на подходящей модели, чтобы проверить различия в использовании генов экзона между диким типом и нокаутом.Изучите результаты с самым высоким рейтингом, используя функцию topSplice, где тест, равный t, дает рейтинг экзонов AS, а тест, равный simes, дает ранжирование генов. Запустите функцию plotSplice для построения результатов. Помещая интересующий ген в аргумент идентификатора гена, красные точки показывают дифференциально экспрессированные экзоны.Сгенерируйте график вулкана, используя пакет биопроводников EnhancedVolcano для демонстрации дифференциально выраженных экзонов. Чтобы использовать rMATS, убедитесь, что последняя версия rMATS версии 4.1.1 установлена либо с помощью conda, либо GitHub в рабочем каталоге. Перейдите в папку, содержащую файлы bam, полученные после сопоставления.Подготовьте текстовые файлы в соответствии с требованиями rMATS для двух условий копирования имени файлов bam и пути к ним, разделенные запятой. Запустите rmas. py с использованием двух сгенерированных входных текстовых файлов, описывающих путь к файлам bam и аннотацию.gtf файл, полученный ранее. При этом создается выходная папка rmats_out содержащая текстовые файлы, описывающие статистику, включая P-значения и уровни включения для каждого события сплайсинга отдельно. Используйте биопроводниковый мазер для изучения результатов rMATS.Загрузите в объект maser текстовые файлы с расширением JCEC соединения и exon count и включите не менее пяти средних считываний на событие сплайсинга, чтобы отфильтровать результат на основе покрытия. Чтобы визуализировать результаты rMATS, сначала запустите функцию topEvents из пакета масера, выбрав значимые события сплайсинга со скоростью ложного обнаружения 10% и минимальным изменением процента сращивания в или PSI. Проверьте события гена для отдельных генов, представляющих интерес, и постройте график значений PSI для каждого события сплайсинга этого гена.Создайте график вулкана, указав тип события. Используйте результаты событий сплайсинга, полученные с помощью rMATS в виде текстовых файлов, для генерации графиков сашими с помощью пакета rmats2sashimiplot. График сашими показывает пропущенное событие экзона в гене Wnk1.Каждая строка представляет собой образец RNA-seq, три реплики дикого типа и нокаут Mbnl1. Высота показывает покрытие считывания в RPKM, а соединительные дуги изображают считывание соединения между экзонами. В нижней части показаны аннотированные альтернативные изоформы модели генов.Существенное изменение складки и убедительные статистические доказательства подлинных различий можно наблюдать в генах, расположенных в верхнем левом или правом квадрантах графиков вулканов, полученных с помощью diffSplice и DEXSeq. Было обнаружено, что кассетный экзон варьируется между различными условиями для гена Wnk1. График использования дифференциального экзона показал доказательства дифференциального сращивания на пяти участках экзонов вблизи Wnk1.6.45, причем экзоны, выделенные розовым цветом, вероятно, будут сращены в нокаут-образцах Mbnl1 по сравнению с диким типом.Вулканический участок генов, которые альтернативно сращиваются, помог различить гены, которые были исключены из дикого типа, и те, которые были включены в дикий тип. Типы событий сплайсинга SE, A5SS, A3SS, MXE и RI были визуализированы с использованием графиков сашими главных значимых генов этих событий. Дифференциальная активность АПА в трех простых нетранслируемых областях генов наблюдалась с использованием вулканических графиков.Значительно дифференцированные результаты использования сайта PA, полученные от разных конвейеров, были визуализированы с помощью графика событий. Значительный дистальный и проксимальный сдвиг использования сайта ПА в двойных нокаутах может наблюдаться как в генах FOSL1, так и в Papola. Среднее покрытие во фланговых областях, закрепленных на известных участках расщепления ПА на уровне всего генома, определяли с помощью диагностического участка.Убедитесь, что параметры, такие как трансспецифическая информация и разрешение на множественное перекрытие, правильно используются при создании метрик счетчика. Линейная модель подгонки и генерация контрастных пар важна для правильного сравнения. Для rMATS убедитесь, что все параметры установлены правильно в соответствии с вашими данными, прежде чем выполнять команду.Гены, полученные в результате дифференциальной сплайсинговой активности, могут быть использованы для проведения анализа обогащения набора генов. Другой инструмент под названием MISO может быть использован для дальнейшего анализа на основе событий.

Research

JoVE Journal

Biology

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

РНК-след Анализ Transcriptomes в тромбин обращению и контролю человека легочной микрососудистой эндотелиальных клеток

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

Истощение рибосомальной РНК для Mosquito метагеномных Gut РНК-сл

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Альтернативные Культуры для человека плюрипотентных стволовых клеток производство, техобслуживание, и генетический анализ

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Обнаружение альтернативного сплайсинга Во эпителиальных-мезенхимальных перехода

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Экспериментальные и биоинформатика Протокол Секвенирование РНК Анализы ФОТОПЕРИОДИЧЕСКИХ диапаузы в Азиатско тигровый комар,<em&gt; Кусака бело-пёстрый</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Быстрая идентификация химических генетических взаимодействий в<em&gt; Saccharomyces Cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Methods to Discover Alternative Promoter Usage and Transcriptional Regulation of Murine Bcrp1

Методы Обнаружение использования альтернативных Promoter и транскрипционной регуляции мышиных Bcrp1

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually ...

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Идентификация новых регуляторов транспирации растений путем масштабного теплового скрининга в Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq

Биоинформатический конвейер для исследования молекулярной эволюции и экспрессии генов с использованием RNA-seq

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus ...