Name: identification of alternative splicing and polyadenylation in rna-seq data
Uploaded: 2021-06-24T13:00:00
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Este estudio fue apoyado por una beca futura del Consejo Australiano de Investigación (ARC) (FT16010043) y ANU Futures Scheme.

1. Instalación de herramientas y paquetes R utilizados en el análisis
<ol><li>Conda es un administrador de paquetes popular y flexible que permite la instalación conveniente de paquetes con sus dependencias en todas las plataformas. Use 'Anaconda' (administrador de paquetes conda) para instalar 'conda' que se puede usar para instalar las herramientas / paquetes necesarios para el análisis.</li>
	<li>Descargue 'Anaconda' de acuerdo con los requisitos del sistema de https://www.anaconda.com/products/in...

<ol>
	<li>Katz, Y., Wang, E. T., Airoldi, E. M., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+design+of+RNA+sequencing+experiments+for+identifying+isoform+regulation.">Analysis and design of RNA sequencing experiments for identifying isoform regulation.</a> Nature Methods. 7 (12), 1009-1015 (2010).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+alternative+splicing+and+its+regulation.">Mechanism of alternative splicing and its regulation.</a> Biomedical Reports. 3 (2), 152-158 (2015).</li><li>Mehmood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+differential+splicing+tools+for+RNA-seq+studies.">Systematic evaluation of differential splicing tools for RNA-seq studies.</a> Briefings in Bioinformatics. 21 (6), 2052-2065 (2020).</li><li>Movassat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+between+alternative+polyadenylation+and+alternative+splicing+is+limited+to+terminal+introns.">Coupling between alternative polyadenylation and alternative splicing is limited to terminal introns.</a> RNA Biology. 13 (7), 646-655 (2016).</li><li>Tian, B., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+polyadenylation+of+mRNA+precursors.">Alternative polyadenylation of mRNA precursors.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (1), 18-30 (2017).</li><li>Herrmann, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PolyASite+2.0:+a+consolidated+atlas+of+polyadenylation+sites+from+3'+end+sequencing.">PolyASite 2.0: a consolidated atlas of polyadenylation sites from 3' end sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 48 (1), 174-179 (2020).</li><li>Liu, R., Loraine, A. E., Dickerson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparisons+of+computational+methods+for+differential+alternative+splicing+detection+using+RNA-seq+in+plant+systems.">Comparisons of computational methods for differential alternative splicing detection using RNA-seq in plant systems.</a> BMC Bioinformatics. 15 (1), 364 (2014).</li><li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis.">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biology. 17 (1), 13 (2016).</li><li>Anders, S., Reyes, A., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+differential+usage+of+exons+from+RNA-seq+data.">Detecting differential usage of exons from RNA-seq data.</a> Genome Research. 22 (10), 2008-2017 (2012).</li><li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies.">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), 47 (2014).</li><li>Shen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rMATS:+Robust+and+flexible+detection+of+differential+alternative+splicing+from+replicate+RNA-Seq+data.">rMATS: Robust and flexible detection of differential alternative splicing from replicate RNA-Seq data.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (51), 5593-5601 (2014).</li><li>Mehmood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+differential+splicing+tools+for+RNA-seq+studies.">Systematic evaluation of differential splicing tools for RNA-seq studies.</a> Briefings in bioinformatics. 21 (6), 2052-2065 (2020).</li><li>Kanitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+assessment+of+methods+for+the+computational+inference+of+transcript+isoform+abundance+from+RNA-seq+data.">Comparative assessment of methods for the computational inference of transcript isoform abundance from RNA-seq data.</a> Genome biology. 16 (1), 1-26 (2015).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Sznajder, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+MBNL1+induces+RNA+misprocessing+in+the+thymus+and+peripheral+blood.">Loss of MBNL1 induces RNA misprocessing in the thymus and peripheral blood.</a> Nature Communications. 11, 1-11 (2020).</li><li>Batra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+MBNL+leads+to+disruption+of+developmentally+regulated+alternative+polyadenylation+in+RNA-mediated+disease.">Loss of MBNL leads to disruption of developmentally regulated alternative polyadenylation in RNA-mediated disease.</a> Molecular Cell. 56 (2), 311-322 (2014).</li><li>Leinonen, R., Sugawara, H., Shumway, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sequence+read+archive.">The sequence read archive.</a> Nucleic acids research. 39, 19-21 (2010).</li><li>Tange, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> GNU parallel-the command-line power tool. 36, 42-47 (2011).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAR:+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner.">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li><li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=edgeR:+a+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data.">edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).</li><li>Robinson, M. D., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scaling+normalization+method+for+differential+expression+analysis+of+RNA-seq+data.">A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data.</a> Genome Biology. 11 (3), 25 (2010).</li><li>Veiga, D. F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=maser:+Mapping+Alternative+Splicing+Events+to+pRoteins.">maser: Mapping Alternative Splicing Events to pRoteins.</a> R package version 1.4.0. , (2019).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10 (13), 25 (2009).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Ram&#237;rez, F., D&#252;ndar, F., Diehl, S., Gr&#252;ning, B. A., Manke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=deepTools:+a+flexible+platform+for+exploring+deep-sequencing+data.">deepTools: a flexible platform for exploring deep-sequencing data.</a> Nucleic acids research. 42 (1), 187-191 (2014).</li><li>Merino, G. A., Conesa, A., Fern&#225;ndez, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+benchmarking+of+workflows+for+detecting+differential+splicing+and+differential+expression+at+isoform+level+in+human+RNA-seq+studies.">A benchmarking of workflows for detecting differential splicing and differential expression at isoform level in human RNA-seq studies.</a> Briefings in bioinformatics. 20 (2), 471-481 (2019).</li><li>Chhangawala, S., Rudy, G., Mason, C. E., Rosenfeld, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+read+length+on+quantification+of+differentially+expressed+genes+and+splice+junction+detection.">The impact of read length on quantification of differentially expressed genes and splice junction detection.</a> Genome biology. 16 (1), 1-10 (2015).</li><li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis.">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biol. 17, 13 (2016).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks.">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat Protoc. 7 (3), 562-578 (2012).</li><li>Li, B., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RSEM:+accurate+transcript+quantification+from+RNA-Seq+data+with+or+without+a+reference+genome.">RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome.</a> BMC Bioinformatics. 12, 323 (2011).</li><li>Bray, N. L., Pimentel, H., Melsted, P., Pachter, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-optimal+probabilistic+RNA-seq+quantification.">Near-optimal probabilistic RNA-seq quantification.</a> Nat Biotechnol. 34 (5), 525-527 (2016).</li></ol>

En este estudio, evaluamos enfoques basados en exones y eventos para detectar AS y APA en datos masivos de RNA-Seq y secuenciación final 3'. Los enfoques de EA basados en exones producen tanto una lista de exones expresados diferencialmente como una clasificación a nivel de gen ordenada por la significación estadística de la actividad general de empalme diferencial a nivel de gen (Tablas 1-2, 4-5). Para el paquete diffSplice, el uso diferencial se determina ajustando modelos lineales ponderados a niv...

RNA-seq ha sido ampliamente utilizado a lo largo de los años, generalmente para estimar la expresión génica diferencial y el descubrimiento de genes1. Además, también se puede utilizar para estimar el uso variable del nivel de exón debido a que los genes expresan diferentes isoformas, lo que contribuye a una mejor comprensión de la regulación génica a nivel post-transcripcional. La mayoría de los genes eucariotas generan diferentes isoformas mediante empalme alternativo (AS) para aumentar la diversidad de la expresión del ARNm. Los eventos AS se pueden dividir en diferentes patrones: salto de exones completos (SE) donde un exón ("casete") se elimina completamente de la transcripción junto con sus intrones flanqueantes; selección alternativa (donante) del sitio de empalme de 5' (A5SS) y selección alternativa 3' (aceptor) del sitio de empalme (A3SS) cuando dos o más sitios de empalme están presentes en cada extremo de un exón; retención de intrones (RI) cuando un intrón se retiene dentro de la transcripción de ARNm maduro y exclusión mutua del uso de exones (MXE) donde solo uno de los dos exones disponibles puede ser retenido a la vez 2,3. La poliadenilación alternativa (APA) también juega un papel importante en la regulación de la expresión génica utilizando sitios alternativos de poli (A) para generar múltiples isoformas de ARNm a partir de una sola transcripción4. La mayoría de los sitios de poliadenilación (pAs) se encuentran en la región 3' no traducida (3' UTRs), generando isoformas de ARNm con diversas longitudes 3' UTR. Como el 3' UTR es el eje central para reconocer elementos reguladores, diferentes longitudes 3' UTR pueden afectar la localización, estabilidad y traducción del ARNm5. Hay una clase de ensayos de secuenciación final 3' optimizados para detectar APA que difieren en los detalles del protocolo6. La canalización descrita aquí está diseñada para PolyA-seq, pero se puede adaptar para otros protocolos como se describe.
En este estudio, presentamos una tubería de métodos de análisis de exones diferenciales7,8 (Figura 1), que se pueden dividir en dos grandes categorías: basados en exones (DEXSeq9, diffSplice10) y basados en eventos (replicate Multivariate Analysis of Transcript Splicing (rMATS)11). Los métodos basados en exones comparan el cambio de pliegue a través de las condiciones de los exones individuales, contra una medida del cambio general del pliegue genético para llamar al uso de exones expresado diferencialmente, y a partir de eso calcular una medida a nivel de gen de la actividad de AS. Los métodos basados en eventos utilizan lecturas de unión de expansión exón-intrón para detectar y clasificar eventos de empalme específicos, como la omisión de exón o la retención de intrones, y distinguir estos tipos de AS en la salida3. Por lo tanto, estos métodos proporcionan vistas complementarias para un análisis completo de la EA12,13. Se seleccionaron DEXSeq (basado en el paquete DESeq214 DGE) y diffSplice (basado en el paquete Limma10 DGE) para el estudio, ya que se encuentran entre los paquetes más utilizados para el análisis de empalme diferencial. rMATS fue elegido como un método popular para el análisis basado en eventos. Otro método popular basado en eventos es MISO (mezcla de isoformas)1. Para APA adaptamos el enfoque basado en exones.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62636/62636fig01.jpg"> Figura 1. Pipeline de análisis. Diagrama de flujo de los pasos utilizados en el análisis. Los pasos incluyen: obtener los datos, realizar controles de calidad y alineación de lecturas seguidas de contar lecturas utilizando anotaciones para exones conocidos, intrones y sitios pA, filtrado para eliminar recuentos bajos y normalización. Los datos de PolyA-seq se analizaron para sitios de pA alternativos utilizando métodos diffSplice/DEXSeq, RNA-Seq a granel se analizaron para splicing alternativo a nivel de exón con métodos diffSplice/DEXseq, y los eventos de AS se analizaron con rMATS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62636/62636fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Los datos de RNA-seq utilizados en este estudio fueron adquiridos de Gene Expression Omnibus (GEO) (GSE138691)15. Utilizamos datos de ARN-seq de ratón de este estudio con dos grupos de condiciones: tipo salvaje (WT) y knockout tipo 1 similar a Muscleblind (Mbnl1 KO) con tres réplicas cada uno. Para demostrar el análisis diferencial de uso del sitio de poliadenilación, obtuvimos datos de PolyA-seq de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) (GEO Accesion GSE60487)16. Los datos tienen cuatro grupos de condiciones: tipo salvaje (WT), tipo ciego muscular tipo 1 / tipo 2 doble knockout (Mbnl1/2 DKO), Mbnl 1/2 DKO con derribo Mbnl3 (KD) y Mbnl1/2 DKO con control Mbnl3 (Ctrl). Cada grupo de condición consta de dos réplicas.
<table border="1" fo:font-size="5px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Adhesión al GEO</td>
			<td>Número de ejecución de SRA</td>
			<td>Nombre de la muestra</td>
			<td>Condición</td>
			<td>Replicar</td>
			<td>Tejido</td>
			<td>Secuenciación</td>
			<td>Longitud de lectura</td>
		</tr><tr><td rowspan="6">RNA-Seq</td>
			<td>GSM4116218</td>
			<td>SRR10261601</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_1</td>
			<td>Mbnl1 nocaut</td>
			<td>Rep 1</td>
			<td>Timo</td>
			<td>Extremo emparejado</td>
			<td>100 pb</td>
		</tr><tr><td>GSM4116219</td>
			<td>SRR10261602</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_2</td>
			<td>Mbnl1 nocaut</td>
			<td>Rep 2</td>
			<td>Timo</td>
			<td>Extremo emparejado</td>
			<td>100 pb</td>
		</tr><tr><td>GSM4116220</td>
			<td>SRR10261603</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_3</td>
			<td>Mbnl1 nocaut</td>
			<td>Rep 3</td>
			<td>Timo</td>
			<td>Extremo emparejado</td>
			<td>100 pb</td>
		</tr><tr><td>GSM4116221</td>
			<td>SRR10261604</td>
			<td>WT_Thymus_1</td>
			<td>Tipo salvaje</td>
			<td>Rep 1</td>
			<td>Timo</td>
			<td>Extremo emparejado</td>
			<td>100 pb</td>
		</tr><tr><td>GSM4116222</td>
			<td>SRR10261605</td>
			<td>WT_Thymus_2</td>
			<td>Tipo salvaje</td>
			<td>Rep 2</td>
			<td>Timo</td>
			<td>Extremo emparejado</td>
			<td>100 pb</td>
		</tr><tr><td>GSM4116223</td>
			<td>SRR10261606</td>
			<td>WT_Thymus_3</td>
			<td>Tipo salvaje</td>
			<td>Rep 3</td>
			<td>Timo</td>
			<td>Extremo emparejado</td>
			<td>100 pb</td>
		</tr><tr><td rowspan="8">3P-seq</td>
			<td>GSM1480973</td>
			<td>SRR1553129</td>
			<td>WT_1</td>
			<td>Tipo salvaje (WT)</td>
			<td>Rep 1</td>
			<td>Fibroblastos embrionarios de ratón (MEF)</td>
			<td>Extremo único</td>
			<td>40 pb</td>
		</tr><tr><td>GSM1480974</td>
			<td>SRR1553130</td>
			<td>WT_2</td>
			<td>Tipo salvaje (WT)</td>
			<td>Rep 2</td>
			<td>Fibroblastos embrionarios de ratón (MEF)</td>
			<td>Extremo único</td>
			<td>40 pb</td>
		</tr><tr><td>GSM1480975</td>
			<td>SRR1553131</td>
			<td>DKO_1</td>
			<td>Mbnl 1/2 doble knockout (DKO)</td>
			<td>Rep 1</td>
			<td>Fibroblastos embrionarios de ratón (MEF)</td>
			<td>Extremo único</td>
			<td>40 pb</td>
		</tr><tr><td>GSM1480976</td>
			<td>SRR1553132</td>
			<td>DKO_2</td>
			<td>Mbnl 1/2 doble knockout (DKO)</td>
			<td>Rep 2</td>
			<td>Fibroblastos embrionarios de ratón (MEF)</td>
			<td>Extremo único</td>
			<td>40 pb</td>
		</tr><tr><td>GSM1480977</td>
			<td>SRR1553133</td>
			<td>DKOsiRNA_1</td>
			<td>Mbnl 1/2 doble knockout con Mbnl 3 siRNA (KD)</td>
			<td>Rep 1</td>
			<td>Fibroblastos embrionarios de ratón (MEF)</td>
			<td>Extremo único</td>
			<td>40 pb</td>
		</tr><tr><td>GSM1480978</td>
			<td>SRR1553134</td>
			<td>DKOsiRNA_2</td>
			<td>Mbnl 1/2 doble knockout con Mbnl 3 siRNA (KD)</td>
			<td>Rep 2</td>
			<td>Fibroblastos embrionarios de ratón (MEF)</td>
			<td>Extremo único</td>
			<td>36 pb</td>
		</tr><tr><td>GSM1480979</td>
			<td>SRR1553135</td>
			<td>DKONTsiRNA_1</td>
			<td>Mbnl 1/2 doble knockout con siRNA no dirigido (Ctrl)</td>
			<td>Rep 1</td>
			<td>Fibroblastos embrionarios de ratón (MEF)</td>
			<td>Extremo único</td>
			<td>40 pb</td>
		</tr><tr><td>GSM1480980</td>
			<td>SRR1553136</td>
			<td>DKONTsiRNA_2</td>
			<td>Mbnl 1/2 doble knockout con siRNA no dirigido (Ctrl)</td>
			<td>Rep 2</td>
			<td>Fibroblastos embrionarios de ratón (MEF)</td>
			<td>Extremo único</td>
			<td>40 pb</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1. Resumen de los conjuntos de datos RNA-Seq y PolyA-seq utilizados para el análisis.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Not relevent for computational study</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of alternative splicing and polyadenylation in rna-seq data

Además del análisis típico de RNA-Seq para medir la expresión génica diferencial (DGE) en condiciones experimentales / biológicas, los datos de RNA-seq también se pueden utilizar para explorar otros mecanismos reguladores complejos a nivel de exón. El empalme alternativo y la poliadenilación juegan un papel crucial en la diversidad funcional de un gen al generar diferentes isoformas para regular la expresión génica a nivel post-transcripcional, y limitar los análisis a todo el nivel del gen puede pasar por alto esta importante capa reguladora. Aquí, demostramos análisis detallados paso a paso para la identificación y visualización del uso diferencial del exón y el sitio de poliadenilación en todas las condiciones, utilizando Bioconductor y otros paquetes y funciones, incluidos DEXSeq, diffSplice del paquete Limma y rMATS.

Después de ejecutar el flujo de trabajo paso a paso anterior, los resultados del análisis AS y APA y los resultados representativos se presentan en forma de tablas y gráficos de datos, generados de la siguiente manera.
COMO: El resultado principal del análisis AS (Tabla suplementaria 1 para diffSplice; Tabla 2 para DEXSeq) es una lista de exones que muestran el uso diferencial entre condiciones, y una lista de genes que muestran una act...

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Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data

El empalme alternativo (AS) y la poliadenilación alternativa (APA) amplían la diversidad de isoformas de transcripción y sus productos. Aquí, describimos protocolos bioinformáticos para analizar RNA-seq a granel y ensayos de secuenciación final 3' para detectar y visualizar AS y APA que varían según las condiciones experimentales.

Identificación de empalme alternativo y poliadenilación en datos de RNA-seq

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also ...

Este protocolo proporciona una comprensión integral de las isoformas génicas generadas por empalme alternativo y poliadenilación al proporcionar un flujo de trabajo paso a paso para identificar sitios de empalme diferencial, exones expresados diferencialmente y poli(A)sitios. La principal ventaja de este protocolo es que evalúa métodos basados en exones y basados en eventos para estudiar splicing alternativo. También aplica el método basado en exones para estudiar la poliadenilación alternativa.Se han proporcionado los archivos R Markdown que incluyen los códigos y notas para el análisis AS y AP. Sería recomendable seguir los pasos en el archivo R Markdown y llegar a la nota para cada paso cuidadosamente. Para identificar el empalme diferencial mediante diffSplice de limma, siga el archivo de bloc de notas de R.Prepare los archivos de entrada como se describe en el texto manuscrito. Asegúrese de que los pasos del uno al tres en el manuscrito se hayan seguido secuencialmente para preparar los archivos de entrada antes de continuar. Comience cargando las bibliotecas necesarias.Para realizar un filtrado no específico, primero extraiga la matriz de recuentos de lectura obtenidos previamente y cree una lista de entidades utilizando la función DGEList del paquete edgeR, donde las filas representan genes y las columnas representan muestras. A continuación, transforme los datos de escala sin procesar a recuentos por millón utilizando la función CPM del paquete edgeR y mantenga exones con recuentos superiores a un umbral configurable. Este conjunto de datos contiene seis ejemplos.Por lo tanto, el CPM se establece en más de una y al menos tres muestras de seis. Normalice los recuentos entre muestras con la función calcNormFactors del paquete edgeR utilizando la media recortada de los valores M. Esta función calculará factores de escala para ajustar el tamaño de la biblioteca.Utilice la tabla de ejemplo generada previamente para crear la matriz de diseño para definir las condiciones experimentales de cada muestra. Ejecute la función voom del paquete limma para procesar los datos de secuenciación de ARN para estimar la varianza. Esta función generará pesos de precisión para corregir el ruido de conteo de Poisson y transformar los recuentos de nivel de exón para registrar dos recuentos por millón o logCPM.Ejecute la función lmfit para ajustar los modelos lineales a los datos de expresión de cada exón. A continuación, ejecute la función eBayes para calcular estadísticas empíricas para que el modelo ajustado detecte la expresión diferencial del exón. Definir una matriz de contraste para las comparaciones experimentales de interés.Usa los contrastes. Función de ajuste para obtener coeficientes y errores estándar para cada par de comparaciones. Ejecute diffSplice en el modelo ajustado para probar las diferencias en el uso de exones de genes entre wild type y knockout.Explore los resultados mejor clasificados utilizando la función topSplice donde una prueba igual a t da una clasificación de exones AS y una prueba igual a simes da una clasificación de genes. Ejecute la función plotSplice para trazar los resultados. Al poner el gen de interés en el argumento de la identificación del gen, los puntos rojos muestran los exones expresados diferencialmente.Genere un diagrama de volcán utilizando el paquete de bioconductores EnhancedVolcano para exhibir los exones expresados diferencialmente. Para usar rMATS, asegúrese de que la última versión de rMATS versión 4.1.1 esté instalada usando conda o GitHub en el directorio de trabajo. Vaya a la carpeta que contiene los archivos bam obtenidos después de la asignación.Prepare los archivos de texto según lo requiera rMATS para las dos condiciones de copiar el nombre de los archivos bam y su ruta separada por una coma. Ejecute rmas. PY utilizando los dos archivos de texto de entrada generados que describen la ruta de acceso de los archivos BAM y la anotación.GTF obtenido previamente. Esto genera una carpeta de salida rmats_out que contiene archivos de texto que describen estadísticas, incluidos los valores P y los niveles de inclusión para cada evento de empalme por separado. Utilice el máser del paquete bioconductor para explorar los resultados de rMATS.Cargue los archivos de texto de conteo de uniones y exones con la extensión JCEC en el objeto máser e incluya al menos cinco lecturas promedio por evento de empalme para filtrar el resultado en función de la cobertura. Para visualizar los resultados de rMATS, primero ejecute la función topEvents desde el paquete máser, seleccionando los eventos de empalme significativos con una tasa de descubrimiento falso del 10% y un cambio mínimo del 10% en el porcentaje empalmado o PSI. Verifique los eventos genéticos para genes individuales de interés y trace los valores de PSI para cada evento de empalme de ese gen.Genere un diagrama de volcán especificando el tipo de evento. Utilice los resultados de los eventos de empalme obtenidos con rMATS en forma de archivos de texto para generar gráficos de sashimi utilizando el paquete rmats2sashimiplot. La gráfica de sashimi muestra un evento de exón omitido en el gen Wnk1.Cada fila representa una muestra de RNA-seq, tres réplicas de tipo salvaje y knockout Mbnl1. La altura muestra la cobertura de lectura en RPKM y los arcos de conexión representan lecturas de unión a través de exones. La parte inferior muestra isoformas alternativas anotadas del modelo genético.Se puede observar un cambio sustancial en el pliegue y una fuerte evidencia estadística de diferencias genuinas en los genes ubicados en los cuadrantes superior izquierdo o derecho de los diagramas de volcanes obtenidos utilizando diffSplice y DEXSeq. Se encontró que un exón de casete variaba entre diferentes condiciones para el gen Wnk1. La gráfica de uso de exones diferenciales mostró evidencia de empalme diferencial en cinco sitios de exón cerca de Wnk1.6.45, con los exones resaltados en rosa probablemente empalmados en muestras knockout de Mbnl1 en comparación con el tipo salvaje.La gráfica del volcán de genes que se empalman alternativamente ayudó a distinguir entre los genes que fueron excluidos del tipo salvaje y los que se incluyeron en el tipo salvaje. Los tipos de eventos de empalme SE, A5SS, A3SS, MXE y RI se visualizaron utilizando gráficos de sashimi de los principales genes significativos de esos eventos. La actividad diferencial de APA en tres regiones principales no traducidas de genes se observó utilizando gráficos de volcanes.Los resultados de uso del sitio de PA significativamente diferenciales adquiridos de diferentes canalizaciones se visualizaron utilizando el gráfico de eventos. Se puede observar un cambio distal a proximal significativo del uso del sitio PA en knockouts dobles en ambos genes FOSL1 y Papola. La cobertura media en las regiones flanqueantes ancladas en sitios de escisión de PA conocidos a nivel de todo el genoma se determinó utilizando una gráfica de diagnóstico.Asegúrese de que los parámetros, como la información tranespecífica y permitir la superposición múltiple, se utilicen correctamente al generar métricas de conteo. El ajuste del modelo lineal y la generación de pares de contraste son importantes para una comparación adecuada. Para rMATS, asegúrese de que todos los parámetros estén configurados correctamente de acuerdo con sus datos antes de ejecutar el comando.Los genes obtenidos de la actividad de empalme diferencial podrían usarse para realizar análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes. Otra herramienta llamada MISO podría usarse para un análisis adicional basado en eventos.

Research

JoVE Journal

Biology

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

RNA-seq Análisis de transcriptomes en trombina tratamiento y de control pulmonar humana células endoteliales microvasculares

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Investigación

Biología

Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

El agotamiento de ARN ribosomal de metagenómica intestino del mosquito RNA-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Culturas alternativas para Pluripotentes Stem Cell Production, mantenimiento y análisis genético

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Detección de splicing alternativo Durante epitelial-mesenquimal de transición

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Un Experimental y Protocolo Bioinformática para análisis de ARN-ss de fotoperiódica diapausa en el Mosquito Tigre Asiático,<em&gt; Aedes albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

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La rápida identificación de químicos interacciones genéticas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Methods to Discover Alternative Promoter Usage and Transcriptional Regulation of Murine Bcrp1

Métodos para descubrir uso promotor alternativo y la regulación transcripcional de murino BCRP1

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually ...

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

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Identificación de nuevos reguladores de la transpiración de plantas mediante el cribado térmico de imágenes a gran escala en Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq

Una Tubería Bioinformática Para La Investigación De La Evolución Molecular Y La Expresión Génica Usando RNA-seq

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus ...