Name: identification of alternative splicing and polyadenylation in rna-seq data
Uploaded: 2021-06-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data at JoVE.com

Bu çalışma, Avustralya Araştırma Konseyi (ARC) Future Fellowship (FT16010043) ve ANU Futures Scheme tarafından desteklenmiştir.

1. Analizde kullanılan aletlerin ve R paketlerinin kurulumu
<ol><li>Conda, paketlerin tüm platformlardaki bağımlılıklarıyla birlikte kolayca kurulmasını sağlayan popüler ve esnek bir paket yöneticisidir. Analiz için gerekli araçları/paketleri yüklemek için kullanılabilecek 'conda'yı yüklemek için 'Anaconda' (conda paket yöneticisi) kullanın.</li>
	<li>https://www.anaconda.com/products/individual#Downloads'dan sistem gereksinimlerine göre 'Anaconda'yı indirin ve grafik yükleyicid...

<ol>
	<li>Katz, Y., Wang, E. T., Airoldi, E. M., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+design+of+RNA+sequencing+experiments+for+identifying+isoform+regulation.">Analysis and design of RNA sequencing experiments for identifying isoform regulation.</a> Nature Methods. 7 (12), 1009-1015 (2010).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+alternative+splicing+and+its+regulation.">Mechanism of alternative splicing and its regulation.</a> Biomedical Reports. 3 (2), 152-158 (2015).</li><li>Mehmood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+differential+splicing+tools+for+RNA-seq+studies.">Systematic evaluation of differential splicing tools for RNA-seq studies.</a> Briefings in Bioinformatics. 21 (6), 2052-2065 (2020).</li><li>Movassat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+between+alternative+polyadenylation+and+alternative+splicing+is+limited+to+terminal+introns.">Coupling between alternative polyadenylation and alternative splicing is limited to terminal introns.</a> RNA Biology. 13 (7), 646-655 (2016).</li><li>Tian, B., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+polyadenylation+of+mRNA+precursors.">Alternative polyadenylation of mRNA precursors.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (1), 18-30 (2017).</li><li>Herrmann, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PolyASite+2.0:+a+consolidated+atlas+of+polyadenylation+sites+from+3'+end+sequencing.">PolyASite 2.0: a consolidated atlas of polyadenylation sites from 3' end sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 48 (1), 174-179 (2020).</li><li>Liu, R., Loraine, A. E., Dickerson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparisons+of+computational+methods+for+differential+alternative+splicing+detection+using+RNA-seq+in+plant+systems.">Comparisons of computational methods for differential alternative splicing detection using RNA-seq in plant systems.</a> BMC Bioinformatics. 15 (1), 364 (2014).</li><li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis.">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biology. 17 (1), 13 (2016).</li><li>Anders, S., Reyes, A., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+differential+usage+of+exons+from+RNA-seq+data.">Detecting differential usage of exons from RNA-seq data.</a> Genome Research. 22 (10), 2008-2017 (2012).</li><li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies.">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), 47 (2014).</li><li>Shen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rMATS:+Robust+and+flexible+detection+of+differential+alternative+splicing+from+replicate+RNA-Seq+data.">rMATS: Robust and flexible detection of differential alternative splicing from replicate RNA-Seq data.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (51), 5593-5601 (2014).</li><li>Mehmood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+differential+splicing+tools+for+RNA-seq+studies.">Systematic evaluation of differential splicing tools for RNA-seq studies.</a> Briefings in bioinformatics. 21 (6), 2052-2065 (2020).</li><li>Kanitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+assessment+of+methods+for+the+computational+inference+of+transcript+isoform+abundance+from+RNA-seq+data.">Comparative assessment of methods for the computational inference of transcript isoform abundance from RNA-seq data.</a> Genome biology. 16 (1), 1-26 (2015).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Sznajder, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+MBNL1+induces+RNA+misprocessing+in+the+thymus+and+peripheral+blood.">Loss of MBNL1 induces RNA misprocessing in the thymus and peripheral blood.</a> Nature Communications. 11, 1-11 (2020).</li><li>Batra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+MBNL+leads+to+disruption+of+developmentally+regulated+alternative+polyadenylation+in+RNA-mediated+disease.">Loss of MBNL leads to disruption of developmentally regulated alternative polyadenylation in RNA-mediated disease.</a> Molecular Cell. 56 (2), 311-322 (2014).</li><li>Leinonen, R., Sugawara, H., Shumway, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sequence+read+archive.">The sequence read archive.</a> Nucleic acids research. 39, 19-21 (2010).</li><li>Tange, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> GNU parallel-the command-line power tool. 36, 42-47 (2011).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAR:+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner.">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li><li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=edgeR:+a+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data.">edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).</li><li>Robinson, M. D., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scaling+normalization+method+for+differential+expression+analysis+of+RNA-seq+data.">A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data.</a> Genome Biology. 11 (3), 25 (2010).</li><li>Veiga, D. F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=maser:+Mapping+Alternative+Splicing+Events+to+pRoteins.">maser: Mapping Alternative Splicing Events to pRoteins.</a> R package version 1.4.0. , (2019).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10 (13), 25 (2009).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Ram&#237;rez, F., D&#252;ndar, F., Diehl, S., Gr&#252;ning, B. A., Manke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=deepTools:+a+flexible+platform+for+exploring+deep-sequencing+data.">deepTools: a flexible platform for exploring deep-sequencing data.</a> Nucleic acids research. 42 (1), 187-191 (2014).</li><li>Merino, G. A., Conesa, A., Fern&#225;ndez, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+benchmarking+of+workflows+for+detecting+differential+splicing+and+differential+expression+at+isoform+level+in+human+RNA-seq+studies.">A benchmarking of workflows for detecting differential splicing and differential expression at isoform level in human RNA-seq studies.</a> Briefings in bioinformatics. 20 (2), 471-481 (2019).</li><li>Chhangawala, S., Rudy, G., Mason, C. E., Rosenfeld, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+read+length+on+quantification+of+differentially+expressed+genes+and+splice+junction+detection.">The impact of read length on quantification of differentially expressed genes and splice junction detection.</a> Genome biology. 16 (1), 1-10 (2015).</li><li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis.">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biol. 17, 13 (2016).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks.">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat Protoc. 7 (3), 562-578 (2012).</li><li>Li, B., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RSEM:+accurate+transcript+quantification+from+RNA-Seq+data+with+or+without+a+reference+genome.">RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome.</a> BMC Bioinformatics. 12, 323 (2011).</li><li>Bray, N. L., Pimentel, H., Melsted, P., Pachter, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-optimal+probabilistic+RNA-seq+quantification.">Near-optimal probabilistic RNA-seq quantification.</a> Nat Biotechnol. 34 (5), 525-527 (2016).</li></ol>

Bu çalışmada, toplu RNA-Seq ve 3' uç dizileme verilerinde AS ve APA'yı saptamak için ekzon tabanlı ve olay tabanlı yaklaşımlar değerlendirildi. Ekzon tabanlı AS yaklaşımları, hem diferansiyel olarak eksprese edilen ekzonların bir listesini hem de genel gen seviyesi diferansiyel ekleme aktivitesinin istatistiksel önemine göre sıralanmış bir gen seviyesi sıralaması üretir (Tablo 1-2, 4-5). Diferansiyel kullanım, bir ekzonun diferansiyel log kıvrım değişimini aynı gen içindeki...

RNA-seq, yıllar boyunca tipik olarak diferansiyel gen ekspresyonunu ve gen keşfini tahmin etmek için yaygın olarak kullanılmıştır1. Ek olarak, farklı izoformları ifade eden gen nedeniyle değişen ekzon seviyesi kullanımını tahmin etmek için de kullanılabilir, böylece transkripsiyon sonrası seviyede gen düzenlemesinin daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunur. Ökaryotik genlerin çoğunluğu, mRNA ekspresyonunun çeşitliliğini arttırmak için alternatif ekleme (AS) ile farklı izoformlar üretir. AS olayları farklı kalıplara ayrılabilir: bir ("kaset") ekzonun yan tarafındaki intronlarla birlikte transkriptten tamamen çıkarıldığı tam ekzonların (SE) atlanması; ekzonun her iki ucunda iki veya daha fazla ekleme bölgesi bulunduğunda alternatif (donör) 5' ekleme yeri seçimi (A5SS) ve alternatif 3' (alıcı) ekleme yeri seçimi (A3SS); Bir intron olgun mRNA transkriptinde tutulduğunda intronların (RI) tutulması ve mevcut iki ekzondan sadece birininbir seferde tutulabildiği ekzon kullanımının (MXE) karşılıklı dışlanması 2,3. Alternatif poliadenilasyon (APA), tek bir transkript4'ten çoklu mRNA izoformları üretmek için alternatif poli (A) bölgeleri kullanarak gen ekspresyonunun düzenlenmesinde de önemli bir rol oynar. Çoğu poliadenilasyon bölgesi (pAs), 3' çevrilmemiş bölgede (3' UTR'ler) bulunur ve çeşitli 3' UTR uzunluklarına sahip mRNA izoformları üretir. 3' UTR, düzenleyici unsurları tanımak için merkezi merkez olduğundan, farklı 3' UTR uzunlukları mRNA lokalizasyonunu, kararlılığını ve translasyonunu etkileyebilir5. Protokol6'nın ayrıntılarında farklılık gösteren APA'yı tespit etmek için optimize edilmiş bir 3' uç sıralama tahlilleri sınıfı vardır. Burada açıklanan boru hattı PolyA-seq için tasarlanmıştır, ancak açıklandığı gibi diğer protokoller için uyarlanabilir.
Bu çalışmada, ekzon bazlı (DEXSeq9, diffSplice10) ve olay tabanlı (Multivariate Analysis of Transcript Splicing (rMATS)11) olmak üzere iki geniş kategoriye ayrılabilen diferansiyel ekzon analiz yöntemleri 7,8 (Şekil 1) boru hattını sunuyoruz. Ekzon tabanlı yöntemler, bireysel ekzonların koşulları arasındaki kıvrım değişimini, farklı şekilde ifade edilen ekzon kullanımını çağırmak için genel gen kıvrım değişiminin bir ölçüsüyle karşılaştırır ve bundan AS aktivitesinin gen düzeyinde bir ölçüsünü hesaplar. Olay tabanlı yöntemler, ekzon atlama veya intronların tutulması gibi belirli ekleme olaylarını algılamak ve sınıflandırmak için ekzon intronunu kapsayan bağlantı okumalarını kullanır ve çıktı3'teki bu AS türlerini ayırt eder. Bu nedenle, bu yöntemler AS12,13'ün tam bir analizi için tamamlayıcı görüşler sağlar. Diferansiyel ekleme analizi için en yaygın kullanılan paketler arasında yer aldıkları için çalışma için DEXSeq (DESeq214 DGE paketine dayanarak) ve diffSplice (Limma10 DGE paketine dayanarak) seçtik. rMATS, olay tabanlı analiz için popüler bir yöntem olarak seçildi. Bir başka popüler olay tabanlı yöntem MISO (İzoform Karışımı)1'dir. APA için ekzon tabanlı yaklaşımı uyarlıyoruz.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62636/62636fig01.jpg"> Şekil 1. Analiz işlem hattı. Analizde kullanılan adımların akış şeması. Adımlar şunları içerir: verileri elde etmek, kalite kontrolleri yapmak ve okuma hizalaması, ardından bilinen ekzonlar, intronlar ve pA siteleri için ek açıklamalar kullanarak okumaları saymak, düşük sayıları kaldırmak için filtreleme ve normalleştirme. PolyA-seq verileri diffSplice/DEXSeq yöntemleri kullanılarak alternatif pA bölgeleri için, bulk RNA-Seq diffSplice/DEXseq yöntemleri ile ekzon düzeyinde alternatif ekleme için ve AS olayları rMATS ile analiz edilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62636/62636fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Bu araştırmada kullanılan RNA-seq verileri, Gen İfade Omnibus'undan (GEO) (GSE138691)15 elde edilmiştir. Bu çalışmadan elde edilen fare RNA-seq verilerini iki koşul grubuyla kullandık: vahşi tip (WT) ve her biri üç kopya ile Kas körü benzeri tip 1 nakavt (Mbnl1 KO). Diferansiyel poliadenilasyon alanı kullanım analizini göstermek için, fare embriyo fibroblastları (MEF'ler) PoliA-seq verilerini elde ettik (GEO Katılımı GSE60487)16. Verilerin dört koşul grubu vardır: Wild-type (WT), Kas körü benzeri tip1/tip 2 çift nakavt (Mbnl1/2 DKO), Mbnl3 knockdown (KD) ile Mbnl 1/2 DKO ve Mbnl3 kontrollü Mbnl1/2 DKO (Ctrl). Her koşul grubu iki çoğaltmadan oluşur.
<table border="1" fo:font-size="5px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>GEO Katılımı</td>
			<td>SRA Çalıştırma numarası</td>
			<td>Örnek adı</td>
			<td>Koşul</td>
			<td>Çoğaltmak</td>
			<td>Doku</td>
			<td>Sıralama</td>
			<td>Okuma uzunluğu</td>
		</tr><tr><td rowspan="6">RNA-Seq</td>
			<td>GSM4116218</td>
			<td>SRR10261601</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_1</td>
			<td>Mbnl1 nakavt</td>
			<td>Temsilci 1</td>
			<td>Timus</td>
			<td>Eşleştirilmiş uç</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM4116219</td>
			<td>SRR10261602</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_2</td>
			<td>Mbnl1 nakavt</td>
			<td>Temsilci 2</td>
			<td>Timus</td>
			<td>Eşleştirilmiş uç</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM4116220 göster</td>
			<td>SRR10261603</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_3</td>
			<td>Mbnl1 nakavt</td>
			<td>Temsilci 3</td>
			<td>Timus</td>
			<td>Eşleştirilmiş uç</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM4116221</td>
			<td>SRR10261604</td>
			<td>WT_Thymus_1</td>
			<td>Vahşi tip</td>
			<td>Temsilci 1</td>
			<td>Timus</td>
			<td>Eşleştirilmiş uç</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM4116222</td>
			<td>SRR10261605</td>
			<td>WT_Thymus_2</td>
			<td>Vahşi tip</td>
			<td>Temsilci 2</td>
			<td>Timus</td>
			<td>Eşleştirilmiş uç</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM4116223</td>
			<td>SRR10261606</td>
			<td>WT_Thymus_3</td>
			<td>Vahşi tip</td>
			<td>Temsilci 3</td>
			<td>Timus</td>
			<td>Eşleştirilmiş uç</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td rowspan="8">3P-Seks</td>
			<td>GSM1480973</td>
			<td>SRR1553129</td>
			<td>WT_1</td>
			<td>Vahşi tip (WT)</td>
			<td>Temsilci 1</td>
			<td>Fare embriyonik Fibroblastları (MEF'ler)</td>
			<td>Tek uçlu</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480974</td>
			<td>SRR1553130</td>
			<td>WT_2</td>
			<td>Vahşi tip (WT)</td>
			<td>Temsilci 2</td>
			<td>Fare embriyonik Fibroblastları (MEF'ler)</td>
			<td>Tek uçlu</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480975</td>
			<td>SRR1553131</td>
			<td>DKO_1</td>
			<td>Mbnl 1/2 çift nakavt (DKO)</td>
			<td>Temsilci 1</td>
			<td>Fare embriyonik Fibroblastları (MEF'ler)</td>
			<td>Tek uçlu</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480976</td>
			<td>SRR1553132</td>
			<td>DKO_2</td>
			<td>Mbnl 1/2 çift nakavt (DKO)</td>
			<td>Temsilci 2</td>
			<td>Fare embriyonik Fibroblastları (MEF'ler)</td>
			<td>Tek uçlu</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480977 göster</td>
			<td>SRR1553133</td>
			<td>DKOsiRNA_1</td>
			<td>Mbnl 3 siRNA (KD) ile Mbnl 1/2 çift nakavt</td>
			<td>Temsilci 1</td>
			<td>Fare embriyonik Fibroblastları (MEF'ler)</td>
			<td>Tek uçlu</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480978</td>
			<td>SRR1553134</td>
			<td>DKOsiRNA_2</td>
			<td>Mbnl 3 siRNA (KD) ile Mbnl 1/2 çift nakavt</td>
			<td>Temsilci 2</td>
			<td>Fare embriyonik Fibroblastları (MEF'ler)</td>
			<td>Tek uçlu</td>
			<td>36 bg</td>
		</tr><tr><td>GSM1480979</td>
			<td>SRR1553135</td>
			<td>DKONTsiRNA_1</td>
			<td>Mbnl 1/2 çift nakavt, hedeflemeyen siRNA (Ctrl) ile</td>
			<td>Temsilci 1</td>
			<td>Fare embriyonik Fibroblastları (MEF'ler)</td>
			<td>Tek uçlu</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480980</td>
			<td>SRR1553136</td>
			<td>DKONTsiRNA_2</td>
			<td>Mbnl 1/2 çift nakavt, hedeflemeyen siRNA (Ctrl) ile</td>
			<td>Temsilci 2</td>
			<td>Fare embriyonik Fibroblastları (MEF'ler)</td>
			<td>Tek uçlu</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1. Analiz için kullanılan RNA-Seq ve PolyA-seq veri setlerinin özeti.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Not relevent for computational study</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of alternative splicing and polyadenylation in rna-seq data

Deneysel / biyolojik koşullar boyunca diferansiyel gen ekspresyonunu (DGE) ölçmek için RNA-Seq'in tipik analizinin yanı sıra, RNA-seq verileri ekzon seviyesindeki diğer karmaşık düzenleyici mekanizmaları keşfetmek için de kullanılabilir. Alternatif ekleme ve poliadenilasyon, transkripsiyon sonrası seviyede gen ekspresyonunu düzenlemek için farklı izoformlar üreterek bir genin fonksiyonel çeşitliliğinde çok önemli bir rol oynar ve analizleri tüm gen seviyesine sınırlamak bu önemli düzenleyici katmanı kaçırabilir. Burada, Bioconductor ve DEXSeq, Limma paketinden diffSplice ve rMATS dahil olmak üzere diğer paketleri ve fonksiyonları kullanarak, koşullar arasında diferansiyel ekzon ve poliadenilasyon sahası kullanımının tanımlanması ve görselleştirilmesi için ayrıntılı adım adım analizler gösteriyoruz.

Yukarıdaki adım adım iş akışını çalıştırdıktan sonra, AS ve APA analiz çıktıları ve temsili sonuçlar, aşağıdaki gibi oluşturulan tablolar ve veri grafikleri şeklindedir.
GİBİ: AS analizinin ana çıktısı (diffSplice için Ek Tablo 1; DEXSeq için Tablo 2), koşullar arasında diferansiyel kullanımı gösteren ekzonların bir listesi ve istatistiksel anlamlılığa göre sıralanmış, bir veya daha fazla kurucu e...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data at JoVE.com

Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data

Alternatif ekleme (AS) ve alternatif poliadenilasyon (APA), transkript izoformlarının ve ürünlerinin çeşitliliğini genişletir. Burada, deneysel koşullar arasında değişen AS ve APA'yı tespit etmek ve görselleştirmek için toplu RNA-seq ve 3' uç dizileme testlerini analiz etmek için biyoinformatik protokolleri açıklıyoruz.

RNA-seq Verilerinde Alternatif Ekleme ve Poliadenilasyonun Tanımlanması

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also ...

Bu protokol, diferansiyel ekleme bölgelerini, diferansiyel olarak eksprese edilen ekzonları ve poli (A) bölgelerini tanımlamak için adım adım bir iş akışı sağlayarak alternatif ekleme ve poliadenilasyon tarafından üretilen gen izoformlarının kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını sağlar. Bu protokolün temel avantajı, alternatif eklemeyi incelemek için hem ekzon tabanlı hem de olay tabanlı yöntemleri değerlendirmesidir. Ayrıca alternatif poliadenilasyonu incelemek için ekzon bazlı yöntem uygular.AS ve AP analizi için kodları ve notları içeren R Markdown dosyaları sağlanmıştır. R Markdown dosyasındaki adımları izlemeniz ve her adım için nota dikkatlice ulaşmanız önerilir. Limma'dan diffSplice kullanarak diferansiyel eklemeyi tanımlamak için R not defteri dosyasını izleyin.Giriş dosyalarını metin makalesinde açıklandığı şekilde hazırlayın. Daha fazla ilerlemeden önce giriş dosyalarını hazırlamak için makaledeki bir ila üç arasındaki adımların sırayla takip edildiğinden emin olun. Gerekli kütüphaneleri yükleyerek başlayın.Spesifik olmayan filtreleme gerçekleştirmek için, önce daha önce elde edilen okuma sayılarının matrisini ayıklayın ve satırların genleri ve sütunların örnekleri temsil ettiği edgeR paketinden DGEList işlevini kullanarak özelliklerin bir listesini oluşturun. Ardından, edgeR paketindeki BGBM işlevini kullanarak verileri ham ölçekten milyon başına sayıma dönüştürün ve ayarlanabilir bir eşiğin üzerinde sayımlara sahip ekzonları saklayın. Bu veri kümesi altı örnek içerir.Bu nedenle, BGBM birden büyük ve altıdan en az üç örnek olarak ayarlanır. M değerlerinin Kırpılmış Ortalama değerini kullanarak edgeR paketinden calcNormFactors işleviyle numuneler arasındaki sayımları normalleştirin. Bu işlev, kitaplık boyutlarını ayarlamak için ölçeklendirme faktörlerini hesaplar.Her numunenin deneysel koşullarını tanımlamak üzere tasarım matrisini oluşturmak için önceden oluşturulmuş örnek tabloyu kullanın. Varyansı tahmin etmek üzere RNA dizileme verilerini işlemek için limma paketinin voom işlevini çalıştırın. Bu işlev, Poisson sayım gürültüsünü düzeltmek için hassas ağırlıklar üretecek ve ekzon seviyesi sayımlarını milyonda iki sayım veya logCPM günlüğe kaydedecek şekilde dönüştürecektir.Doğrusal modelleri her ekzonun ifade verilerine sığdırmak için lmfit işlevini çalıştırın. Ardından, diferansiyel ekzon ifadesini algılamak üzere takılan modelin ampirik tabanlı istatistiklerini hesaplamak için eBayes işlevini çalıştırın. İlgilenilen deneysel karşılaştırmalar için bir kontrast matrisi tanımlayın.Kontrastları kullanın. Her bir karşılaştırma çifti için katsayılar ve standart hatalar elde etmek için fit işlevi. Vahşi tip ve nakavt arasındaki genlerin ekzon kullanımındaki farklılıkları test etmek için takılı modelde diffSplice çalıştırın.T'ye eşit bir testin AS ekzonların sıralamasını verdiği ve simelere eşit testin genlerin bir sıralamasını verdiği topSplice işlevini kullanarak en üst sıradaki sonuçları keşfedin. Sonuçları çizmek için plotSplice işlevini çalıştırın. İlgilenilen geni gen kimliği argümanına koyarken, kırmızı noktalar farklı şekilde ifade edilen ekzonları gösterir.Farklı şekilde ifade edilen ekzonları sergilemek için EnhancedVolcano biyoiletken paketini kullanarak bir volkan grafiği oluşturun. rMATS'ı kullanmak için, rMATS sürüm 4.1.1'in en son sürümünün çalışma dizininde conda veya GitHub kullanılarak yüklendiğinden emin olun. Eşlemeden sonra elde edilen bam dosyalarını içeren klasöre gidin.Metin dosyalarını, bam dosyalarının adını ve virgülle ayrılmış yollarını kopyalamanın iki koşulu için rMATS'ın gerektirdiği şekilde hazırlayın. Ramas çalıştırın. py, bam dosyalarının yolunu ve ek açıklamayı açıklayan iki oluşturulan giriş metni dosyasını kullanarak.gtf dosyası daha önce elde edilmiştir. Bu, rmats_out her ekleme olayı için ayrı ayrı P değerleri ve ekleme düzeyleri dahil olmak üzere istatistikleri açıklayan metin dosyalarını içeren bir çıktı klasörü oluşturur. rMATS sonuçlarını keşfetmek için biyoiletken paket maserini kullanın.Kavşak ve ekzon sayma metin dosyalarını JCEC uzantısıyla maser nesnesine yükleyin ve sonucu kapsama alanına göre filtrelemek için ekleme olayı başına en az beş ortalama okuma ekleyin. rMATS sonuçlarını görselleştirmek için, önce maser paketinden topEvents işlevini çalıştırın, önemli ekleme olaylarını %10'luk yanlış bulma oranında ve PSI veya PSI içine eklenmiş yüzde olarak en az %10'luk bir değişiklikle seçin. İlgilenilen bireysel genler için gen olaylarını kontrol edin ve bu genin her bir ekleme olayı için PSI değerlerini çizin.Olay türünü belirterek bir volkan grafiği oluşturun. rmats2sashimiplot paketini kullanarak sashimi grafikleri oluşturmak için rMATS ile elde edilen ekleme olayları sonuçlarını metin dosyaları biçiminde kullanın. Sashimi komplosu, Wnk1 geninde atlanan bir ekzon olayını göstermektedir.Her satır bir RNA-seq örneğini, vahşi tipte üç kopyayı ve Mbnl1 nakavtını temsil eder. Yükseklik, RPKM cinsinden okuma kapsamını gösterir ve bağlantı yayları, ekzonlar boyunca kavşak okumalarını gösterir. Alt kısımda açıklamalı gen modeli alternatif izoformları gösterilmektedir.DiffSplice ve DEXSeq kullanılarak elde edilen volkan arazilerinin sol üst veya sağ kadranlarında bulunan genlerde önemli bir kıvrım değişimi ve gerçek farklılıkların güçlü istatistiksel kanıtları gözlemlenebilir. Bir kaset ekzonunun, Wnk1 geni için farklı koşullar arasında değiştiği bulundu. Diferansiyel ekzon kullanım grafiği, Wnk1.6.45 yakınlarındaki beş ekzon bölgesinde diferansiyel ekleme kanıtı gösterdi ve pembe renkle vurgulanan ekzonların vahşi tipe kıyasla Mbnl1 nakavt örneklerinde eklenmesi muhtemeldi.Alternatif olarak eklenen genlerin volkan grafiği, vahşi tipten dışlanan genler ile vahşi tipe dahil edilenler arasında ayrım yapılmasına yardımcı oldu. SE, A5SS, A3SS, MXE ve RI ekleme olaylarının türleri, bu olayların en önemli genlerinin sashimi grafikleri kullanılarak görselleştirildi. Genlerin üç ana çevrilmemiş bölgesindeki diferansiyel APA aktivitesi, volkan grafikleri kullanılarak gözlendi.Farklı işlem hatlarından elde edilen önemli ölçüde diferansiyel PA sahası kullanım sonuçları, olay grafiği kullanılarak görselleştirildi. Çift nakavtlarda PA bölgesi kullanımının önemli bir distal ila proksimal kayması hem FOSL1 hem de Papola genlerinde gözlenebilir. Genom çapında bilinen PA bölünme bölgelerine demirlenmiş yan bölgelerdeki ortalama kapsama alanı, tanısal bir grafik kullanılarak belirlendi.Transspesifik bilgiler ve çoklu örtüşmeye izin verme gibi parametrelerin sayım metrikleri oluşturulurken doğru kullanıldığından emin olun. Doğrusal modelin takılması ve kontrast çiftlerinin oluşturulması, doğru karşılaştırma için önemlidir. rMATS için, komutu çalıştırmadan önce tüm parametrelerin verilerinize göre doğru ayarlandığından emin olun.Diferansiyel ekleme aktivitesinden elde edilen genler, gen seti zenginleştirme analizi yapmak için kullanılabilir. MISO adı verilen başka bir araç, daha fazla olay tabanlı analiz için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Biology

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

RNA-seq Trombin-tedavi içinde Transcriptomes Analizi ve Kontrol İnsan Pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinde

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

Sivrisinek Gut Metagenomic RNA-seq Ribozomal RNA tükenmesi

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

İnsan Pluripotent için alternatif Kültürleri Hücre Üretim, Bakım ve Genetik Analizi Kök

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Epitel-Mezenkimal Geçiş sırasında alternatif birleştirme Algılama

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Asya Tiger Sivrisinek içinde Photoperiodic Diapause RNA-seq Analizler Deneysel ve Biyoinformatik Protokolü,<em&gt; Aedes albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Kimyasal Genetik Etkileşimleri Hızlı Kimlik<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Methods to Discover Alternative Promoter Usage and Transcriptional Regulation of Murine Bcrp1

Yöntemler Fare Bcrp1 Alternatif Promoter Kullanımı ve Transkripsiyonal Yönetmeliği Discover

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually ...

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Helianthus Annuus'ta Büyük Ölçekli Termal Görüntüleme Taraması ile Bitki Transpirasyonunun Yeni Regülatörlerinin Belirlenmesi

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq

RNA-seq Kullanarak Moleküler Evrimi ve Gen ekspresyonını Araştırmak için Biyoinformatik Boru Hattı

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus ...